溫丹丹， 呂亞林

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院口腔醫(yī)療中心，北京（100029）

近年來，心腦血管疾病的發(fā)病率逐年上升［1］，阿司匹林，又稱為乙酰水楊酸，作為典型的抗血小板藥物被廣泛用于預(yù)防和治療心腦血管疾?。?］。在生活水平提高的同時(shí)，多數(shù)牙齒缺失的患者選擇種植修復(fù)。相關(guān)研究表明口服抗血小板藥物患者不停藥進(jìn)行種植手術(shù)是安全的［3］。種植成功的關(guān)鍵是形成良好的骨整合，既往相關(guān)研究多探索阿司匹林與骨密度間的關(guān)系。通過對(duì)916 名服用阿司匹林患者2008～2012 年骨密度變化的觀察發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期服用低劑量的阿司匹林與患者的骨密度減低無關(guān)，且不會(huì)增加骨折風(fēng)險(xiǎn)［4］；在研究阿司匹林、鮭魚降鈣素對(duì)去勢(shì)大鼠影響的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，給予阿司匹林的大鼠骨密度增加，骨硬度及抗折性增加［5］。然而阿司匹林對(duì)種植體周圍骨形成的影響研究甚少。本實(shí)驗(yàn)對(duì)種植術(shù)后的大鼠持續(xù)給予不同劑量的阿司匹林，通過觀察不同時(shí)期種植體周圍的成骨情況，分析阿司匹林對(duì)于大鼠種植后早期骨形成的影響，為臨床上服用阿司匹林患者的牙種植提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要設(shè)備與材料

6 周齡雄性SD 大鼠［斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司］，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2016-0002；7%的水合氯醛（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；阿司匹林（索萊寶，中國(guó)）；阿莫西林（索萊寶，中國(guó)）；Ti-6Al-4V 種植釘［奧齒泰（北京）商貿(mào)有限公司］；正置光學(xué)顯微鏡（Nikon Eclipse CI，日本尼康）；成像系統(tǒng)（Nikon DS-U3，日本尼康）；顯微鏡（Nikon E100，日本尼康）；蘇木素-伊紅染液（武漢谷歌生物科技）；Masson 染色試劑盒（武漢谷歌生物）；Anti-BMP2-Rabbit pAb（賽維爾生物，中國(guó)）；山羊抗兔二抗（賽維爾生物，中國(guó)）；BSA（賽維爾生物，中國(guó)）；蘇木素染液（賽維爾生物，中國(guó)）；蘇木素分化液（賽維爾生物，中國(guó)）；蘇木素返藍(lán)液（賽維爾生物，中國(guó)）；免疫組織化學(xué)試組化試劑盒DAB 顯色劑（賽維爾生物，中國(guó)）；TRAP 染液套裝（賽維爾生物，中國(guó)）。

1.2 動(dòng)物及分組

48 只6 周齡清潔級(jí)雄性SD（Sprague-Dawley，SD）大鼠，飼養(yǎng)于北京安貞醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，動(dòng)物飼養(yǎng)許可證件編號(hào)：1118052100279，室溫控制（22 ± 2）℃，相對(duì)濕度（55±10）%，人工照明模擬晝夜變化，自由飲水進(jìn)食，適應(yīng)性喂養(yǎng)兩周。隨機(jī)分為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組A、B、C 4 組。實(shí)驗(yàn)獲得首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 種植手術(shù)

取48 只SD 雄性大鼠，用7%的水合氯醛0.5 mL/100 g 腹腔注射行全身麻醉。大鼠膝關(guān)節(jié)處脫毛，消毒，無菌操作下于右側(cè)下肢膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)作一長(zhǎng)1 cm 縱行切口，切開皮膚及皮下組織，分離肌層，顯露髕骨及股骨遠(yuǎn)端，用低速牙科手機(jī)（800 rpm/min，穿透骨皮質(zhì)）和種植釘專用鉆針預(yù)備種植窩，將直徑1.4 mm，長(zhǎng)度6 mm 的Ti-6Al-4V 種植釘，稍加壓旋入預(yù)備好的種植窩內(nèi)，分層拉攏縫合手術(shù)切口。

1.4 術(shù)后處理及給藥

種植術(shù)后的大鼠均放置于干凈通風(fēng)的鼠籠內(nèi)單籠飼養(yǎng)，維持籠內(nèi)溫度25 ℃左右，觀察大鼠呼吸等一般情況，直至麻醉蘇醒。術(shù)后給予3 d 阿莫西林67 mg/kg 每次（依據(jù)成人1 次0.75 g，3 次/d 給藥劑量換算），3 次/d。于大鼠麻醉蘇醒當(dāng)日A、B、C組給予阿司匹林，根據(jù)藥理實(shí)驗(yàn)人鼠劑量換算標(biāo)準(zhǔn)，按照臨床上心腦血管疾病預(yù)防及治療時(shí)成年人常用劑量即患者每天口服100、200、300 mg計(jì)算，體重為200 g 的大鼠A、B、C 組每天需給予阿司匹林的劑量分別為8.93 mg/kg、17.86 mg/kg、26.79 mg/kg，即每天需灌胃給藥量為1.786、3.572、5.358 mg，將100、200、300 mg 阿司匹林粉末分別溶于56.0、28.0、18.7 mL 的0.9%氯化鈉注射液中，混合液均為當(dāng)日使用前現(xiàn)配制。對(duì)照組給予等劑量的0.9%氯化鈉注射液灌胃。

大鼠于SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房中飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，每周稱1 次體重，根據(jù)大鼠體重變化調(diào)整給藥量，給藥至2周、4周各組大鼠行安樂死。

1.5 骨組織標(biāo)本采集

分別于2 周、4 周時(shí)，每組大鼠各隨機(jī)抽取6 只腹腔注入480 mg/kg 水合氯醛行安樂死，收集大鼠右側(cè)含種植體在內(nèi)的1.5 cm 長(zhǎng)的股骨骨塊，在PBS 中剔除周圍筋膜、肌肉及關(guān)節(jié)處韌帶，所有骨組織標(biāo)本均放于4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行內(nèi)外雙重固定，在4 ℃條件下固定7 d。

1.6 標(biāo)本處理及檢測(cè)

1.6.1 組織脫鈣及石蠟包埋切片 將組織從固定液取出行脫鈣處理，EDTA 液（0.5 mol/L，pH 7.4）脫鈣4 周，每天更換新鮮脫鈣液，直到骨組織能被細(xì)針輕松插入則脫鈣完成。小心去除種植釘，沖洗，梯度酒精進(jìn)行脫水，石蠟包埋，切片機(jī)沿種植體長(zhǎng)軸作矢狀連續(xù)切片，切片厚度4.0 μm，烤片，待水烤干蠟烤化后取出常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 HE 染色 石蠟切片脫蠟至水，Harris 蘇木素染，自來水洗，1%的鹽酸酒精分化，自來水沖洗，0.6%氨水返藍(lán)，流水沖洗，伊紅染液染色，脫水封片。 Caseviewer2.0 掃描儀獲取切片影像，200 × 視野下觀察種植體周圍新生骨組織情況并進(jìn)行分析。

1.6.3 Masson 染色 石蠟切片脫蠟至水，Weigert氏鐵蘇木素染，自來水洗，1%的鹽酸酒精分化，自來水沖洗，流水沖洗返藍(lán)，麗春紅酸性品紅液染，蒸餾水快速漂洗，磷鉬酸水溶液處理，苯胺藍(lán)液復(fù)染，1%冰醋酸處理，脫水封片。200 × 視野下觀察種植體周圍新生骨組織中I 型膠成熟情況。

1.6.4 BMP-2 免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片脫蠟至水，修復(fù)盒中在微波爐內(nèi)行抗原修復(fù)，自然冷卻后置于PBS（PH 7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5 min；后于3%雙氧水溶液中室溫避光孵育25 min，脫色搖床上晃動(dòng)洗滌；在組化圈內(nèi)滴加3%BSA 均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min。加兔抗鼠一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜，加山羊抗兔二抗，脫色搖床上晃動(dòng)洗滌；切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加二抗（HRP標(biāo)記）覆蓋組織，室溫孵育50 min，脫色搖床上晃動(dòng)洗滌。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加新鮮配制的DAB 顯色液，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，自來水沖洗切片終止顯色。蘇木素復(fù)染，自來水洗，蘇木素分化液分化，自來水沖洗，蘇木素返藍(lán)液返藍(lán)，流水沖洗。脫水封片。Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件觀察種植周圍500 μm×500 μm 范圍內(nèi)新生骨組織中BMP-2 的平均光密度值（mean optical density，MOD）表達(dá)情況并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6.5 破骨細(xì)胞染色 石蠟切片脫蠟至水，配制TRAP 孵育液：TRAP 染液A 18 mL+B 液1 mL+C 液1 mL 混勻，再加TRAP 染液F 0.282 g，充分溶解過濾后備用。將切片用組化畫筆畫圈后放在濕盒中，用蒸餾水37 ℃孵育2 h 后，將切片重新放置在濕盒中，滴加過濾好的現(xiàn)配的TRAP 孵育液放于37 ℃烤箱孵育20 min。傾去染液，水洗后，蘇木素染液復(fù)染核15 s，分化液分化，返藍(lán)液返藍(lán)。脫水封片。

每張切片植體周圍500 μm × 500 μm 范圍作為感興趣區(qū)（region of interest，ROI），隨機(jī)選取6 個(gè)不重疊ROI，測(cè)量破骨細(xì)胞單位面積計(jì)數(shù)，重復(fù)測(cè)量3 次后取平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用x±s表示，Shapiro-Wilk 法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，Levene′s 法驗(yàn)證數(shù)據(jù)方差齊性。對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間，方差齊的組別行Tukey-Kramer 檢驗(yàn)，方差不齊的組別行Games-Howell 檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況觀察

種植術(shù)后當(dāng)天，各組大鼠均表現(xiàn)為身體蜷縮、毛發(fā)光澤度降低、嗜睡、活動(dòng)減少、進(jìn)食和飲水略減少。術(shù)后7 d，毛發(fā)光澤度恢復(fù)，活動(dòng)恢復(fù)正常，各組大鼠均表現(xiàn)為一級(jí)愈合創(chuàng)口，未發(fā)生感染現(xiàn)象，進(jìn)食、飲水恢復(fù)正常。

2.2 HE 染色

植體周圍500 μm 范圍內(nèi)，各組松質(zhì)骨及髓腔區(qū)域種植體周圍均有新生骨組織形成，但各組的種植體周骨板厚薄不一。對(duì)照組與A 組中種植體周骨板稍厚，連續(xù)性尚可，骨小梁少量，骨髓腔較??；B、C 兩組種植體周骨板較對(duì)照組纖細(xì)，局部可見不連續(xù)，植體周的骨板外圍髓腔相對(duì)增大，骨小梁相對(duì)減少且變細(xì)，且C 組更明顯（圖1、圖2）。

2.3 Masson 染色

Masson 染色結(jié)果中，骨組織中成熟I 型膠原紅染，而骨組織中未成熟的膠原為藍(lán)染。種植體植入2 周和4 周時(shí)，在植體周圍500 μm 范圍內(nèi)，對(duì)照組與A 組的種植體周圍骨組織中紅染部分未見明顯差異，B、C 兩組較對(duì)照組紅染區(qū)域相對(duì)減少，且C 組減少更明顯（圖1、圖2）。

2.4 BMP-2 在各組大鼠骨組織中的表達(dá)

2 周時(shí)，C 組MOD 數(shù)值最低，與對(duì)照組、A、B 組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），對(duì)照組較B 組MOD 值略高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），其余組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；4 周時(shí)，C組MOD 數(shù)值最低，與對(duì)照組、A、B 組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），其余組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）（圖1～圖3）。

2.5 破骨細(xì)胞染色

2 周和4 周時(shí)，對(duì)照組與A、B、C 組的單位面積TRAP 陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)依次降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），表明阿司匹林對(duì)于破骨細(xì)胞有抑制作用，且隨著劑量增大抑制作用增強(qiáng)（圖1、圖2、圖4）。

Figure 1 Results of HE，Masson，BMP-2 and TRAP staining in each group in the 2nd week圖1 2 周時(shí)各組HE、Masson、BMP-2 及TRAP 染色結(jié)果

Figure 2 Results of HE，Masson，BMP-2 and TRAP staining in each group in the 4th week圖2 4 周時(shí)各組HE、Masson、BMP-2 及TRAP 染色結(jié)果

Figure 3 MOD values of BMP-2-positive staining in each group in the 2nd and 4th week圖3 2、4 周時(shí)各組BMP-2 陽(yáng)性染色的MOD 值

Figure 4 Amount of TRAP-positive staining per unit area in the 2nd and 4th week圖4 2、4 周時(shí)單位面積TRAP 陽(yáng)性染色個(gè)數(shù)

3 討 論

阿司匹林為非選擇性環(huán)氧合酶（cyclooxygenase，COX）抑制藥，通過使COX 乙?；Щ?，阻斷花生四烯酸（arachidonic acid，AA）轉(zhuǎn)化為血栓烷A2（thromboxane，TXA2）；同時(shí)也減少前列腺素（prostaglandin，PG）的合成。前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）為PG 家族中的一種，PGE2 參與骨細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，對(duì)于成骨細(xì)胞的分化及骨組織的形成至關(guān)重要，同時(shí)也影響著破骨細(xì)胞的形成和表達(dá)［6］。種植成功的關(guān)鍵是形成良好的骨整合，成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞在骨組織的形成與改建中發(fā)揮重要作用［7］，阿司匹林降低PGE2 的生成，而PGE2又促進(jìn)成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的成骨過程，因而阿司匹林可能抑制種植體周圍骨形成［8］。

阿司匹林可能對(duì)種植體周圍骨形成有抑制作用，且該作用與阿司匹林劑量呈相關(guān)性。在阿司匹林對(duì)于兔尺骨骨折影響的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，阿司匹林給藥量而非給藥頻率在骨折端骨延遲愈合中發(fā)揮作用，且延遲程度呈劑量依賴性［9］。在去勢(shì)大鼠骨缺損模型中也發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用阿司匹林未明顯改變骨形成及代謝相關(guān)指標(biāo)［10］。本研究HE 染色結(jié)果顯示，B、C 組較對(duì)照組種植體周圍新生骨板厚度薄、連續(xù)性差、骨小梁數(shù)量少、骨髓腔大，隨著給藥量的增加新骨形成量逐漸降低，且C組最明顯，但A組與對(duì)照組比較差異卻不明顯，推測(cè)高劑量阿司匹林可能減少種植體周圍新骨形成量，且減少程度與阿司匹林劑量相關(guān)，這與上述高劑量阿司匹林對(duì)于骨形成的抑制作用相符合。

阿司匹林可能通過抑制成骨細(xì)胞的分泌、增殖及分化功能進(jìn)而抑制種植體周圍的骨形成過程。用50、100、200 μg/mL 的阿司匹林作用于人骨髓基質(zhì)細(xì)胞（bone marrow stromal cells，BMSCs），結(jié)果顯示阿司匹林直接抑制BMSCs 的增殖并減慢細(xì)胞外間質(zhì)的礦化，且該作用呈劑量依賴性［11］。通過將不同劑量的阿司匹林等非甾體類抗炎藥（nonsteroidal anti-inflammatory drugs ，NSAIDs）作用于MG63 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)高劑量組增加了MG63 細(xì)胞的壞死和凋亡，而在低劑量組中此現(xiàn)象不明顯［12-13］。骨基質(zhì)的主要有機(jī)成分是Ⅰ型膠原，I 型膠原由成骨細(xì)胞分泌，與成骨細(xì)胞的增殖與分化、骨基質(zhì)的形成與礦化密切相關(guān)。本研究Masson 染色結(jié)果顯示隨著藥物濃度的增加，實(shí)驗(yàn)組紅染區(qū)域較對(duì)照組逐漸減小，且C 組減小最明顯，但A 組較對(duì)照組差異不明顯。骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）由成骨細(xì)胞產(chǎn)生，能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞分化增殖并誘導(dǎo)成骨，在新骨形成活躍階段表達(dá)增高［14］。研究表明，通過COX-2 途徑生成的PGE2 能夠與EP4 受體結(jié)合促進(jìn)BMP-2 及核因子κB 受體活化因子（receptor activator of nuclear factor kappa B，RANKL）的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)骨再生及愈合［15-16］。本研究免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示骨組織中BMP-2 的表達(dá)隨著藥物濃度的增加依次減小，但對(duì)照組與A 組差異不明顯，C 組與其余組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由Masson 及BMP-2 染色結(jié)果可以推測(cè)：阿司匹林通過失活COX 降低PGE2 生成，PGE2 的減少可能又降低了成骨細(xì)胞的分泌、增殖及分化的能力，進(jìn)而抑制種植體周圍骨形成，且與阿司匹林劑量有關(guān)，這與上述阿司匹林對(duì)成骨細(xì)胞的抑制作用相符合。

阿司匹林可能通過抑制破骨細(xì)胞的生成進(jìn)而抑制種植體周圍骨改建過程。在骨組織吸收和重建中，破骨細(xì)胞至關(guān)重要［17］，且與成骨細(xì)胞間存在相互作用影響成骨細(xì)胞的生成及生理功能［18-19］。研究發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞能夠促進(jìn)人間充質(zhì)干細(xì)胞（human mesenchymal stem cell，hMSC）遷移及分化為成骨細(xì)胞，破骨細(xì)胞通過1-磷酸神經(jīng)鞘氨醇（sphingosine 1-phosphate，S1P）和骨形成蛋白-6 來募集骨損傷區(qū)成骨前體細(xì)胞，并通過Wnt/BMP 通路促進(jìn)骨的形成［20］。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，因c-fos 基因缺乏不能形成破骨細(xì)胞的鼠，骨的形成也相對(duì)減少［21］。通過比較富破骨細(xì)胞骨硬化癥鼠與乏破骨細(xì)胞骨硬化癥鼠的骨形成情況，發(fā)現(xiàn)前者的骨形成量、骨組織體積及骨小梁強(qiáng)度均高于后者［22］?？咕剖崴嵝粤姿崦福╰artrateresistant acid phosphatase，TRAP）是破骨細(xì)胞中高度表達(dá)的關(guān)鍵酶，參與破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨轉(zhuǎn)換過程。對(duì)去勢(shì)大鼠給予小劑量阿司匹林6 個(gè)月，經(jīng)TRAP 染色發(fā)現(xiàn)大鼠脛骨組織中破骨細(xì)胞的數(shù)量較對(duì)照組減少［23］。在C57BL/6J 小鼠種植體相關(guān)感染的實(shí)驗(yàn)中，TRAP 染色顯示15、30、60 mg的阿司匹林明顯降低破骨細(xì)胞的表達(dá)，且該抑制作用呈劑量依賴性［24］。本研究發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞的數(shù)量隨著阿司匹林給藥量的增加而減少，呈劑量依賴性。破骨細(xì)胞的減少反映了骨形成與重塑活動(dòng)的減弱，進(jìn)而減弱種植體周圍新骨的形成與改建。此結(jié)果也驗(yàn)證了阿司匹林對(duì)于破骨細(xì)胞的抑制作用。

綜上所述，阿司匹林可能通過抑制成骨細(xì)胞的生成及破骨細(xì)胞的表達(dá)來減少種植體周圍骨組織的產(chǎn)生，該影響可能與阿司匹林使COX失活進(jìn)而減少PGE2 形成有關(guān)。阿司匹林對(duì)種植體周圍骨形成的抑制作用呈劑量依賴性，高劑量阿司匹林抑制作用更明顯。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為臨床上服用阿司匹林患者的牙種植早期骨形成情況提供參考，而阿司匹林在骨形成中的具體作用機(jī)制及遠(yuǎn)期影響還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)加以探究。