王樹寧，宋照軍，黃瀅潔，趙功玲，梁新紅，劉本國

（河南科技學院食品學院，河南新鄉(xiāng)453003）

側柏葉是柏科植物側柏的干燥嫩枝梢及葉，具有涼血止血，生發(fā)烏發(fā)，祛風降濕，化痰止咳，消腫散毒的功效[1-2]。側柏葉中含有多種活性物質，主要是類黃酮、揮發(fā)油以及鞣質等，其中黃酮類的含量較為豐富[3-4]，且被認為是主要功能成分之一，其功效已引起許多科研工作者的關注[5-7]?，F代藥理學證明，黃酮具有抑菌消炎、抗腫瘤、抗氧化、止血以及生發(fā)烏發(fā)等作用[8-12]。

近年來關于側柏葉的研究主要集中在黃酮類的檢測及應用，研究證實側柏葉中黃酮的主要成分為蘆丁、槲皮素、楊梅素及穗花杉雙黃酮等[13-15]。目前國內廣泛采用溶劑法提取側柏葉中的活性成分[16-17]，但操作繁瑣、耗時耗能、提取率低。超聲波輔助提取技術具有高效、穩(wěn)定、節(jié)能等優(yōu)點，與傳統(tǒng)的提取方法相比，提取時間短，提取效率高，深受人們歡迎[18]。本試驗通過超聲波對側柏葉進行處理，通過單因素試驗考察超聲波時間、超聲波溫度以及超聲波頻率對黃酮得率的影響，采用響應面法優(yōu)化最佳提取工藝，為工業(yè)化生產黃酮類化合物提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

側柏葉：安徽亳州惠民中藥材批發(fā)商行；蘆丁標準品（純度＞99%）：北京世紀奧科生物技術有限公司；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉（均為國產分析純）：山東西亞化學工業(yè)有限公司。

1.2 儀器設備

KQ-100DB 型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；FA224 型電子天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；720 型分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 側柏葉干粉的制備

清洗、晾干側柏葉，放置于60 ℃的烘箱中烘干4 h，用粉碎儀粉碎，過60 目篩，備用。

1.3.2 標準曲線的繪制

用蘆丁作標準品[19]，采50 %的乙醇配制濃度為0.2 mg/mL 的蘆丁標準品溶液。吸取蘆丁標準品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，于 25 mL 的比色管中，各加入5%的亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，再各加10%的硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，加1 mol/L 的氫氧化鈉10 mL，加50%乙醇至刻度，搖勻，放置10 min，于510 nm 下測定吸光度，繪制標準曲線，并計算回歸方程。

1.3.3 樣品中黃酮的提取及測定

稱取側柏葉干粉1 g，加入50%的乙醇溶液20 mL。利用超聲波輔助提取黃酮，過濾提取液，濾渣再加入50%的乙醇20 mL 再提取一次，合并濾液，記錄總體積數，為樣品溶液。取樣品溶液5 mL，置于25 mL 的比色管中，按1.3.2 中方法操作，測定樣品中黃酮含量，按公式（1）所示計算黃酮得率。

式中：C 為依據回歸方程計算的樣品中黃酮含量，（mg/mL）；5 為為測定用樣品濾液體積，mL；V 為樣品濾液總體積，mL；M 為為側柏葉質量，g。

1.4 單因素試驗設計

1.4.1 超聲波時間對黃酮得率的影響

稱取7 份1 g 的側柏葉干粉，加入50%的乙醇溶液20 mL，在超聲波溫度60 ℃，超聲波頻率50 kHz，分別超聲波處理 10、20、30、40、50、60、70 min，提取黃酮，考察不同超聲波時間對黃酮得率的影響。每個試驗重復3 次。

1.4.2 超聲波溫度對黃酮得率的影響

稱取7 份1 g 的側柏葉干粉，加入50%的乙醇溶液20 mL，固定超聲波時間50 min，超聲波頻率50 kHz，分別在 20、30、40、50、60、70、80 ℃超聲波下提取黃酮，考察不同超聲波溫度對黃酮得率的影響。每個試驗重復3 次。

1.4.3 超聲波頻率對黃酮得率的影響

稱取7 份1 g 的側柏葉干粉，加入50%的乙醇溶液 20 mL，設置超聲波頻率 7 個水平：20、30、40、50、60、70、80 kHz，固定超聲波時間 50 min，超聲波溫度60 ℃，考察不同超聲波頻率對黃酮得率的影響。每個試驗重復3 次。

1.5 響應面試驗設計

根據單因素試驗結果，設計三因素三水平的響應面試驗，以黃酮得率為響應值，確定超聲波法提取側柏葉黃酮的最佳工藝條件，如表1 所示。

表1 響應面試驗設計因素與水平Table 1 Design factors and level of response surface test

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線

以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得到標準曲線，如圖1 所示。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Rutin standard curve

式中：A 為吸光度；C 為蘆丁的濃度，（μg/mL）。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 超聲波時間對黃酮得率的影響

超聲波時間對黃酮得率的影響見圖2。

圖2 超聲波時間對黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on the yield of flavonoids

由圖2 可知，隨超聲時間的延長，黃酮得率逐漸上升，在50min 時達到最大值，其值為（25.830±0.065）mg/g，隨著時間繼續(xù)增加，黃酮得率下降，超聲處理時間為70 min 時，黃酮得率下降至（24.220±0.065）mg/g。超聲時間過短，植物細胞破碎不完全，造成提取的黃酮得率低；超聲時間過長，產生的熱效應可能造成黃酮的氧化，從而使黃酮得率降低。因此，選擇超聲波時間為50 min 比較合適。

2.2.2 超聲波溫度對黃酮得率的影響

超聲波溫度對黃酮得率的影響見圖3。

圖3 超聲波溫度對黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the yield of flavonoids

由圖3 可知，在超聲溫度為20 ℃～60 ℃時，黃酮得率逐漸上升，在60 ℃達到最大值，其值為（26.300±0.024）mg/g，隨著超聲溫度繼續(xù)升高，黃酮得率下降，超聲溫度為80 ℃時，黃酮得率下降至（24.160±0.035）mg/g。可能原因是超聲波溫度過低，分子熱運動慢，不利于黃酮的溶出；溫度過高，黃酮易分解，造成得率降低。因此，選擇超聲波溫度為60 ℃比較合適。

2.2.3 超聲波頻率對黃酮得率的影響

超聲波頻率對黃酮得率的影響見圖4。

圖4 超聲波頻率對黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic frequency on the yield of flavonoids

由圖4 可知，在超聲頻率為 20 kHz～50 kHz 時，黃酮得率逐漸上升，在50 kHz 時達到最大值，其值為（26.081±0.073）mg/g，隨著超聲頻率繼續(xù)增加，黃酮得率下降，超聲頻率為80 kHz 時，黃酮得率下降至（20.412±0.035）mg/g。因此，選擇超聲波頻率為50 kHz比較合適。

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 分響應面析方案與試驗結果

按照表1 設計進行響應面試驗，分析方案與試驗結果見表2。

表2 響應面分析方案與試驗結果Table 2 Response surface analysis scheme and test results

2.3.2 回歸方程的建立及顯著性分析

根據響應面試驗結果，采用ANOVA 對表2 中的數據進行多元二次回歸，得到黃酮得率（Y）與超聲波時間（A）、超聲波溫度（B）、超聲波頻率（C）之間的二次多項回歸方程為：

Y=-32.033 25+1.810 62A+0.412 48B+0.038 250C+1.450 00×10-3AB-6.375 00×10-3AC+4.625 00×10-3BC-0.016 105A2-5.622 00×10-3B2-2.800 00×10-4C2?；貧w模型方差分析見表3。

表3 為回歸方程的方差分析表，由方差分析結果可知，該回歸方程模型極顯著（P＜0.01），失擬項P 值為0.127 4＞0.05，失擬性差異不顯著。B、AC、A2、B2對側柏葉黃酮得率的影響極顯著（P＜0.01），A、C、BC 對側柏葉黃酮得率的影響顯著（P＜0.05），AB、C2對側柏葉黃酮得率的影響不顯著（P＞0.05），各因素對黃酮得率的影響依次是B（超聲波溫度）＞A（超聲波時間）＞C（超聲波頻率）。相關系數R2為0.967，變異系數為1.180%，表明試驗數據較可靠，該模型擬合度較高，可以用于超聲波法提取側柏葉中總黃酮的理論預測。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

2.3.3 響應面分析

響應值與各試驗因素，及各因素交互作用構成的等高線和響應面見圖5、圖6、圖7，考察超聲波時間、超聲波溫度、超聲波頻率中任意一個因素水平在零時，其他兩個因素的交互作用對黃酮得率的影響。圖5為超聲波頻率為50 kHz 時，超聲波時間和超聲波溫度對黃酮得率的影響。

由圖5 可以看出，在超聲波時間一定時，黃酮得率隨超聲波溫度先增大然后趨于平緩；在超聲波溫度一定時，黃酮得率隨超聲波時間先增大后降低。等高線接近圓形，且響應面坡度較小，表明超聲波時間和超聲波溫度的交互作用不顯著，這與回歸方程方差分析的結果相符。圖6 為超聲波溫度為60 ℃時，超聲波時間和超聲頻率度對黃酮得率的影響。

圖5 超聲波時間和超聲波溫度對黃酮得率的等高線和響應面圖Fig.5 Contour and response surface of ultrasonic time and temperature to flavonoid yield

圖6 超聲波時間和超聲波頻率對黃酮得率的等高線和響應面圖Fig.6 Contour and response surface of ultrasonic time and frequency to flavonoid yield

由圖6 可以看出，在超聲波時間一定時，黃酮得率隨超聲波頻率先增大后趨于平緩；在超聲波頻率一定時，黃酮得率隨超聲波時間先增大后降低。等高線密集，且接近橢圓形，響應面坡度較陡峭，說明超聲波時間和超聲波頻率的交互作用極顯著。圖7 為超聲波時間為50 min 時，超聲波溫度和超聲波頻率對黃酮得率的影響。

圖7 超聲波溫度和超聲波頻率對黃酮得率的等高線和響應面圖Fig.7 Contour and response surface of ultrasonic temperature and frequency to flavonoid yield

由圖7 可以看出，在超聲波溫度一定時，黃酮得率隨超聲波頻率先增大后降低；在超聲波頻率一定時，黃酮得率隨超聲波溫度的增大而降低。等高線密集且響應面坡度陡峭，說明超聲波溫度和超聲波頻率的交互作用顯著。

2.3.4 最佳工藝條件的確定及驗證試驗

根據所得到的回歸模型，預測得到超聲波法輔助提取側柏葉中黃酮的最佳工藝條件為：超聲波時間50.98 min、超聲波溫度59.38 ℃、超聲波頻率40 kHz，此時側柏葉總黃酮理論得率可達26.430 mg/g。結合實際情況將最佳工藝條件修改為：超聲波時間51 min、超聲波60 ℃、超聲波頻率40 kHz，并在此條件下進行3次驗證試驗，結果側柏葉總黃酮平均得率（26.350±0.065）mg/g，實際值與理論值26.430 mg/g 的誤差僅為0.08%，證明了該試驗模型合理，優(yōu)化的提取工藝切實可行，適用于側柏葉總黃酮的提取。

3 結論

本試驗采用超聲波法輔助提取側柏葉總黃酮，通過單因素試驗，考察超聲波時間、超聲波溫度、超聲波頻率對黃酮得率的影響，并通過響應面法優(yōu)化提取工藝。通過回歸模型預測得到超聲波法輔助提取側柏葉中黃酮的最佳工藝條件為：超聲波時間51 min、超聲波溫度60 ℃、超聲波頻率40 kHz，此時黃酮得率為（26.350±0.065）mg/g，優(yōu)化得到的工藝合理可行，為側柏葉黃酮的充分提取以及應用提供了理論依據，同時也為超聲波法輔助提取其他中草藥活性物質提供了新思路。