趙 雷，趙寶建，冉 程，陳向紅，田從哲

(河北大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，河北 保定 071000)

頭頸鱗狀細(xì)胞癌是耳鼻咽喉-頭頸外科中常見(jiàn)的惡性腫瘤，主要包括喉癌、喉咽癌、口腔癌、鼻咽癌等。據(jù)資料統(tǒng)計(jì)，2015年我國(guó)頭頸鱗狀細(xì)胞癌新發(fā)病例占所有癌癥新發(fā)病例的3.1%，而死亡病例占所有癌癥死亡病例的2.8%[1]。由于癌組織局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，使得頭頸鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后較差，其5年生存率約為50%[2]。因此，進(jìn)一步探求頭頸鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)特異性腫瘤標(biāo)志物及分子治療新靶點(diǎn)則具有極為重要的意義。而微小RNA(microRNA，miRNA)作為重要的生物學(xué)功能調(diào)控分子，在包括頭頸鱗狀細(xì)胞癌在內(nèi)的多種腫瘤中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用[3-5]。而既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-655-3p在食管鱗狀細(xì)胞癌、宮頸癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤中表達(dá)水平降低，并具有重要的抑癌作用[6-8]。然而目前尚未發(fā)現(xiàn)miR-655-3p在頭頸鱗狀細(xì)胞癌中的相關(guān)研究，僅有一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)miR-655-3p在口腔鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)降低，表現(xiàn)出一定程度的抑癌作用[9]。因此，為豐富和完善miRNA在頭頸鱗狀細(xì)胞癌中的相關(guān)研究，本研究進(jìn)一步探討了miR-655-3p在頭頸鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)情況及其臨床意義，對(duì)于深入探討頭頸鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)機(jī)制研究具有重要意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年3月—2019年7月接受手術(shù)但術(shù)前均無(wú)放化療治療史的頭頸鱗狀細(xì)胞癌患者(耳鼻咽喉科、口腔科、頭頸外科)41例，其中男性37例，女性4例，年齡42～71歲，中位年齡57歲，有吸煙史33例，有飲酒史26例，低分化11例，中-高分化30例，伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例，早期(Ⅰ～Ⅱ)頭頸鱗狀細(xì)胞癌患者13例，晚期(Ⅲ～Ⅳ)患者28例。樣本癌組織取自非壞死瘤體組織，癌旁正常組織取自距瘤體手術(shù)切緣3 mm(聲門(mén)型喉鱗狀細(xì)胞癌)、5 mm(其他部位頭頸鱗狀細(xì)胞癌)，各樣本組織類(lèi)型均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)。所有樣本均由河北大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科負(fù)責(zé)收集并儲(chǔ)存于-80 ℃低溫冰箱(Haier，中國(guó))。

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2方法 所納入研究各組織樣本，總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄均依照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟完成。其中總RNA提取試劑盒(Promega，美國(guó))用于各組織樣本中總RNA的提取，分光光度計(jì)(Thermo，美國(guó))用于RNA濃度及純度檢測(cè)，1%瓊脂糖凝膠電泳(含DEPC)法用于RNA完整性檢測(cè)。質(zhì)控合格的各組織樣本總RNA，部分RNA樣本儲(chǔ)存于-80 ℃低溫冰箱，部分用于反轉(zhuǎn)錄。其中反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Roche，德國(guó))和普通PCR儀(BIO-RAD，美國(guó))用于RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA的合成，而cDNA濃度及純度通過(guò)分光光度計(jì)(Thermo，美國(guó))檢測(cè)。

1.3miR-655-3p相對(duì)表達(dá)水平的檢測(cè) 基于所獲得組織樣本的cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)方法，通過(guò)qRT-PCR 試劑盒(Promega，美國(guó))和qRT-PCR儀(BIO-RAD，美國(guó))檢測(cè)各樣本中miR-655-3p的相對(duì)表達(dá)水平。以U6作為內(nèi)參照，以2-△△ct值代表各組織樣本中miR-655-3p相對(duì)表達(dá)量。相關(guān)miR-655-3p及內(nèi)參U6引物參照既往研究[10]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用配對(duì)獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1頭頸鱗狀細(xì)胞癌中miR-655-3p表達(dá)水平 通過(guò)qRT-PCR的方法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在41對(duì)頭頸鱗狀細(xì)胞癌組織樣本中，有26對(duì)頭頸鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-655-3p相對(duì)表達(dá)水平較配對(duì)癌旁正常組織降低(圖1)。表達(dá)水平總體分析發(fā)現(xiàn)，與配對(duì)癌旁正常組織中表達(dá)水平(4.849±2.485)相比，miR-655-3p在頭頸鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)水平明顯降低(4.475±2.168)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.217，P=0.032)。

圖1 頭頸鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-655-3p表達(dá)水平分布情況

Figure 1 Expression of miR-655-3p in head and neck squamous cell carcinoma

2.2不同臨床特征的頭頸鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-655-3p的表達(dá)情況 依據(jù)癌組織中miR-655-3p表達(dá)水平的中位數(shù)(4.565)，分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。各組在不同性別、年齡、是否吸煙、是否飲酒者之間構(gòu)成比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而低表達(dá)組晚期(Ⅲ～Ⅳ)構(gòu)成為主(P=0.034)；2組在組織分化、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移臨床特征組中，構(gòu)成比不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同臨床特征頭頸鱗狀細(xì)胞癌患者組織中miR-655-3p低表達(dá)率的比較Table 1 Comparison of miR-655-3p in different clinical features of head and neck squamous cell carcinoma (例數(shù)，%)

*采用連續(xù)校正卡方

3 討 論

作為生物學(xué)功能調(diào)控分子，miRNA是一類(lèi)微小、非編碼RNA，長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸大小，往往以經(jīng)典的靶向結(jié)合方式在胞漿中發(fā)揮作用，通過(guò)其自身種子區(qū)與靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)以堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式結(jié)合，進(jìn)而引起靶mRNA的翻譯抑制或降解，而某些成熟miRNA可以被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)并在核內(nèi)發(fā)揮某種生物學(xué)調(diào)控作用[11]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在神經(jīng)退行性相關(guān)疾病[12]、低氧誘導(dǎo)的心肌損傷[13]、腫瘤微環(huán)境[14]、癌細(xì)胞干性維持[15]、腫瘤表觀遺傳學(xué)調(diào)控[16]及腫瘤進(jìn)展[17]等多種生物學(xué)過(guò)程中具有重要的生物學(xué)作用，包括抗癌治療相關(guān)研究[18]。隨著相關(guān)研究的逐步深入，miRNA在頭頸鱗狀細(xì)胞癌中的功能與作用機(jī)制研究同樣取得了一定的進(jìn)展，其在頭頸鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)改變，從而參與了頭頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展，并與頭頸鱗狀細(xì)胞癌患者生存預(yù)后相關(guān)[19-20]。如有研究報(bào)道，miR-205-5p在頭頸鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)增高，并與患者無(wú)復(fù)發(fā)生存率相關(guān)，具有一定的臨床預(yù)后作用，相關(guān)機(jī)制研究提示其通過(guò)靶向抑制BRCA1 DNA repair associated和RAD17 checkpoint clamp loader component基因的表達(dá)，從而降低DNA損傷修復(fù)能力，并增加染色體不穩(wěn)定，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)[21]。而miR-125a-5p作為腫瘤抑制因子，能夠通過(guò)靶向調(diào)控erb-b2受體酪氨酸激酶2 mRNA的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的增殖和對(duì)離子輻射的敏感性，其低表達(dá)水平與頭頸鱗狀細(xì)胞癌患者局部復(fù)發(fā)和不良預(yù)后有關(guān)[3]。另有研究發(fā)現(xiàn)，miR-4295在頭頸鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)增高，其表達(dá)與患者生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，并能夠靶向抑制神經(jīng)元正五聚蛋白1 mRNA的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)頭頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移能力及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程，與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)[22]。有資料統(tǒng)計(jì)，全世界每年大約新增600 000例頭頸鱗狀細(xì)胞癌患者，同時(shí)有40%～50%的頭頸鱗狀細(xì)胞癌患者死亡，由于缺乏有效提高患者生存率及個(gè)性化的治療方案，其預(yù)后較差，因此，深入探究其發(fā)病機(jī)制，篩選特異性腫瘤標(biāo)志物或靶向治療的新靶點(diǎn)，成為頭頸鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)分子機(jī)制研究的重點(diǎn)[23]。為豐富和完善頭頸鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)研究，本研究擬從miRNA這一重要的分子水平，探究頭頸鱗狀細(xì)胞癌中具有重要生物學(xué)作用的miRNA及其可能的發(fā)病機(jī)制?；诖搜芯磕康?，通過(guò)檢索miR-655-3p相關(guān)的既往研究，發(fā)現(xiàn)miR-655-3p作為抑癌因子，在食管鱗狀細(xì)胞癌患者血漿中表達(dá)水平降低，且其低表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的淋巴管侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期相關(guān)，能夠抑制食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程，并與患者不良預(yù)后相關(guān)[6]。另有研究發(fā)現(xiàn)，miR-655-3p通過(guò)靶向抑制配對(duì)盒基因6 mRNA的表達(dá)，抑制ERK/p38 MAPK信號(hào)通路的活性，從而抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的惡性表型，如抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等[10]。Zhao等[24]報(bào)道，miR-655-3p在上皮源性卵巢癌中表達(dá)降低，通過(guò)靶向抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子mRNA的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力，進(jìn)而抑制上皮源性卵巢癌的進(jìn)展。MiR-655-3p在多種腫瘤中表現(xiàn)出不同程度的抑癌作用，提示雖然作用機(jī)制不同，但其生物學(xué)抑制作用具有泛癌性，可能在包括頭頸鱗狀細(xì)胞癌在內(nèi)的其他多種腫瘤中具有類(lèi)似的抑癌作用。而有關(guān)口腔鱗狀細(xì)胞癌的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，miR-655-3p通過(guò)靶向作用于metadherin抑制PTEN/AKT信號(hào)通路，從而表現(xiàn)出抑制腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲等抑癌功能[9]?；谝陨霞韧芯康木C合分析，提示miR-655-3p作為重要的抑癌因子在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，從而促進(jìn)了腫瘤惡性表型的進(jìn)展。因此，推測(cè)miR-655-3p可能在頭頸鱗狀細(xì)胞癌中同樣具有某種抑癌作用，呈低表達(dá)趨勢(shì)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-655-3p在頭頸鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)降低，且在不同臨床分期、組織分化程度及是否伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織樣本中表達(dá)水平存在差異。而miR-655-3p在具有不同臨床病理特征組織樣本中的差異表達(dá)，提示其在頭頸鱗狀細(xì)胞癌中具有潛在的臨床意義及可能的生物學(xué)作用。頭頸鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-655-3p表達(dá)失活，從而誘導(dǎo)了癌的發(fā)生和進(jìn)展，為靶向治療相關(guān)研究提供了一定的參考。

本研究首次探討了miR-655-3p在頭頸鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床相關(guān)性，對(duì)于深入研究頭頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制及其靶向治療具有重要意義。