孔 宇，張倚菲，韓鵬云，韋柳伊，李文華，王禹鶴，趙紫芙，李欣憶，李 超

(天津科技大學 食品工程與生物技術學院，天津 300457)

沙棘原產于歐亞大陸，是一種耐寒的胡頹子科沙棘屬灌木植物,廣泛生長于印度、中國、巴基斯坦、俄羅斯、英國、德國和法國等國家。沙棘漿果中含有豐富的維生素C、類黃酮、油溶性化合物以及礦物質等營養(yǎng)物質[1]。這些營養(yǎng)性物質使沙棘漿果具有特殊的生物活性，可用于治療心血管疾病、癌癥和急性高山病等多種疾病。沙棘籽油含有大量不飽和脂肪酸、生育酚、類胡蘿卜素和黃酮類化合物，具有顯著的抗菌、抗動脈粥樣硬化和心臟保護作用[2-3]。

我國每年沙棘的種植面積為120萬hm2[4]，可收獲115.2萬t沙棘鮮果[5]。每噸沙棘鮮果可產生30 kg沙棘濕籽，提取油脂后會產生13.8 kg沙棘籽粕，因此沙棘籽粕的年產量達到1.5萬t[5-6]。沙棘籽粕中含有20%的纖維素、10%的半纖維素和約30%的蛋白質[7]。雖然沙棘籽粕中蛋白質含量豐富，但由于多酚的存在，蛋白質的利用率比較低。崔淼[8]對沙棘籽粕中的蛋白進行了提取及功能性研究，得到的蛋白為褐色粉末，嚴重影響了蛋白質的加工利用。這是由于酚類化合物在堿性條件下被氧化成醌，醌能縮合形成高相對分子質量的褐色素，這些褐色產物保持高活性并易與蛋白質中的巰基和氨基結合，降低蛋白質的消化率和利用率[9]。植物多酚是植物細胞內的重要植物色素、抗氧化劑及具有多種功能的保護因子，具有抑菌、抗腫瘤等作用[10]。本實驗以沙棘籽粕為原料，通過單因素實驗分析結合正交實驗優(yōu)化沙棘籽粕多酚提取工藝，研究沙棘籽粕多酚組分及抗氧化能力，旨在為沙棘籽粕多酚利用提供理論依據，并為沙棘籽粕蛋白提取前處理提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

沙棘籽粕，內蒙古宇航人高技術產業(yè)有限責任公司；牛血清白蛋白、福林酚，北京索萊寶科技有限公司；考馬斯亮藍G-250，上海邁瑞爾化學技術有限公司；沒食子酸、原兒茶素、新綠原酸、兒茶素、綠原酸、表兒茶素、阿魏酸、蘆丁、楊梅素、槲皮素、山奈酚標準品，上海源葉生物科技有限公司；其余化學試劑均為國產分析純。

Agilent-1260高效液相色譜儀，美國安捷倫儀器公司；JP-031超聲波清洗機；DF-101型系列集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；德國IKA RV8旋轉蒸發(fā)儀；電子天平；UV-1800紫外可見分光光度計；XY-FD-27S加熱型冷凍干燥機；3-18臺式高速冷凍離心機，德國Sigma；1510-01116全波長酶標儀，芬蘭Thermo Fisher。

1.2 實驗方法

1.2.1 沙棘籽粕多酚的提取

沙棘籽粕經粉碎后過80目篩，用10倍的石油醚浸泡脫脂2 h。取脫脂沙棘籽粕，按一定料液比加入提取溶劑，按一定方式(冷搖，超聲或恒溫靜置)在一定溫度下提取一定時間，離心取上清液，殘渣重復提取2次，合并上清液，得到多酚提取液。

1.2.2 多酚含量測定及得率計算

參考Okarter等[11]的方法，采用福林-酚法測定多酚提取液中的多酚含量，按下式計算多酚得率。

多酚得率=多酚提取液體積×多酚含量/沙棘籽粕質量×100%

1.2.3 蛋白質含量測定及得率計算

采用考馬斯亮藍法[12]，以牛血清白蛋白含量為橫坐標，溶液的吸光度為縱坐標，得到標準曲線回歸方程為y=0.764 7x+0.040 1(R2=0.996 9)。根據標準曲線回歸方程測得多酚提取液中蛋白質含量，按下式計算蛋白得率。

蛋白得率=多酚提取液體積×蛋白質含量/沙棘籽粕質量×100%

1.2.4 沙棘籽粕多酚提取液組分分析

將沙棘籽粕多酚提取液濃縮到一定體積后加入甲醇定容，吸取4 mL樣品進行超濾(超濾膜截留相對分子質量100 kDa)，透過超濾膜的部分為游離態(tài)酚，過0.45 μm濾膜，采用HPLC測定有效成分的含量[8]。

HPLC條件：Shim-pack GIST C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；紫外檢測波長280 nm；流速0.8 mL/min；柱溫30℃；流動相以含2%冰醋酸的水溶液和甲醇分別為A相和B相，梯度洗脫。梯度洗脫條件：0～20 min，0～5%B；20～35 min，25%～45%B；35～40 min，40%～40%B；40～41 min，40%～90%B；41～50 min，95%～95%B；50～52 min，95%～5%B；52～55 min，5%～5%B。以標準品的保留時間對樣品的色譜峰定性，采用外標法進行定量。

1.2.5 沙棘籽粕多酚抗氧化性測定

沙棘籽粕多酚提取液經30℃真空濃縮、冷凍干燥，得到多酚提取物，于-18℃貯藏，用于抗氧化性分析。

參考Zhang等[13]的方法，將樣品配制為多酚質量濃度分別為0.01、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/mL的溶液，分別取樣液5 mL，加入2 mmol/L的DPPH乙醇溶液5 mL，混合均勻，置于室溫下避光反應30 min。以蒸餾水代替樣品，作為空白組。以無水乙醇5 mL代替2 mmol/L的DPPH乙醇溶液作為對照組。每組進行3次平行實驗。取1 mL反應好的溶液，在4℃、6 000 r/min的冷凍離心機中離心10 min，在96孔板中加入每個樣品的上清液0.2 mL，并在517 nm處測定吸光度，按下式計算DPPH自由基清除率。

1.2.5.2 羥自由基清除能力測定

參考李順峰等[14]的方法，將樣品配制為多酚質量濃度分別為0.01、0.05、0.10、0.25、0.50 mg/mL溶液。依次取5 mmol/L的硫酸亞鐵溶液2 mL、5 mmol/L的水楊酸乙醇溶液2 mL、3 mmol/L的過氧化氫溶液2 mL，均勻混合后加入2 mL樣品溶液，最后用蒸餾水補至10 mL，在37℃下水浴30 min。以蒸餾水代替樣品，作為空白組。以蒸餾水2 mL代替3 mmol/L過氧化氫溶液作為對照組。每組進行3次平行實驗。取1 mL反應好的溶液，在4℃、6 000 r/min的冷凍離心機中離心10 min，在96孔板中加入每個樣品的上清液0.2 mL，在510 nm處測定吸光度，按下式計算羥自由基清除率。

2 結果與分析

2.1 沙棘籽粕多酚提取的單因素實驗

2.1.1 提取溶劑對多酚和蛋白得率的影響

多酚因含酚羥基的化學結構，可與大分子、蛋白質或多糖相互結合，形成非共價作用結構[15]。不同性質的有機溶劑提取，由于溶劑極性不同，可斷裂非共價作用力不同，所以破壞多酚在植物體內形成的氫鍵或疏水鍵不同，因此多酚提取效果不同[16]。甲醇、乙醇、異丙醇溶液既可保持較高的多酚得率，又對蛋白質的溶解度低[17]，有利于后續(xù)蛋白質開發(fā)利用。使用60%乙醇、80%甲醇、70%異丙醇作為提取溶劑，在料液比1∶15、超聲頻率40 kHz、超聲功率150 W、提取溫度30℃、提取時間30 min條件下，考察提取溶劑對多酚和蛋白得率的影響，結果見圖1。

班會主題要有時事效應。班主任除了要保持敏銳性，還要有“防患于未然”的預知性。比如，每年春夏季，開展傳染病防控方面的主題班會；到了秋冬季，就選擇以防寒保暖、防火等為主要內容的主題班會；在學期末，選擇應對考試方面的主題班會……凡此種種，都要求班主任因勢利導，善于隨機應變，具備掌控局勢變遷的能力和水平，使班會隨即產生時事效應。

圖1 提取溶劑對多酚和蛋白得率的影響

由圖1可見：80%甲醇溶液作為提取溶劑，沙棘籽粕多酚得率最高；3種有機溶劑的蛋白得率均很低，說明僅有少量的蛋白質溶出。因此，沙棘籽粕多酚的最佳提取溶劑為80%甲醇溶液。

2.1.2 提取方式對多酚和蛋白得率的影響

在提取溶劑為80%甲醇溶液、料液比1∶15、重復提取2次的條件下，考察提取方式對多酚和蛋白得率的影響，結果見圖2。

注：冷搖提取方式為4℃、150 r/min下提取30 min；超聲提取方式的提取條件為超聲頻率40 kHz、超聲功率150 W、提取時間30 min、提取溫度30℃；恒溫靜置提取方式為在30℃水浴中靜置提取30 min。

圖2 提取方式對多酚和蛋白得率的影響

由圖2可見，超聲提取對沙棘籽粕多酚的提取效果最好，其次為恒溫靜置提取，最后為冷搖提取。這是由于超聲的空化作用使樣品與溶劑接觸更充分，提高了多酚得率[18]。冷搖提取溫度較低，不利于多酚類成分溶出。3種提取方式對蛋白得率的影響不大，蛋白得率均很低。因此，選擇超聲提取作為沙棘籽粕多酚提取的最佳提取方式。

2.1.3 料液比對多酚得率的影響

在80%甲醇溶液為提取溶劑、超聲頻率40 kHz、超聲功率150 W、提取時間30 min、提取溫度30℃條件下，考察料液比對多酚得率的影響，結果見圖3。

由圖3可見，沙棘籽粕多酚得率隨料液比的增加先上升后逐漸趨于平緩，當料液比為1∶20時，多酚得率最高，主要是因為增大溶劑用量有利于多酚物質由原料向溶劑擴散，增加多酚得率，但溶劑用量過大，半纖維素等其他成分的溶出量增多，影響多酚物質的提取[19]。提取溶劑用量過大，回收溶劑處理的時間更長，還會造成一定的資源浪費，增加提取成本，因此最佳料液比為1∶20。

注：圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

2.1.4 提取時間對多酚得率的影響

在80%甲醇為提取溶劑、超聲頻率40 kHz、超聲功率150 W、料液比1∶20、提取溫度30℃條件下，考察提取時間對多酚得率的影響，結果見圖4。

圖4 提取時間對多酚得率的影響

由圖4可見，隨著提取時間的延長，多酚得率呈先上升后下降趨勢。這主要是由于隨著提取時間的延長，多酚溶出量逐漸增多，多酚得率升高，但超聲提取時間過長，溶液溫度升高，多酚的穩(wěn)定性變差，發(fā)生氧化反應或分解反應，造成多酚得率降低[20]。因此，最佳提取時間為20 min。

2.1.5 提取溫度對多酚得率的影響

在80%甲醇為提取溶劑、超聲頻率40 kHz、超聲功率150 W、料液比1∶20、提取時間20 min條件下，考察提取溫度對多酚得率的影響，結果見圖5。

圖5 提取溫度對多酚得率的影響

由圖5可見，隨提取溫度的升高，多酚得率呈先增加后降低的趨勢。這主要是因為隨著提取溫度的升高，多酚溶出量增多，多酚得率增加，但提取溫度過高，多酚穩(wěn)定性降低，發(fā)生氧化或分解反應，造成得率降低。因此，最佳提取溫度為20℃。

2.2 沙棘籽粕多酚提取的正交實驗

通過單因素實驗確定80%甲醇為提取溶劑，采用超聲提取方式，在超聲頻率40 kHz、超聲功率150 W條件下，以料液比、提取溫度和提取時間為因素，多酚得率為指標，進行三因素三水平正交實驗，對多酚提取條件進行優(yōu)化。正交實驗因素與水平見表1，正交實驗設計及結果見表2，方差分析見表3。

表1 正交實驗因素與水平

表2 正交實驗設計及結果

表3 方差分析

由表2可知，影響多酚得率的因素主次順序為料液比>提取時間>提取溫度，最佳提取工藝條件組合為A3B2C2。由表3可知，料液比對多酚得率具有顯著性影響，提取溫度和提取時間影響不顯著。多酚的最佳提取工藝條件為：料液比1∶25，提取溫度20℃，提取時間20 min。在最佳條件下做驗證實驗，多酚得率為(7.83±0.03)%。

2.3 沙棘籽粕多酚的HPLC分析

將質量濃度為1 mg/mL沒食子酸、原兒茶素、表兒茶素、綠原酸、新綠原酸、阿魏酸和質量濃度為0.4 mg/mL的蘆丁、楊梅素、槲皮素、山奈酚、兒茶素的混合多酚標準品溶液以及最佳條件下提取的沙棘籽粕多酚提取液進行HPLC分析，結果如圖6所示。

注：1.沒食子酸；2.原兒茶素；3.新綠原酸；4.兒茶素；5.綠原酸；6.表兒茶素；7.阿魏酸；8.蘆?。?.楊梅素；10.槲皮素；11.山奈酚；12.溶劑峰。

圖6 多酚標準品(A)及沙棘籽粕多酚提取液(B)的HPLC譜圖

由圖6可見，沙棘籽粕多酚提取液中共有6種物質保留時間與標準品溶液的色譜峰保留時間一致，經外標法定量，這6種酚類物質的含量(以沙棘籽粕計)見表4。

表4 沙棘籽粕多酚物質組成與含量

由表4可見，蘆丁含量最高，為(1.623±0.224)mg/g，沒食子酸和楊梅素的含量也較高。沙棘籽粕中被檢測出的多酚物質總含量為4.239 mg/g，而福林-酚法測定結果表明沙棘籽粕中多酚含量為35.9 mg/g。這是由于多酚中含酚羥基的化學結構，而蛋白質分子由于存在多種不同功能的基團，使得多酚與蛋白質之間通過非共價作用(包括氫鍵、離子鍵和疏水相互作用)結合，導致其相對分子質量較大，空間結構復雜，因未能通過超濾膜而未檢出[15]。

2.4 沙棘籽粕多酚的抗氧化性

2.4.1 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基是一種以氮為中心的穩(wěn)定自由基，常用于反映樣品抗氧化能力強弱[21]。沙棘籽粕多酚與VC的DPPH自由基清除能力對比見圖7。

圖7 沙棘籽粕多酚與VC的DPPH自由基清除能力對比

由圖7可見，沙棘籽粕多酚對DPPH自由基的清除作用呈明顯的劑量效應，當多酚質量濃度為0.01 mg/mL時，對DPPH自由基幾乎沒有清除能力，但當多酚質量濃度提高到0.10 mg/mL時，對DPPH自由基清除率達到81.82%，之后繼續(xù)增加多酚質量濃度，對DPPH自由基清除能力增加趨勢放緩，清除率最高為90.08%，沙棘籽粕多酚和VC對DPPH自由基清除作用的半數抑制濃度(IC50)分別為0.057、0.013 mg/mL。

2.4.2 羥自由基清除能力

羥自由基是最活潑的自由基之一，幾乎能與活細胞中的任何分子發(fā)生反應，反應速度快，引發(fā)組織細胞病變而導致各種疾病發(fā)生和加速機體衰老。減少此類自由基，即可達到防衰老、防心血管疾病、抗癌等作用[21]。沙棘籽粕多酚與VC的羥自由基清除能力對比見圖8。

圖8 沙棘籽粕多酚與VC的羥自由基清除能力對比

由圖8可見，沙棘籽粕多酚質量濃度低于0.25 mg/mL時，羥自由基清除率較低，但當沙棘籽粕多酚質量濃度達到0.25 mg/mL時，羥自由基清除率達到93.92%，雖低于VC的98.75%，但沙棘籽粕多酚仍具有較好的羥自由基清除能力。沙棘籽粕多酚和VC對羥自由基清除作用的IC50分別為0.147、0.012 mg/mL。

3 結 論

在單因素實驗的基礎上，通過正交實驗優(yōu)化沙棘籽粕多酚提取的工藝條件，確定多酚的最佳提取工藝條件為：80%甲醇為提取溶劑，超聲提取方式，超聲頻率40 kHz，超聲功率150 W，料液比1∶25，提取溫度20℃，提取時間20 min。在最佳提取條件下，多酚得率為(7.83±0.03)%。通過HPLC法對多酚提取液組分進行分析，共檢測出6種物質，分別為沒食子酸、兒茶素、蘆丁、楊梅素、槲皮素、山奈酚，其中蘆丁含量最高，為(1.623±0.224)mg/g(以沙棘籽粕質量計)?？寡趸Y果顯示，沙棘籽粕多酚提取液具有良好的抗氧化能力。