鐘定福，胡麗瑜，陳丹，聶穎，張紅英

（金華市人民醫(yī)院，浙江 金華321000）

近年來，研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA UCA1在多種腫瘤中表達(dá)異常，可作為腫瘤標(biāo)記物或干預(yù)靶點[1]。UCA1在胃癌中異常表達(dá)且是臨床預(yù)后的獨立預(yù)測因子[2-3]，但具體機制尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)，UCA1可作為miR-204海綿吸附分子，通過競爭抑制miR-204重激活其靶基因，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性增殖、轉(zhuǎn)移等[4-6]。本文擬對UCA1調(diào)控miR-204在胃癌細(xì)胞增殖中的作用進(jìn)行研究，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）胃癌組織。選擇本院2016年6月-2019年6月經(jīng)手術(shù)及病理確診的10例胃癌組織標(biāo)本及癌旁組織，患者術(shù)前均未行化療或放療。（2）胃癌細(xì)胞株。MNK-45及SGC-7901購于美國標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)庫ATCC。細(xì)胞株貼壁培養(yǎng)于含10%胎牛血清（美國 GIBCO 公司， 貨號：G10099141）、100U/mL 青霉素及 100μg/mL鏈霉素（美國 Hyclone公司，貨號：SV30010）的DMEM培養(yǎng)液（美國Hyclone公司，貨號：SH30022.01B）。 （3）脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000（美國Invitrogen公司，貨號：L3000015）。 （4）CCK-8 細(xì)胞增殖試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司，貨號：40203ES76）。 （5）采用Trizol試劑（Invitrogen 公司，貨號：15596-026）提取細(xì)胞總RNA，RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA及實時熒光定量PCR。（6）采用 TB Green?Premix TaqTMII（TliRNaseHPlus）（大連寶生物，貨號：RR820A）進(jìn)行基因表達(dá)測定。 （7）miR-204在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)含量采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒TaqManTMMicroRNA Reverse Transcription Kit（Applied Biosystems LifeTechnologies公司，貨號：4366596），TaqManTMUniversalMasterMixII， withUNG （貨號：4440044）及miR-204 探針（Assay ID：000508）和 U6 Taqman 探針（AssayID：000425）。 （8）一抗購自美國 CST 公司：Ki-67（貨號：9449）、PCNA（貨號：13110）、CyclinD1（貨號：2978）、CyclinD2（貨號：3741）、β-actin（貨號：3700）。 （9）Luciferase熒光素報告系統(tǒng)采用雙熒光素試劑盒（Promega公司，貨號：E6110）。 （10）RIP 檢測試劑盒（廣州 BersinBio公司，貨號：Bes5101）。

1.2 方法

1.2.1 分組 設(shè)立兩個轉(zhuǎn)染組分析UCA1的生物學(xué)活性，分別為siRNA對照組和siUCA1敲減組，即轉(zhuǎn)染UCA1干擾siRNA，選擇敲減效率較高者進(jìn)行后續(xù)敲減實驗。設(shè)立4組轉(zhuǎn)染組觀察UCA1對miR-204活性的影響：（1）對照組：陰性miRNA模擬物對照+空載 pcDNA3.1 載體；（2）miR-204 過表達(dá)組：miR-204模擬物 （mimics）+空載 pcDNA3.1 載體；（3）UCA1 過表達(dá)組：UCA1過表達(dá)載體+陰性miRNA模擬物對照；（4）聯(lián)合組：miR-204mimics+UCA1 過表達(dá)載體。

1.2.2 miRNA 模擬物（mimics）、siRNA、過表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 miR-204 mimics及對照mimics、UCA1 siRNA（siUCA1-1，siUCA1-2 及對照 siRNA）均由上海吉瑪基因有限公司提供，其中UCA1的2條 siRNA靶序列分別為：siUCA1-1：GCCATATGAAGACACCCTA 和 siUCA1-2：TTAATCCAGGAGACAAAGA。UCA1及CCND2的cDNA合成及克隆至pcDNA3.1（+）中，將野生型及突變型CCND2的3’UTR克隆至psiCHECK-2熒光素報告質(zhì)粒中，均由上海吉瑪基因有限公司提供。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染按廠商說明書進(jìn)行。

1.2.3 CCK-8細(xì)胞增殖試驗 按1.2.1中siUCA1敲減組和siRNA對照組兩組胃癌細(xì)胞，miR-204過表達(dá)組、UCA1過表達(dá)組、聯(lián)合組以及對照組4組細(xì)胞進(jìn)行CCK-8細(xì)胞增殖活性比較。胃癌細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后以1×104細(xì)胞接種96孔板，加入CCK-8溶液（10μL/孔）繼續(xù)培養(yǎng)4小時。通過酶標(biāo)儀測量該樣品在450nm處的吸光光度值。

1.2.4 RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量 PCR采用Trizol試劑提取胃癌組織及1.2.1中分組細(xì)胞總RNA，對于UCA1及CCND2基因表達(dá)，RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA及實時熒光定量PCR采用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（TliRNaseH Plus）進(jìn)行。 UCA1 上游引物為 5′-TTACCTGGGGAACCCCGACC-3′，下游引物為 5′-TGGTGAAGGATGAGGGCTCGT-3′。CCND2上游引物為 5′-GTG CTGGGGAAGTTGAAGTG-3′， 下游引物為 5′-GGC AAACTTAAAGTCGGTGG-3′。內(nèi)參基因GAPDH上游引物為5’-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3’， 下游引物為 5’-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3’。擴增反應(yīng)條件均為 95℃，5 分鐘；95℃，30 秒，60℃，34 秒，35 個循環(huán)；72℃，5分鐘；反應(yīng)總體積20μL，其中cDNA 2μL，2×反應(yīng)液 10μL，上游引物（10μM）1μL，下游引物（10μM）1μL。 miR-204在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)含量采用TaqManTMMicroRNA Reverse Transcription Kit，TaqManTMUniversal Master Mix II，with UNG 及miR-204探針和內(nèi)參基因U6 Taqman探針，操作步驟按說明進(jìn)行。相對表達(dá)量采用2-△△Ct公式計算，其中△△Ct=（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）胃癌組織或處理組細(xì)胞-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）癌旁組織或?qū)φ占?xì)胞。

1.2.5 Western blotting試驗 收集1.2.1中各分組細(xì)胞，抽提總蛋白，利用BCA法測定總蛋白濃度，以每個泳道20μg的蛋白樣品上樣，經(jīng)10%變性SDS PAGE電泳后利用電轉(zhuǎn)化法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，置于5%脫脂奶粉室溫封閉2小時，加入一抗（Ki-67、PCNA、CyclinD1、CyclinD2、β-actin），4℃孵育過夜；次日二抗37℃孵育1小時；TBS-T洗膜3次，每次10分鐘，ECL發(fā)光試劑顯影。以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行比較。

1.2.6 Luciferase熒光素報告系統(tǒng) 胃癌細(xì)胞以每孔1×105細(xì)胞接種于6孔板中，次日轉(zhuǎn)染野生型或突變型CCND2-3′UTR的psiCHECK-2報告載體以及miR-204 mimics。培養(yǎng)48小時后通過雙熒光素試劑盒檢測熒光素活性。以對照組為100%計算各處理組的相對熒光素強度。

1.2.7 RNA免疫沉淀（RIP）實驗 采用RIP檢測試劑盒分析UCA1、miR-204與Ago2蛋白的結(jié)合情況。鑒于RIP實驗過程中存在非特異性吸附的干擾背景，利用IgG為陰性對照抗體，并將Ago2富集的UCA1及miR-204信號與IgG富集信號進(jìn)行比較。Input RNA為未用抗體沉淀的細(xì)胞總RNA量。實驗步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，利用上述1.2.4方法檢測UCA1及miR-204相對表達(dá)量。

1.3 觀察指標(biāo) 熒光定量PCR檢測胃癌組織及癌旁健康組織中UCA1及miR-204相對表達(dá)。Western blotting試驗檢測siUCA1敲減組及siRNA對照組細(xì)胞增殖標(biāo)記物Ki-67、PCNA、CyclinD1及CyclinD2的相對表達(dá)情況。Luciferase熒光素報告系統(tǒng)檢測野生型或突變型CCND2-3′UTR報告系統(tǒng)熒光素活性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。細(xì)胞實驗結(jié)果為正態(tài)分布的計量資料用（±s）描述，采用 t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 UCA1的表達(dá) 設(shè)癌旁正常組織中UCA1的表達(dá)倍數(shù)為1，熒光定量PCR檢測UCA1在胃癌組織及癌旁健康對照組織中的表達(dá)，UCA1在胃癌組織中相對癌旁對照組織的表達(dá)倍數(shù)為（2.779±2.218）（t=2.537，P＜0.05）。

2.2 UCA1對胃癌細(xì)胞的增殖作用 在UCA1的2條siRNA篩選中，siUCA1-1敲減效率高于siUCA1-2，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），詳見表 1、圖1，選擇siUCA1-1作為后續(xù)敲減實驗。CCK-8增殖實驗發(fā)現(xiàn)，UCA1敲減后MNK-45及SGC-7901細(xì)胞增殖活性與對照組細(xì)胞相比減低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），詳見表 2、圖 1。 Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖標(biāo)記物Ki-67、PCNA及Cyclin D1表達(dá)在各處理組細(xì)胞中均顯著下調(diào)（圖1）。

表1 UCA1 敲減率（±s）

表1 UCA1 敲減率（±s）

與siUCA-1-2組比較*P＜0.05

組別 MNK-45（%） SGC-7901（%）siUCA-1-1 69.67±5.51* 58.67±3.51*siUCA-1-2 23.33±9.61 10.00±5.00

表2 UCA1敲減后MNK-45及SGC-7901細(xì)胞增殖活性變化（OD450nm吸光度）（±s）

表2 UCA1敲減后MNK-45及SGC-7901細(xì)胞增殖活性變化（OD450nm吸光度）（±s）

與siRNA對照組比較**P＜0.01

S G C-7 9 0 1第1天 第2天 第3天 第4天 第1天 第2天 第3天 第4天s i R N A 對照組 0.2 0 6 7±0.0 2 9 8 0.3 6 8 0±0.0 1 6 6 0.7 4 9 5±0.0 4 6 3 1.2 4 5 0±0.1 2 0 8 0.2 1 1 8±0.0 2 2 7 0.4 0 0 3±0.0 3 4 5 0.8 1 7 5±0.0 9 3 3 1.4 6 5 0±0.1 0 3 0 U C A 1 敲減組 0.2 1 8 2±0.0 2 7 7 3 0.3 2 0 4±0.0 1 9 9**0.5 3 4 5±0.0 6 5 1**0.7 4 7 7±0.0 8 2 7**0.2 0 4 4±0.0 1 7 5 0.3 2 1 7±0.0 7 2 2**0.5 5 8 5±0.0 8 7 9**0.9 0 7 2±0.1 3 8 1**M N K-4 5組別

圖1 減低UCA1表達(dá)對胃癌細(xì)胞增殖活性的影響。1A：siUCA1-1 vs siUCA1-2，**P＜0.01敲減效率；1B：CCK-8檢測UCA1 敲減組與對照組（NC）細(xì)胞增殖活性（siUCA1-1vs NC，**P＜0.01，n=6）；1C：Western blotting 檢測細(xì)胞增殖標(biāo)記物Ki-67、PCNA及Cyclin D1的表達(dá)情況。

2.3 UCA1對miR-204的作用 在MNK-45及SGC-7901細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siUCA1后，miR-204較對照細(xì)胞相對表達(dá)倍數(shù)分別為（4.60±0.45）（t=13.61，P＜0.01）、（4.57±0.25）（t=24.55，P＜0.01）。CCK-8 增殖試驗表明，miR-204過表達(dá)組增殖活性弱于對照組（P＜0.01）；而UCA1過表達(dá)組細(xì)胞增殖活性強于對照組（P＜0.01）；差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。當(dāng)miR-204與UCA1聯(lián)合共轉(zhuǎn)染時，聯(lián)合組細(xì)胞增殖活性強于單純miR-204過表達(dá)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。 詳見表 3。

表3 UCA1及miR-204表達(dá)改變后細(xì)胞增殖活性變化（OD450nm 吸光度）（±s）

表3 UCA1及miR-204表達(dá)改變后細(xì)胞增殖活性變化（OD450nm 吸光度）（±s）

與對照組比較**P＜0.01；與miR-204過表達(dá)組比較△△P＜0.01

組別 MNK-45 SGC-7901對照組 0.7405±0.0333 0.8577±0.0461 miR-204 過表達(dá)組 0.4480±0.0454** 0.5475±0.0439**UCA1 過表達(dá)組 1.322±0.1273** 1.469±0.1291**聯(lián)合組 1.029±0.1758△ 1.062±0.1221**△△

2.4 RIP試驗 Ago2在胃癌細(xì)胞MNK-45和SGC-7901細(xì)胞中結(jié)合UCA1和miR-204相對含量高于IgG免疫沉淀組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。 詳見表 4。

表4 細(xì)胞株MNK-45和SGC-7901中Ago2結(jié)合UCA1及miR-204的相對富集含量（±s）

表4 細(xì)胞株MNK-45和SGC-7901中Ago2結(jié)合UCA1及miR-204的相對富集含量（±s）

與IgG免疫沉淀組比較**P＜0.01

組別M N K-4 5 S G C-7 9 0 1 U C A 1 m i R-2 0 4 U C A 1 m i R-2 0 4 I g G 免疫沉淀組 1.5 3 3±0.2 5 1 7 2.4 0 0±0.4 5 8 3 1.1 6 7±0.3 5 1 2 2.7 3 3±0.3 2 1 5 A g o 2 免疫沉淀組 8.4 3 3±0.9 5 0 4** 6.9 3 3±0.5 1 3 2** 8.3 3 3±1.0 6 9** 7.6 3 3±0.4 1 6 3**

2.5 miR-204抑癌作用的路徑 利用Targetscan軟件發(fā)現(xiàn)，CCND2的3’UTR存在miR-204潛在結(jié)合位點（圖3A）。miR-204過表達(dá)組細(xì)胞CCND2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平（圖3B）和蛋白水平顯著下調(diào)（圖3C）。將含有野生型及突變型miR-204結(jié)合位點的CCND2-3’UTR克隆至psiCHECK2熒光素報告載體中，并轉(zhuǎn)染入胃癌細(xì)胞中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-204過表達(dá)組細(xì)胞野生型CCND2-3’UTR熒光素活性低于對照組細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），而miR-204過表達(dá)組細(xì)胞中突變型熒光素活性與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖3D），表明miR-204可以體外結(jié)合并抑制CCND2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

圖2 Ago2結(jié)合UCA1及miR-204的相對富集含量

圖3 miR-204在胃癌細(xì)胞中靶向調(diào)控CCND2。3A：野生型或突變型CCND2-3’UTR結(jié)合序列示意圖；3B：CCND2的mRNA 表達(dá)變化（miR-204 過表達(dá)組 vs對照組，**P＜0.01，n=3）；3C：CCND2 的蛋白表達(dá)變化；3D：野生型或突變型熒光素報告載體的熒光強度變化（轉(zhuǎn)染組細(xì)胞vs對照細(xì)胞，**P＜0.01，n=3）。

2.6 UCA1過表達(dá)對miR-204調(diào)控CCND2的影響miR-204過表達(dá)組CCND2表達(dá)顯著低于對照組（t=10.92，P＜0.01），為對照組的（0.5267±0.0751）倍。UCA1過表達(dá)組CCND2表達(dá)顯著高于對照組（t=7.894，P＜0.01），為對照組（2.253±0.2750）倍。 UCA1 和 miR-204 mimics聯(lián)合處理細(xì)胞后，CCND2的表達(dá)變化為對照組的（1.220±0.2352）倍（t=1.620，P＞0.05）。

3 討論

盡管長鏈非編碼RNA最初被認(rèn)為是 “轉(zhuǎn)錄噪音”，越來越多的證據(jù)表明，lncRNA在染色質(zhì)重塑、細(xì)胞增殖與凋亡、細(xì)胞分化等細(xì)胞生物學(xué)過程中起到了重要作用[7-8]。近年來發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA UCA1在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。UCA1不僅在胃癌組織中異常表達(dá)，其表達(dá)水平與預(yù)后呈正相關(guān)，且UCA1對胃癌細(xì)胞增殖凋亡、轉(zhuǎn)移和侵襲等生物學(xué)行為也起到了促進(jìn)作用[9-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，UCA1在胃癌中可以通過抑制miR-204活性、上調(diào)miR-204靶基因CCND2來促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖，為UCA1介導(dǎo)的致病機制提供了新的實驗室證據(jù)。

Cyclin D蛋白屬于細(xì)胞周期素（Cyclin D），在G1中晚期表達(dá)最高，而在S期表達(dá)最低，提示其表達(dá)增高與細(xì)胞增殖有著密切關(guān)系。Cyclin D蛋白有3 種亞型：Cyclin D1（CCND1），Cyclin D2（CCND2），Cyclin D3（CCND3），分布在不同染色體中，但具有獨特的Cyclin box和PEST序列[13]。CCND1為目前報道最為廣泛的細(xì)胞周期素。研究發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1在多種腫瘤中有DNA擴增現(xiàn)象，已作為腫瘤增殖標(biāo)記物或干預(yù)靶點[14-15]。CCND2在腫瘤中也存在表達(dá)上調(diào)，但與CCND1不同，CCND2并未發(fā)現(xiàn)其過表達(dá)與DNA擴增有關(guān)，提示其表達(dá)可能與其他調(diào)控機制有關(guān)[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌中UCA1可通過抑制miR-204對CCND2表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，從轉(zhuǎn)錄水平上揭示CCND2表達(dá)調(diào)控異常的一種分子機制。CCND2在胃癌中表達(dá)上調(diào)，高水平CCND2與胃癌患者總體生存率呈負(fù)相關(guān)[18]。本研究同時發(fā)現(xiàn)，在胃癌MNK-45中過表達(dá)CCND2可顯著增加細(xì)胞增殖活性水平，同時也提示UCA1促胃癌增殖功能可能一部分是通過調(diào)控CCND2實現(xiàn)的。

長鏈非編碼RNA作為miRNA的競爭RNA（ceRNA）被廣泛報道。本研究發(fā)現(xiàn)，UCA1可以作為miR-204的海綿吸附競爭分子，重激活CCND2表達(dá)。在胃癌細(xì)胞中敲減UCA1后，miR-204表達(dá)升高；提高miR-204水平后，顯著抑制胃癌細(xì)胞MNK-45及SGC-7901的生物學(xué)活性，而同時過表達(dá)UCA1，細(xì)胞增殖活性與對照組無顯著差異，表明miR-204的抑制活性被中和，UCA1對miR-204活性有抑制作用。分子水平上，胃癌細(xì)胞中敲減UCA1后miR-204表達(dá)升高。同時，RIP實驗發(fā)現(xiàn)，Ago2蛋白可顯著富集UCA1及miR-204。Ago2為長鏈非編碼RNA海綿吸附miRNA，并調(diào)控其活性的主要蛋白。上述結(jié)果提示，UCA1可能與miR-204直接結(jié)合Ago2蛋白，并通過Ago2蛋白抑制miR-204活性。CCND2熒光素報告系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，CCND2為miR-204調(diào)控靶基因，而在胃癌細(xì)胞中過表達(dá)UCA1可以上調(diào)CCND2表達(dá)水平。結(jié)合UCA1對miR-204抑制作用的數(shù)據(jù)推測，UCA1極有可能通過海綿吸附作用來抑制miR-204，而活化CCND2表達(dá)。

綜上所述，UCA1具有促胃癌細(xì)胞增殖的功能，其促進(jìn)作用與抑制miR-204并上調(diào)其靶基因CCND2表達(dá)有關(guān)。本研究豐富了長鏈非編碼RNA UCA1在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機制，為胃癌精準(zhǔn)干預(yù)提供了潛在靶點。