閔貝貝 朱莉 曾娟

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）作為常見消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率均位居我國所有惡性腫瘤的第5 位，疾病負(fù)擔(dān)相當(dāng)嚴(yán)重［1］。近年來，隨著外科手術(shù)、放化療、分子靶向治療及免疫治療的不斷進(jìn)步，從一定程度改善了患者的治療效果，但CRC 的整體預(yù)后仍不能令人滿意［2］。研究［2-4］表明，對患者進(jìn)行預(yù)后分層，制定個體化的治療策略，可有效改善患者的臨床結(jié)局。最近，外泌體作為腫瘤分子標(biāo)志物的潛力逐漸受到重視。作為一種直徑約為30 ～150 nm 的微小膜泡，其內(nèi)包裹有miRNAs，lncRNA 和蛋白質(zhì)等多種生物活性因子，廣泛參與腫瘤惡性進(jìn)程［5-7］。研究證實，外泌體“獨特”的被膜結(jié)構(gòu)，可保護(hù)內(nèi)含物不受膜外微環(huán)境中各種因子的影響而處于較穩(wěn)定的狀態(tài)［8］。鑒于上述優(yōu)點，血漿外泌體中miRNAs 的檢測已成為一種新興、可靠的生物標(biāo)志物用于協(xié)助腫瘤的早期診斷和預(yù)后評估［9-10］。miRNA-23b（miR-23b）作為一個微小非編碼RNA，已被證實在CRC 的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移中扮演著重要角色［11-15］。然而，關(guān)于其在血漿外泌體中的表達(dá)及其臨床預(yù)后價值尚無報道?；诖耍狙芯繑M檢測miR-23b 在CRC 患者血漿外泌體中的表達(dá)水平，并分析其與患者臨床病理學(xué)特征和預(yù)后的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2014年1月至2014年12月于武漢市中心醫(yī)院接受手術(shù)治療的CRC 患者為研究對象，其中，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）所有病例均經(jīng)組織病理學(xué)確診為結(jié)直腸癌；（2）術(shù)前未接受過任何抗腫瘤治療；（3）具有完整的臨床病理資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）伴隨有其他惡性腫瘤；（2）未行根治性手術(shù)；（3）感染或妊娠。入院后采集3 mL外周靜脈血樣本于抗凝管中，并收集同期25例健康體檢者的3 mL血樣本作為對照?？偣?5例CRC 患者納入本研究，患者的所有臨床病理信息從電子病歷系統(tǒng)中進(jìn)行采集。兩組人群的一般資料對比見表1，結(jié)果顯示，各組基線資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），具有可比性。在納入的腫瘤患者中，男36例，女29例，年齡為36 ～74 歲，平均（61.8 ±7.8）歲；術(shù)后腫瘤分期按照AJCC/UICC 第7 版TNM分期系統(tǒng)進(jìn)行，其中Ⅰ期5例，Ⅱ期27例，Ⅲ期33例，納入患者的具體臨床病理特征見表2。本研究獲得武漢市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)，所有患者和家屬均簽署知情同意書。

表1 兩組患者的基線資料比較Tab.1 Comparison of baseline data between two groups例

1.2 方法

1.2.1 血漿外泌體的提取和鑒定采用ExoQuick Exosome Precipitation Solution（System Biosciences，CA，USA）試劑盒提取血漿中的外泌體。簡要步驟如下：取500 μL 血清樣本，加入126 μL 上述試劑，上下顛倒混勻，4 ℃孵育30 min 后于室溫下1 500g離心30 min，小心去除上清液，加入200 μL PBS 緩沖液重懸，即獲得血漿外泌體懸液。為了鑒定從血漿中提取的外泌體，首先采用透射電子顯微鏡（TEM）對外泌體的形態(tài)進(jìn)行鑒定；然后利用Western Blot 檢測外泌體相關(guān)標(biāo)志物（CD63，TSG101）的表達(dá)情況（以calnexin 為內(nèi)參，其作為表達(dá)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一種整合蛋白，在外泌體中不表達(dá)）；此外，使用NanoSight LM10（Malvern Instruments Inc.，UK）對外泌體的直徑和密度進(jìn)行分析，具體操作步驟參照說明書進(jìn)行。

1.2.2 血漿外泌體中RNA 的提取使用miRNeasy serum/plasma micro kit（Qiagen，CA，USA）進(jìn)行血漿外泌體中RNA 的提取，所有步驟均在生物安全柜中進(jìn)行，并在冰上進(jìn)行操作，以預(yù)防RNA 降解導(dǎo)致提取的RNA 總量降低。參照既往文獻(xiàn)報道方法［16-17］，通過在每個血清樣本中添加25 fmol 的celmiRNA-39（Applied Biosystems，CA，USA）試劑進(jìn)行均一化，以降低RNA 提取過程中樣品變異問題對最終檢測結(jié)果的影響。上述具體操作參照說明書進(jìn)行。

1.2.3 RT-qPCR 檢測血漿外泌體中miR-23b 的表達(dá)水平采用TaqMan miRNA assays（Applied Biosystems，USA）試劑盒檢測血漿外泌體中miR-23b的表達(dá)水平，簡要步驟如下：取1 μg RNA按照cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Applied Biosystems，USA）說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成互補脫氧核糖核酸（cDNA），加入SYBR Green PCR Master Mix（Applied BiStudioystems，USA），進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。RT-PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃，10 min 預(yù)變性；95 ℃，15 s 變性；60 ℃，1 min 退火延伸，45 個循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增，每個樣品重復(fù)3 次。以U6 為內(nèi)參，以2-ΔCt計算miR-23b 的相對表達(dá)水平。所有引物均購買自Invitrogen（Thermo Fisher Scientific，USA）公司，序列如下：miR-23b（正向：5′-GAGCATCACATTGCCAGGG-3′；反向：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′）；U6（正 向：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATAT-3′；反向：5′-TTGCGTGTCATCCTTGCG-3′）。

1.2.4 隨訪采取門診復(fù)查或電話對患者進(jìn)行定期隨訪，隨訪時間截止至2019年12月。其中，4例患者出現(xiàn)失訪，中位隨訪時間為65（27，72）個月。本研究觀察指標(biāo)為5年生存期（overall survival，OS），定義為從明確診斷為結(jié)直腸癌開始至死亡或隨訪截止時間的時間間隔。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用χ2檢驗分析CRC 患者血漿外泌體中miR-23b 水平與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性；采用Kaplan-Meier 繪制不同血漿外泌體miR-23b 表達(dá)水平患者的生存曲線，組間差異采用Log-rank 檢驗進(jìn)行比較；采用單因素和多因素Cox 比例風(fēng)險回歸模型探究影響CRC 患者OS 的風(fēng)險因素。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血漿外泌體的鑒定為了鑒定從血漿中分離的外泌體，筆者首先利用TEM 對外泌體的形態(tài)進(jìn)行初步鑒定，結(jié)果見圖1A，健康人及CRC 患者血漿中提取外泌體均呈現(xiàn)典型的電鏡形態(tài)—茶托型或一側(cè)凹陷的半球形，大部分直徑在100 nm 左右，CRC 患者血漿中的外泌體數(shù)量較健康人多；Western Blot 結(jié)果表明，健康人和CRC 患者血漿中外泌體均表達(dá)CD63 和TSG101，而不表達(dá)Calnexin，且CD63 和TSG101 在CRC 患者血漿外泌體的表達(dá)水平較健康患者明顯升高，見圖1B；本研究進(jìn)一步利用NanoSight 對外泌體的直徑和密度進(jìn)行了測定，結(jié)果表明健康人和CRC 患者血漿中的外泌體的直徑范圍在50 ～200 nm 左右，主要集中在100 nm 周圍，且CRC 患者血漿中的外泌體的密度高于健康人，見圖1C。

圖1 結(jié)直腸癌和健康人血漿外泌體的鑒定Fig.1 Plasma exosomes identification from colorectal cancer and healthy controls

2.2 結(jié)直腸癌患者和健康人血漿外泌體中miR-23b的表達(dá)水平采用RT-qPCR對CRC患者和健康人血漿外泌體中miR-23b 的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，CRC 患者血漿外泌體中miR-23b 的表達(dá)水平較健康人顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義［（1.13±0.12）vs.（2.27±0.26），t=-28.490，P＜0.001］。

2.3 血漿外泌體miR-23b 表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系根據(jù)血漿外泌體中miR-23b 的表達(dá)水平，以中位值1.03 為界，將65例CRC患者分為高表達(dá)組（n=32）和低表達(dá)組（n=33），分析其表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果表明，血漿外泌體miR-23b 低表達(dá)與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期、脈管浸潤及神經(jīng)侵犯顯著相關(guān)（均P＜0.05），而與患者性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大小及術(shù)前CEA 水平無顯著相關(guān)性（均P＞0.05），見表2。

2.4 血漿外泌體miR-23b 表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier 生存分析及Log-rank檢驗結(jié)果表明，血漿外泌體miR-23b 低表達(dá)組患者的病死率較高表達(dá)組明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2= 8.585，P= 0.003），見圖2。單因素分析結(jié)果顯示，腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤、神經(jīng)侵犯、TNM 分期和外泌體miR-23b 表達(dá)是影響CRC 患者OS 的危險因素（均P＜0.05），見表3。將上述因素納入Cox 比例風(fēng)險回歸模型進(jìn)行多因素分析，結(jié)果表明，TNM 分期（HR=4.205，95%CI：1.621 ～10.910，P=0.003）和血漿外泌體miR-23b表達(dá)（HR=2.243，95%CI：1.093 ～5.024，P=0.029）是影響CRC 患者OS 的獨立危險因素（均P＜0.05），見表3。

圖2 結(jié)直腸癌患者血漿外泌體中miR-23b 表達(dá)水平與總生存期的關(guān)系Fig.2 Relationship between miR-23b expression in plasma exosomes and overall survival of colorectal cancer patients

表2 結(jié)直腸癌患者血清外泌體中miR-23b 表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系Tab.2 Association of serum exosomal miR-23b level with clinicopathologic factors in CRC patients例

3 討論

作為一種新興的“液體活檢”技術(shù)，外泌體檢測具有樣本易采集、非侵入性和實時動態(tài)檢測等諸多優(yōu)勢［18］。鑒于上述優(yōu)勢，再結(jié)合外泌體miRNA 可在患者血清中保持穩(wěn)定并具備反映腫瘤細(xì)胞獨特生物學(xué)特性的表達(dá)譜，使得外泌體miRNA成為了一種簡單、可靠的生物標(biāo)志物，用于協(xié)助多種惡性腫瘤的早期診斷和預(yù)后評估［19-21］。本研究通過評估CRC 患者血漿外泌體中miR-23b 的表達(dá)水平及其與臨床病理特征和患者總生存期的相關(guān)性，首次證實血漿外泌體miR-23b 低表達(dá)與多種不良臨床病理因素相關(guān)，并預(yù)示著不良預(yù)后；在納入其他混雜因素后，血漿外泌體miR-23b 低表達(dá)仍是影響CRC 患者總生存期的重要因素。上述研究結(jié)果表明，血漿外泌體miR-23b 可作為預(yù)測CRC 患者預(yù)后的可靠標(biāo)志物。

表3 影響結(jié)直腸癌患者總生存期相關(guān)風(fēng)險因素的單因素和多因素分析Tab.3 Univariate and multivariate analyses of risk factors related to overall survival of CRC patients

目前，腫瘤患者外周血循環(huán)中miRNA 被認(rèn)為是一種簡單、有效的新興標(biāo)志物［22-24］。KOU 等［13］的研究表明，與健康人相比，CRC 患者血漿樣本中的miR-23b 水平明顯降低，且其低表達(dá)不僅與腫瘤臨床分期，腫瘤深度，腫瘤復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，還可用作CRC 診斷和預(yù)后評估的標(biāo)志物。然而，新興證據(jù)證實裸露在血液循環(huán)中的miRNAs 可被內(nèi)源產(chǎn)生的RNase 所降解，而外泌體中的miRNAs 由于有外泌體外膜“包裹”保護(hù)可免受RNase作用［25］。因此，相較于血液中的總miRNA，檢測血漿外泌體中的miRNA 能更好的反映患者外周血中的miRNA 水平。本研究通過檢測miR-23b 在血漿外泌體中的表達(dá)水平代替血清中總miR-23b，以評估循環(huán)miR-23b 在CRC 中的臨床預(yù)后價值，可提高循環(huán)miR-23b 檢測在患者預(yù)后評估中的準(zhǔn)確性。關(guān)于外泌體miR-23b 在惡性腫瘤中的臨床意義，既往已有相關(guān)研究報道：KUMATA 等［26］分析了血漿外泌體miR-23b 在各個分期胃癌中的預(yù)后價值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃癌患者血漿中的外泌體miR-23b水平明顯低于健康對照組，且隨著腫瘤分期的增加，表達(dá)水平逐漸降低；生存分析發(fā)現(xiàn)，在Ⅰ～Ⅳ期胃癌中，血漿外泌體miR-23b 低表達(dá)均預(yù)示著較短的無疾病進(jìn)展期和總生存期。上述研究結(jié)果提示，血漿外泌體miR-23b 可能是一個潛在的惡性腫瘤相關(guān)生物標(biāo)志物。

關(guān)于miR-23b 參與CRC 發(fā)生進(jìn)展的分子機制，目前研究仍較少。ZHANG 等［11］通過對結(jié)腸癌組織及細(xì)胞進(jìn)行全基因組功能篩選后發(fā)現(xiàn)，miR-23b在人結(jié)腸癌樣本中顯著下調(diào)，其可通過靶向調(diào)控包括FZD7 和MAP3k1 在內(nèi)的多個腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲以及新生血管形成，從而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移；另一方面，GASIULè等［15］研究發(fā)現(xiàn)miR-23b 在奧沙利鉑耐藥的CRC 細(xì)胞高表達(dá)，其可通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而增加對化療藥物的抵抗性，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。

盡管本研究首次探究了miR-23b 在CRC 患者血漿外泌體中的表達(dá)水平，并對其臨床預(yù)后價值進(jìn)行了深入探究，但仍存在一些局限：（1）樣本量相對較小；（2）未對外泌體miR-23b 參與CRC 發(fā)生發(fā)展的分子機制進(jìn)行探究。在未來，一方面，有必要開展大規(guī)模的臨床研究去進(jìn)一步證實血漿外泌體miR-23b 水平在CRC 及其他瘤種中的臨床意義；另一方面，需要更多基礎(chǔ)研究去探索miR-23b特別是外泌體miR-23b 參與CRC 發(fā)生、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移的潛在分子機制。

綜上所述，本研究證實miR-23b 在CRC 患者血漿外泌體中表達(dá)顯著下調(diào)，且其低表達(dá)與多個不良臨床病理學(xué)因素及較短的總生存期密切相關(guān)，可作為一個CRC 的預(yù)后標(biāo)志物和潛在的治療靶點。