魏雪竺 劉長營 李貝貝 李 鈞 馬 攀

口腔種植技術作為一種新興的技術發(fā)展迅速，種植適應癥范圍也在不斷擴大，包括糖尿病在內的許多全身疾病在控制穩(wěn)定的前提下都可以作為種植的適應癥[1]。而高血糖患者的種植仍然是相對高風險的，我國作為2型糖尿病患者的患病大國，血糖控制目前不容樂觀[2]，仍有許多患者因為血糖無法控制到理想范圍無法進行口腔種植[3]。因此需要進一步研究適合高血糖的2型糖尿病患者的種植技術方法，相關研究主要仍在動物研究的階段[4]。種植體相關的動物研究主要采用的成品種植體直徑較大，不適用于大鼠等小型實驗動物。且成品種植體表面大多采用涂層處理，表面不利于加載藥物，往往需要更多的動物樣本[5]。本研究擬設計并制作一種新型的應用于大鼠等小型動物的種植體，應用該種植體并負載甘精胰島素PLGA(聚乳酸-羥基乙酸共聚物)微球，觀察對GK大鼠(2型糖尿病大鼠)種植體周圍成骨的影響。

圖1 種植體設計圖及封閉螺絲示意圖

1.材料與方法

1.1 材料 動物用種植體10枚；雄性GK大鼠10只；甘精胰島素PLGA微球，空白微球；矯正共振頻率分析測量儀(Osstell ISQ，瑞典)等。

PLGA微球制作：采用W/O/W法制作甘精胰島素及空白PLGA微球。

1.2 自主設計的新型種植體模型 本實驗所采用的種植體材質為純鈦種植體，種植體外形圖如圖1所示。種植體長度6mm，直徑2.8mm，表面為無螺紋的光滑表面。種植體內徑為1.8mm，內部有螺紋，種植體內部螺紋與Bego種植體內部螺紋一致。種植體與封閉螺絲接口處內側設計為45°的斜面，以便于種植體和封閉螺絲更好的吻合。種植體內徑與Osstell ISQ測量儀套裝中Bego種植體的SmartPeg感應器(共振頻率測量桿)吻合，以便實驗過程中測ISQ值。種植體表面采用微弧氧化處理。種植體由北京萊頓生物有限公司制作。

1.3 實驗動物及分組 將10只12周齡的GK大鼠飼養(yǎng)一周。測定血糖值，血糖＞16.7mmol/L表示建模成功，10只大鼠均符合建模要求，將大鼠采用抽簽法隨機分成2組，每組5只。2組分別為甘精胰島素組和空白對照組。

1.4 實驗方法 實驗組及對照組術前半小時腹腔注射30mg/kg青霉素預防感染。水合氯醛腹腔內注射麻醉大鼠，StraumannR○手術工具盒中先鋒鉆、直徑2.2mm、2.8mm環(huán)形齒科鉆預備種植體窩，并于右側膝關節(jié)內側植入種植體。甘精胰島素組大鼠在種植體植入前，給予局部200μg PLGA微球負載與種植體表面。使用精確度為0.0001g的天平，稱取2mg PLGA微球，在96孔板內溶于0.2ml生理鹽水中，用加樣槍輕輕吹勻后吸取20μl，在種植體植入前放于種植窩內，之后植入種植體。對照組則將0.02%三羥甲基氨基甲烷的空白PLGA微球加入制備好的種植窩內。測定初始ISQ值后分層縫合。并在種植手術植入后第3、4、5、6周，局麻下測量ISQ值，測量3次取平均值。在第6周測量完成大鼠ISQ值后，處死大鼠，拍攝CT(結果如圖3所示)。截取右側脛骨，用于種植體骨磨片。種植體骨磨片采用亞甲基藍-品紅染色，使用Image Pro Plus軟件分析測量種植體-骨界面長度及種植體-骨整合長度，并計算種植體-骨整合率。對兩組GK大鼠每周進行血糖測量。

1.5 統(tǒng)計學分析 結果使用SPSS22.0統(tǒng)計分析軟件。對同一周甘精胰島素組和空白對照組的數據進行獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2.結果

甘精胰島素標準品制得的PLGA微球載藥量為24.87%±0.57%，包封率為62.19±1.41%。掃描電子顯微鏡下可見微球形態(tài)如圖2所示基本為球型，甘精胰島素組PLGA微球平均直徑4.34±1.65μm，對照組PLGA微球平均直徑4.18±1.29μm。使用吸光度法測得甘精胰島素PLGA微球12h釋放率35.36%，2d釋放率67.25%，8d釋放率88.55%，14d釋放率94.49%。

圖2 甘精胰島素(左圖)及對照組(右圖)PLGA微球

甘精胰島素組及對照組大鼠實驗前后的血糖值如圖3所示。甘精胰島素組和對照組每周測量血糖值均大于18mmol/L，且每周兩組間血糖值差異不具有統(tǒng)計學意義(P＞2.61)。

圖3 大鼠血糖值

甘精胰島素和對照組ISQ值如表1所示。甘精胰島素組第4、5、6周ISQ值及第6周種植體骨結合率顯著高于對照組。兩組ISQ值從第3周起呈現明顯的增長趨勢，且甘精胰島素組ISQ值高于對照組。在第1、3周兩組間ISQ值沒有統(tǒng)計學差異，而在第4、5、6周甘精胰島素組ISQ值顯著高于對照組。第6周時CT如圖4所示可見2組種植體周圍可見骨結合，磨片染色如圖5所示，可見新生成的骨小梁，計算甘精胰島素組種植體骨結合率(種植體骨結合率為59.73±0.92%，對照組種植體骨結合率為44.6±0.97%，甘精胰島素組種植體骨結合率顯著高于對照組(如圖6所示)。

表1 甘精胰島素和對照組ISQ值(無單位)

圖4 第6周GK大鼠種植體CT圖像(左圖為甘精胰島素組，右圖為對照組)

圖5 種植體磨片(左圖為甘精胰島素組，右圖為對照組，下圖為完整視野下種植體磨片)

圖6 第6周種植體骨結合率

3.討論

設計的種植體形態(tài)能夠滿足12周齡GK大鼠脛骨植入時的需要，種植體內徑的設計也能夠滿足實驗中測定ISQ值的需要，對純鈦種植體表面進行微弧氧化能夠使種植體獲得良好的生物相容性。通過測定實驗動物的種植體穩(wěn)定性增長水平，避免過多的實驗動物分組，減少實驗動物數量。微弧氧化處理的種植體表面負載微球，氧化層表面為加載藥物提供了空隙，增加了種植體的表面積，有利于成骨[6]。光滑表面的種植體較螺紋表面的種植體更有利于觀察和計算種植體骨結合率，并且有利于種植體表面進一步實驗研究時負載藥物的均勻分布。甘精胰島素PLGA微球通過類胰島素樣作用，促進大鼠高糖環(huán)境下種植體周圍的骨結合[7]。與傳統(tǒng)加藥方式相比，甘精胰島素PLGA微球能夠在種植體表面緩慢、持續(xù)的釋放，藥物的作用時間相對較長，不需要多次給藥[8]。且局部的精準給藥排除了甘精胰島素降糖作用導致的骨結合率增高[9]。另一方面甘精胰島素PLGA微球制作成本較高，且并不能長時間存放，在體外的儲存環(huán)境下其微球依然會緩慢破裂[10]。

種植體植入后ISQ值的測量數據為第1、3、4、5、6周，并沒有測量第2周的ISQ值。因為在之前進行的預實驗中，在第2周旋出封閉螺絲時種植體也隨封閉螺絲一同旋出。這可能是因為種植體植入初期破骨細胞相對活躍[11]，并沒有形成相對良好的骨結合，且本實驗設計的光滑表面并沒有機械固位力。從第1周到第3周，種植體ISQ值增長相對緩慢，且甘精胰島素組與對照組間并沒有統(tǒng)計學差異，這可能是因為甘精胰島素的類胰島素樣作用對種植體在植入初期種植體-骨界面破骨細胞主導的破骨活動并不顯著[12]。甘精胰島素組PLGA微球釋放的甘精胰島素產生的類胰島素樣作用主要促進成骨細胞改建[13]。從第3周起種植體表面成骨活動活躍，ISQ值穩(wěn)步增加。

本實驗設計的光滑表面短種植體能夠成功應用于GK大鼠，獲得良好的生物相容性，在高血糖環(huán)境下獲得一定的骨結合。甘精胰島素組GK大鼠種植體穩(wěn)定性增長水平和種植體骨結合率明顯高于對照組，進一步證實了PLGA微球負載的甘精胰島素對2型糖尿病大鼠種植體周圍成骨具有促進作用[14]。