周晟

（紹興第二醫(yī)院，浙江 紹興 312000）

成纖維細胞對于創(chuàng)傷愈合具有關(guān)鍵性的作用，對于結(jié)締組織的完整性有一定的維持作用，能夠生成和重塑細胞外基質(zhì)（ECM）[1-2]。miRNA作為單鏈小RNA能通過堿基配對同靶基因互補，調(diào)控基因表達，在機體或細胞的生理病理上具有重要的參與作用[3-4]。miR-21作為其中的一種，與纖維化病變中的信號通路相關(guān)[5]，現(xiàn)探討其對瘢痕成纖維細胞增殖和凋亡的機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇2019年4-12月本院收治的增生性瘢痕患者，取其正常皮膚成纖維細胞GM0639和增生性瘢痕成纖維細胞（hypertrophic scar fibroblasts，HSF）；其余材料為：Lipofectamine2000 試劑盒（上海蔚霆生物，批號：SU2020）、胎牛血清（依萊薩生物，批號：12676-029）、DMEM 培養(yǎng)液（上海杰美基因醫(yī)藥，批號：GMS12052.3）、磷酸鹽緩沖液（上海澤葉生物，批號：2505027）、0.25%胰蛋白酶（廣州市達輝生物，批號：25200056）、BCA蛋白定量檢測試劑盒（上?？道噬?，批號：KL80816-500）、二甲基亞砜（蘇州聯(lián)雄精細化工科技，批號：67-68-5）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 在DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）恒溫培養(yǎng)箱（37℃、5% CO2）中培養(yǎng) HSF，兩天更換一次培養(yǎng)液，3-5天時用胰蛋白酶（0.25%）消化傳代，當(dāng)其培養(yǎng)至3-5代且處于對數(shù)生長期時收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染與分組 將培養(yǎng)的HSF細胞分為空白對照組 （無轉(zhuǎn)染）、miR-21 mimic組 （轉(zhuǎn)染miR-21質(zhì)粒的HSF細胞）、miR-21 inhibitor組（轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑的HSF細胞）以及陰性對照組（轉(zhuǎn)染非特異性siRNA），培養(yǎng)至70%～80%融合度時接種細胞瓶中按照Li-pofectamineTM2000試劑說明書對其轉(zhuǎn)染，2天后倒掉細胞培養(yǎng)液并以PBS清洗細胞，使用20μL細胞裂解液裂解細胞。

1.2.3 miR-21表達 采用RT-PCR檢測miR-21的表達。通過Trizol法對細胞總RNA進行提取，純化定量后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟合成cDNA，再以RT-PCR試劑盒的步驟測定miR-21表達，以U6為內(nèi)參，通過2-△△Ct公式分析表達情況。

1.2.4 NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的表達 采用蛋白質(zhì)印跡（WB）檢測NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的表達。將上述裂解細胞離心（-4℃，20分鐘，1500g），收集上清液，通過SDS-PAGE電泳蛋白分離，而后轉(zhuǎn)PVDF膜，加入一抗（1:500）室溫下孵育一夜、TBS洗滌后加入二抗（1:3000）孵育1小時，加入顯色劑，將β-actin作為內(nèi)參，最終通過凝膠成像系統(tǒng)檢測并分析相關(guān)蛋白。

1.2.5 細胞增殖檢測 采用MTT法檢測細胞增殖情況。接種細胞至24孔板，每孔2×104個細胞，培養(yǎng)72 小時，再將各孔加入 MTT 溶液（pH 7.4， 20μL），37℃下孵育4小時，棄上清液，加入二甲基亞砜（DMSO，150μL），振蕩 10 分鐘反應(yīng)，藍紫色結(jié)晶溶解后對A570進行檢測，即細胞的增殖活性，重復(fù)3次。

1.2.6 細胞凋亡檢測 將上述裂解細胞以1500g的條件離心10分鐘，收集細胞，以PBS（2mL）重懸并洗滌細胞3次，沉淀懸浮細胞（Binding Buffer 400μL）后，加入 Annexin V-FITC（5μL）、PI（5μL）溶液，置于室溫下反應(yīng)15分鐘后，以流式細胞儀測定細胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 24.0軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以（±s）表示，多組間采用F檢驗；計數(shù)資料以百分率表示，采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 miR-21的表達 RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，miR-21的表達在HSF細胞中 （1.49±0.11）較正常成纖維細胞（1.01±0.04）高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），詳見圖 1。

圖1 正常成纖維細胞與HSF細胞中miR-21的表達情況

2.2 NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的表達 陰性對照組中 NF-κBp65、IKK、Bax、Caspase-3 的表達與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），miR-21 inhibitor 組中 NF-κB p65、IKK 的表達降低，Bax、Caspase-3的表達上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；miR-21 mimic組中 NF-κB p65、IKK 的表達較高，Bax、Caspase-3的表達較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 詳見表 1、圖 2。

表1 各組NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的表達（±s）

表1 各組NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的表達（±s）

與空白對照組比較*P＜0.05

組別 n NF-κB p65 IKK Bax Caspase-3空白對照組 24 5.37±1.01 6.45±1.06 5.58±0.07 4.40±1.00陰性對照組 24 5.41±0.09 6.37±1.07 5.73±0.08 4.38±0.08 miR-21 inhibitor組24 2.23±0.05*3.33±0.04*7.88±1.69*6.69±1.22*miR-21 mimic 組 24 10.44±2.51*11.67±2.72*3.34±0.06*2.12±0.02*

圖2 WB檢測各組NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的表達

2.3 細胞增殖情況 陰性對照組與空白對照組增殖情況差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而miR-21 mimic組則有所上升，miR-21 inhibitor組的增殖能力有所下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表 2、圖 3。

表2 各組不同時間細胞的增殖情況（±s）

表2 各組不同時間細胞的增殖情況（±s）

與空白對照組比較*P＜0.05.

組別 n A 5 7 0值2 4小時 3 6小時 4 8小時 7 2小時空白對照組 2 4 0.1 9±0.0 2 0.2 4±0.0 4 0.3 5±0.0 2 0.4 1±0.0 4陰性對照組 2 4 0.2 0±0.0 1 0.2 4±0.0 3 0.3 5±0.0 1 0.4 1±0.0 3 m i R-2 1 i n h i b i t o r組 2 4 0.1 9±0.0 1*0.2 1±0.0 1*0.3 0±0.0 1*0.3 6±0.0 2*m i R-2 1 m i m i c 組 2 4 0.2 0±0.0 2*0.2 6±0.0 6*0.3 9±0.0 4*0.5 5±0.0 5*

圖3 各組細胞的增殖情況

2.4 細胞凋亡情況 陰性對照組的凋亡能力與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），miR-21mimic組的凋亡能力較低，miR-21 inhibitor組的凋亡能力較高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 詳見圖 4、表 3。

表3 各組細胞凋亡率比較（±s）

表3 各組細胞凋亡率比較（±s）

與空白對照組比較*P＜0.05.

組別 n 細胞凋亡率（%）空白對照組 24 15.87±6.33陰性對照組 24 15.86±6.34 miR-21 inhibitor組 24 60.11±8.30*miR-21 mimic 組 24 3.22±1.67*

圖4 各組細胞凋亡情況

2.5 相關(guān)性分析 miR-21與NF-κB p65、IKK呈正相關(guān)（r=0.691、r=0.604，P＜0.05），與 Bax、Caspase-3 呈負相關(guān)（r=-0.597、r=-0.625，P＜0.05）。 詳見表 4。

表4 miR-21與NF-κB信號通路中相關(guān)蛋白的相關(guān)性分析

3 討論

作為機體對創(chuàng)傷產(chǎn)生非正常愈合反應(yīng)的一種結(jié)果，瘢痕具有ECM過度沉積、成纖維細胞大量增殖且排列紊亂等病理特征[6]，與免疫異常、膠原的合成降解紊亂等可能有關(guān)[11]。由于其形成的機制復(fù)雜且影響因素廣泛，無法針對性治療[7]，又由于成纖維細胞在瘢痕的形成過程中具有重要的參與作用[8]，因而對其增殖及凋亡的探討非常重要。

miRNAs是長度約23nt的一種非編碼小RNA，具有高度的保守性[9]，可在與靶基因的完全結(jié)合或不完全結(jié)合的情況下對其翻譯加以降解或阻撓，從而調(diào)控細胞或機體的生物學(xué)功能，參與腫瘤的一系列病理過程[11]。miR-21在非小細胞肺癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、宮頸癌等多種癌癥中均有異常表達且參與作用[11-12]。NF-κB信號通路對于正常細胞的增殖凋亡、機體免疫等活動有一定的參與作用[13]，是一種核轉(zhuǎn)錄因子，由p50和p65組成，對細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)具有重要的介導(dǎo)作用，能夠特異性結(jié)合細胞粘附分子及其生長分化所需的細胞因子，從而對有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄及表達產(chǎn)生作用[14]。

本研究對miR-21在調(diào)控NF-κB信號通路的基礎(chǔ)上影響瘢痕成纖維細胞生命活動的相關(guān)機制進行研究，作者選擇正常人皮膚成纖維細胞GM0639以及HSF細胞，培養(yǎng)HSF細胞后分為空白對照組、陰性對照組、miR-21 mimic組以及miR-21 inhibitor組。并對其進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后RT-PCR檢測結(jié)果顯示，HSF中miR-21的表達較正常成纖維細胞較高（P＜0.05），提示瘢痕癥狀后 miR-21 表達上升，通過WB 檢測發(fā)現(xiàn)，陰性對照組中 NF-κB p65、IKK、Bax、Caspase-3的表達與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），miR-21 inhibitor組中 NF-κB p65、IKK的表達較對照組降低，Bax、Caspase-3的表達有所上升（P＜0.05）；miR-21 mimic 組中 NF-κB p65、IKK 的表達較高，Bax、Caspase-3 的表達較低（P＜0.05）， 提示 miR-21 可能會提高NF-κB p65、IKK 的表達，降低Bax、Caspase-3的表達。通過MTT檢測，轉(zhuǎn)染miR-21后成纖維細胞增殖能力上升，轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑后增殖能力下降。流式細胞術(shù)檢測提示，陰性對照組的凋亡能力與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），miR-21 mimic 組凋亡能力較低，miR-21 inhibitor組凋亡能力較高，提示miR-21會抑制瘢痕成纖維細胞的凋亡能力。最后，通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，miR-21與 NF-κB p65、IKK 呈正相關(guān)，與 Bax、Caspase-3 呈負相關(guān)（均 P＜0.05），提示miR-21對NF-κB信號通路可能具有一定的影響。

綜上，miR-21能夠促進瘢痕成纖維細胞的增殖能力，降低瘢痕成纖維細胞的凋亡能力，可能是通過升高NF-κB信號通路中NF-κB p65、IKK的表達、降低NF-κB信號通路中Bax、Caspase-3的表達完成。