孔 宇，張倚菲，韓鵬云，韋柳伊，李文華，王禹鶴，趙紫芙，李欣憶，李 超

(天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

沙棘原產(chǎn)于歐亞大陸，是一種耐寒的胡頹子科沙棘屬灌木植物,廣泛生長于印度、中國、巴基斯坦、俄羅斯、英國、德國和法國等國家。沙棘漿果中含有豐富的維生素C、類黃酮、油溶性化合物以及礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)[1]。這些營養(yǎng)性物質(zhì)使沙棘漿果具有特殊的生物活性，可用于治療心血管疾病、癌癥和急性高山病等多種疾病。沙棘籽油含有大量不飽和脂肪酸、生育酚、類胡蘿卜素和黃酮類化合物，具有顯著的抗菌、抗動(dòng)脈粥樣硬化和心臟保護(hù)作用[2-3]。

我國每年沙棘的種植面積為120萬hm2[4]，可收獲115.2萬t沙棘鮮果[5]。每噸沙棘鮮果可產(chǎn)生30 kg沙棘濕籽，提取油脂后會(huì)產(chǎn)生13.8 kg沙棘籽粕，因此沙棘籽粕的年產(chǎn)量達(dá)到1.5萬t[5-6]。沙棘籽粕中含有20%的纖維素、10%的半纖維素和約30%的蛋白質(zhì)[7]。雖然沙棘籽粕中蛋白質(zhì)含量豐富，但由于多酚的存在，蛋白質(zhì)的利用率比較低。崔淼[8]對(duì)沙棘籽粕中的蛋白進(jìn)行了提取及功能性研究，得到的蛋白為褐色粉末，嚴(yán)重影響了蛋白質(zhì)的加工利用。這是由于酚類化合物在堿性條件下被氧化成醌，醌能縮合形成高相對(duì)分子質(zhì)量的褐色素，這些褐色產(chǎn)物保持高活性并易與蛋白質(zhì)中的巰基和氨基結(jié)合，降低蛋白質(zhì)的消化率和利用率[9]。植物多酚是植物細(xì)胞內(nèi)的重要植物色素、抗氧化劑及具有多種功能的保護(hù)因子，具有抑菌、抗腫瘤等作用[10]。本實(shí)驗(yàn)以沙棘籽粕為原料，通過單因素實(shí)驗(yàn)分析結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化沙棘籽粕多酚提取工藝，研究沙棘籽粕多酚組分及抗氧化能力，旨在為沙棘籽粕多酚利用提供理論依據(jù)，并為沙棘籽粕蛋白提取前處理提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

沙棘籽粕，內(nèi)蒙古宇航人高技術(shù)產(chǎn)業(yè)有限責(zé)任公司；牛血清白蛋白、福林酚，北京索萊寶科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250，上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司；沒食子酸、原兒茶素、新綠原酸、兒茶素、綠原酸、表兒茶素、阿魏酸、蘆丁、楊梅素、槲皮素、山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司；其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

Agilent-1260高效液相色譜儀，美國安捷倫儀器公司；JP-031超聲波清洗機(jī)；DF-101型系列集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；德國IKA RV8旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；電子天平；UV-1800紫外可見分光光度計(jì)；XY-FD-27S加熱型冷凍干燥機(jī)；3-18臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國Sigma；1510-01116全波長酶標(biāo)儀，芬蘭Thermo Fisher。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 沙棘籽粕多酚的提取

沙棘籽粕經(jīng)粉碎后過80目篩，用10倍的石油醚浸泡脫脂2 h。取脫脂沙棘籽粕，按一定料液比加入提取溶劑，按一定方式(冷搖，超聲或恒溫靜置)在一定溫度下提取一定時(shí)間，離心取上清液，殘?jiān)貜?fù)提取2次，合并上清液，得到多酚提取液。

1.2.2 多酚含量測(cè)定及得率計(jì)算

參考Okarter等[11]的方法，采用福林-酚法測(cè)定多酚提取液中的多酚含量，按下式計(jì)算多酚得率。

多酚得率=多酚提取液體積×多酚含量/沙棘籽粕質(zhì)量×100%

1.2.3 蛋白質(zhì)含量測(cè)定及得率計(jì)算

采用考馬斯亮藍(lán)法[12]，以牛血清白蛋白含量為橫坐標(biāo)，溶液的吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.764 7x+0.040 1(R2=0.996 9)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程測(cè)得多酚提取液中蛋白質(zhì)含量，按下式計(jì)算蛋白得率。

蛋白得率=多酚提取液體積×蛋白質(zhì)含量/沙棘籽粕質(zhì)量×100%

1.2.4 沙棘籽粕多酚提取液組分分析

將沙棘籽粕多酚提取液濃縮到一定體積后加入甲醇定容，吸取4 mL樣品進(jìn)行超濾(超濾膜截留相對(duì)分子質(zhì)量100 kDa)，透過超濾膜的部分為游離態(tài)酚，過0.45 μm濾膜，采用HPLC測(cè)定有效成分的含量[8]。

HPLC條件：Shim-pack GIST C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；紫外檢測(cè)波長280 nm；流速0.8 mL/min；柱溫30℃；流動(dòng)相以含2%冰醋酸的水溶液和甲醇分別為A相和B相，梯度洗脫。梯度洗脫條件：0～20 min，0～5%B；20～35 min，25%～45%B；35～40 min，40%～40%B；40～41 min，40%～90%B；41～50 min，95%～95%B；50～52 min，95%～5%B；52～55 min，5%～5%B。以標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間對(duì)樣品的色譜峰定性，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量。

1.2.5 沙棘籽粕多酚抗氧化性測(cè)定

沙棘籽粕多酚提取液經(jīng)30℃真空濃縮、冷凍干燥，得到多酚提取物，于-18℃貯藏，用于抗氧化性分析。

參考Zhang等[13]的方法，將樣品配制為多酚質(zhì)量濃度分別為0.01、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/mL的溶液，分別取樣液5 mL，加入2 mmol/L的DPPH乙醇溶液5 mL，混合均勻，置于室溫下避光反應(yīng)30 min。以蒸餾水代替樣品，作為空白組。以無水乙醇5 mL代替2 mmol/L的DPPH乙醇溶液作為對(duì)照組。每組進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。取1 mL反應(yīng)好的溶液，在4℃、6 000 r/min的冷凍離心機(jī)中離心10 min，在96孔板中加入每個(gè)樣品的上清液0.2 mL，并在517 nm處測(cè)定吸光度，按下式計(jì)算DPPH自由基清除率。

1.2.5.2 羥自由基清除能力測(cè)定

參考李順峰等[14]的方法，將樣品配制為多酚質(zhì)量濃度分別為0.01、0.05、0.10、0.25、0.50 mg/mL溶液。依次取5 mmol/L的硫酸亞鐵溶液2 mL、5 mmol/L的水楊酸乙醇溶液2 mL、3 mmol/L的過氧化氫溶液2 mL，均勻混合后加入2 mL樣品溶液，最后用蒸餾水補(bǔ)至10 mL，在37℃下水浴30 min。以蒸餾水代替樣品，作為空白組。以蒸餾水2 mL代替3 mmol/L過氧化氫溶液作為對(duì)照組。每組進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。取1 mL反應(yīng)好的溶液，在4℃、6 000 r/min的冷凍離心機(jī)中離心10 min，在96孔板中加入每個(gè)樣品的上清液0.2 mL，在510 nm處測(cè)定吸光度，按下式計(jì)算羥自由基清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘籽粕多酚提取的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 提取溶劑對(duì)多酚和蛋白得率的影響

多酚因含酚羥基的化學(xué)結(jié)構(gòu)，可與大分子、蛋白質(zhì)或多糖相互結(jié)合，形成非共價(jià)作用結(jié)構(gòu)[15]。不同性質(zhì)的有機(jī)溶劑提取，由于溶劑極性不同，可斷裂非共價(jià)作用力不同，所以破壞多酚在植物體內(nèi)形成的氫鍵或疏水鍵不同，因此多酚提取效果不同[16]。甲醇、乙醇、異丙醇溶液既可保持較高的多酚得率，又對(duì)蛋白質(zhì)的溶解度低[17]，有利于后續(xù)蛋白質(zhì)開發(fā)利用。使用60%乙醇、80%甲醇、70%異丙醇作為提取溶劑，在料液比1∶15、超聲頻率40 kHz、超聲功率150 W、提取溫度30℃、提取時(shí)間30 min條件下，考察提取溶劑對(duì)多酚和蛋白得率的影響，結(jié)果見圖1。

班會(huì)主題要有時(shí)事效應(yīng)。班主任除了要保持敏銳性，還要有“防患于未然”的預(yù)知性。比如，每年春夏季，開展傳染病防控方面的主題班會(huì)；到了秋冬季，就選擇以防寒保暖、防火等為主要內(nèi)容的主題班會(huì)；在學(xué)期末，選擇應(yīng)對(duì)考試方面的主題班會(huì)……凡此種種，都要求班主任因勢(shì)利導(dǎo)，善于隨機(jī)應(yīng)變，具備掌控局勢(shì)變遷的能力和水平，使班會(huì)隨即產(chǎn)生時(shí)事效應(yīng)。

圖1 提取溶劑對(duì)多酚和蛋白得率的影響

由圖1可見：80%甲醇溶液作為提取溶劑，沙棘籽粕多酚得率最高；3種有機(jī)溶劑的蛋白得率均很低，說明僅有少量的蛋白質(zhì)溶出。因此，沙棘籽粕多酚的最佳提取溶劑為80%甲醇溶液。

2.1.2 提取方式對(duì)多酚和蛋白得率的影響

在提取溶劑為80%甲醇溶液、料液比1∶15、重復(fù)提取2次的條件下，考察提取方式對(duì)多酚和蛋白得率的影響，結(jié)果見圖2。

注：冷搖提取方式為4℃、150 r/min下提取30 min；超聲提取方式的提取條件為超聲頻率40 kHz、超聲功率150 W、提取時(shí)間30 min、提取溫度30℃；恒溫靜置提取方式為在30℃水浴中靜置提取30 min。

圖2 提取方式對(duì)多酚和蛋白得率的影響

由圖2可見，超聲提取對(duì)沙棘籽粕多酚的提取效果最好，其次為恒溫靜置提取，最后為冷搖提取。這是由于超聲的空化作用使樣品與溶劑接觸更充分，提高了多酚得率[18]。冷搖提取溫度較低，不利于多酚類成分溶出。3種提取方式對(duì)蛋白得率的影響不大，蛋白得率均很低。因此，選擇超聲提取作為沙棘籽粕多酚提取的最佳提取方式。

2.1.3 料液比對(duì)多酚得率的影響

在80%甲醇溶液為提取溶劑、超聲頻率40 kHz、超聲功率150 W、提取時(shí)間30 min、提取溫度30℃條件下，考察料液比對(duì)多酚得率的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可見，沙棘籽粕多酚得率隨料液比的增加先上升后逐漸趨于平緩，當(dāng)料液比為1∶20時(shí)，多酚得率最高，主要是因?yàn)樵龃笕軇┯昧坑欣诙喾游镔|(zhì)由原料向溶劑擴(kuò)散，增加多酚得率，但溶劑用量過大，半纖維素等其他成分的溶出量增多，影響多酚物質(zhì)的提取[19]。提取溶劑用量過大，回收溶劑處理的時(shí)間更長，還會(huì)造成一定的資源浪費(fèi)，增加提取成本，因此最佳料液比為1∶20。

注：圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)多酚得率的影響

在80%甲醇為提取溶劑、超聲頻率40 kHz、超聲功率150 W、料液比1∶20、提取溫度30℃條件下，考察提取時(shí)間對(duì)多酚得率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)多酚得率的影響

由圖4可見，隨著提取時(shí)間的延長，多酚得率呈先上升后下降趨勢(shì)。這主要是由于隨著提取時(shí)間的延長，多酚溶出量逐漸增多，多酚得率升高，但超聲提取時(shí)間過長，溶液溫度升高，多酚的穩(wěn)定性變差，發(fā)生氧化反應(yīng)或分解反應(yīng)，造成多酚得率降低[20]。因此，最佳提取時(shí)間為20 min。

2.1.5 提取溫度對(duì)多酚得率的影響

在80%甲醇為提取溶劑、超聲頻率40 kHz、超聲功率150 W、料液比1∶20、提取時(shí)間20 min條件下，考察提取溫度對(duì)多酚得率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 提取溫度對(duì)多酚得率的影響

由圖5可見，隨提取溫度的升高，多酚得率呈先增加后降低的趨勢(shì)。這主要是因?yàn)殡S著提取溫度的升高，多酚溶出量增多，多酚得率增加，但提取溫度過高，多酚穩(wěn)定性降低，發(fā)生氧化或分解反應(yīng)，造成得率降低。因此，最佳提取溫度為20℃。

2.2 沙棘籽粕多酚提取的正交實(shí)驗(yàn)

通過單因素實(shí)驗(yàn)確定80%甲醇為提取溶劑，采用超聲提取方式，在超聲頻率40 kHz、超聲功率150 W條件下，以料液比、提取溫度和提取時(shí)間為因素，多酚得率為指標(biāo)，進(jìn)行三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)多酚提取條件進(jìn)行優(yōu)化。正交實(shí)驗(yàn)因素與水平見表1，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 方差分析

由表2可知，影響多酚得率的因素主次順序?yàn)榱弦罕?提取時(shí)間>提取溫度，最佳提取工藝條件組合為A3B2C2。由表3可知，料液比對(duì)多酚得率具有顯著性影響，提取溫度和提取時(shí)間影響不顯著。多酚的最佳提取工藝條件為：料液比1∶25，提取溫度20℃，提取時(shí)間20 min。在最佳條件下做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，多酚得率為(7.83±0.03)%。

2.3 沙棘籽粕多酚的HPLC分析

將質(zhì)量濃度為1 mg/mL沒食子酸、原兒茶素、表兒茶素、綠原酸、新綠原酸、阿魏酸和質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL的蘆丁、楊梅素、槲皮素、山奈酚、兒茶素的混合多酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液以及最佳條件下提取的沙棘籽粕多酚提取液進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果如圖6所示。

注：1.沒食子酸；2.原兒茶素；3.新綠原酸；4.兒茶素；5.綠原酸；6.表兒茶素；7.阿魏酸；8.蘆??；9.楊梅素；10.槲皮素；11.山奈酚；12.溶劑峰。

圖6 多酚標(biāo)準(zhǔn)品(A)及沙棘籽粕多酚提取液(B)的HPLC譜圖

由圖6可見，沙棘籽粕多酚提取液中共有6種物質(zhì)保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品溶液的色譜峰保留時(shí)間一致，經(jīng)外標(biāo)法定量，這6種酚類物質(zhì)的含量(以沙棘籽粕計(jì))見表4。

表4 沙棘籽粕多酚物質(zhì)組成與含量

由表4可見，蘆丁含量最高，為(1.623±0.224)mg/g，沒食子酸和楊梅素的含量也較高。沙棘籽粕中被檢測(cè)出的多酚物質(zhì)總含量為4.239 mg/g，而福林-酚法測(cè)定結(jié)果表明沙棘籽粕中多酚含量為35.9 mg/g。這是由于多酚中含酚羥基的化學(xué)結(jié)構(gòu)，而蛋白質(zhì)分子由于存在多種不同功能的基團(tuán)，使得多酚與蛋白質(zhì)之間通過非共價(jià)作用(包括氫鍵、離子鍵和疏水相互作用)結(jié)合，導(dǎo)致其相對(duì)分子質(zhì)量較大，空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜，因未能通過超濾膜而未檢出[15]。

2.4 沙棘籽粕多酚的抗氧化性

2.4.1 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基是一種以氮為中心的穩(wěn)定自由基，常用于反映樣品抗氧化能力強(qiáng)弱[21]。沙棘籽粕多酚與VC的DPPH自由基清除能力對(duì)比見圖7。

圖7 沙棘籽粕多酚與VC的DPPH自由基清除能力對(duì)比

由圖7可見，沙棘籽粕多酚對(duì)DPPH自由基的清除作用呈明顯的劑量效應(yīng)，當(dāng)多酚質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基幾乎沒有清除能力，但當(dāng)多酚質(zhì)量濃度提高到0.10 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)到81.82%，之后繼續(xù)增加多酚質(zhì)量濃度，對(duì)DPPH自由基清除能力增加趨勢(shì)放緩，清除率最高為90.08%，沙棘籽粕多酚和VC對(duì)DPPH自由基清除作用的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為0.057、0.013 mg/mL。

2.4.2 羥自由基清除能力

羥自由基是最活潑的自由基之一，幾乎能與活細(xì)胞中的任何分子發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)速度快，引發(fā)組織細(xì)胞病變而導(dǎo)致各種疾病發(fā)生和加速機(jī)體衰老。減少此類自由基，即可達(dá)到防衰老、防心血管疾病、抗癌等作用[21]。沙棘籽粕多酚與VC的羥自由基清除能力對(duì)比見圖8。

圖8 沙棘籽粕多酚與VC的羥自由基清除能力對(duì)比

由圖8可見，沙棘籽粕多酚質(zhì)量濃度低于0.25 mg/mL時(shí)，羥自由基清除率較低，但當(dāng)沙棘籽粕多酚質(zhì)量濃度達(dá)到0.25 mg/mL時(shí)，羥自由基清除率達(dá)到93.92%，雖低于VC的98.75%，但沙棘籽粕多酚仍具有較好的羥自由基清除能力。沙棘籽粕多酚和VC對(duì)羥自由基清除作用的IC50分別為0.147、0.012 mg/mL。

3 結(jié) 論

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化沙棘籽粕多酚提取的工藝條件，確定多酚的最佳提取工藝條件為：80%甲醇為提取溶劑，超聲提取方式，超聲頻率40 kHz，超聲功率150 W，料液比1∶25，提取溫度20℃，提取時(shí)間20 min。在最佳提取條件下，多酚得率為(7.83±0.03)%。通過HPLC法對(duì)多酚提取液組分進(jìn)行分析，共檢測(cè)出6種物質(zhì)，分別為沒食子酸、兒茶素、蘆丁、楊梅素、槲皮素、山奈酚，其中蘆丁含量最高，為(1.623±0.224)mg/g(以沙棘籽粕質(zhì)量計(jì))。抗氧化結(jié)果顯示，沙棘籽粕多酚提取液具有良好的抗氧化能力。