楊德翠,徐 青,趙方貴,柳 冕,劉 新

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山東省高校植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266109； 2.武漢海稻國際生物科技有限公司,湖北 武漢 430000)

鹽脅迫對植物氮代謝的影響在分子水平上也初步進(jìn)行研究,Lü 等[10]研究了鰻草在NaCl脅迫下的轉(zhuǎn)錄組,發(fā)現(xiàn)鹽脅迫后鰻草的NR、NiR基因表達(dá)顯著上調(diào)。相比鹽脅迫下氮代謝酶活性的研究,氮代謝相關(guān)基因在鹽脅迫后的表達(dá)變化報(bào)道較少。

水稻是重要的糧食作物,鹽脅迫下氮代謝調(diào)節(jié)機(jī)制將對整個生命活動起到重要作用,但鹽脅迫下氮代謝整個過程的研究還不夠系統(tǒng)、深入,特別是不同抗性品種氮代謝相關(guān)基因在鹽脅迫下差異表達(dá)有待研究。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及培養(yǎng)

1.1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)選用抗性粳稻(Oryzasativasubsp. Keng)品種東稻4號以及鹽敏感品種日本晴(OryzasativaL.spp.japonica)。

將水稻種子用0.1%的HgCl2消毒10 min,用蒸餾水沖洗3～4次,于蒸餾水中浸泡12 h,然后將種子置于培養(yǎng)皿中,在28 °C恒溫培養(yǎng)箱中催芽萌發(fā)。

將萌發(fā)后種子置于96孔板中進(jìn)行水培,培養(yǎng)液為1/4 Hoagland營養(yǎng)液(pH值6.0),光周期/黑暗為14 h/10 h,溫度29 ℃/25 ℃。培養(yǎng)12 d后進(jìn)行鹽脅迫處理。

1.1.2 試驗(yàn)材料的處理 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生理實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)表明,在0.3%的NaCl脅迫下2個水稻品種有顯著差異,因此,鹽處理液用1/4 Hoagland營養(yǎng)液配制成0.3%的NaCl溶液,對照組為1/4 Hoagland營養(yǎng)液。每天更換一次培養(yǎng)液。處理24 h,取根和葉用于基因的檢測；4 d后,對水稻幼苗葉和根進(jìn)行取樣,用于相關(guān)生理指標(biāo)的測定,所取材料保存于-80 ℃超低溫冰箱中。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 氮相關(guān)物質(zhì)含量的測定 銨態(tài)氮含量測定采用茚三酮顯色法[11],硝態(tài)氮含量測定采用水楊酸-硫酸顯色法[12]。

1.2.2 氮代謝相關(guān)酶活性的測定 硝酸還原酶活性參照施晟璐等[13]的方法,谷氨酰胺合成酶GS活性測定參照劉麗等[14]的方法；谷氨酸合成酶NADH-GOGAT及谷氨酸脫氫酶GDH活性測定,參照林清華等[15]的方法；谷氨酸合成酶Fd-GOGAT的測定參照滕祥勇[16]的方法；天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶AST活性測定參照梁成剛等[17]的方法。

1.2.3 氮代謝基因表達(dá)量測定 采用改良TRIzol法提取總RNA[18]。利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測氮代謝相關(guān)基因,包括硝酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因OsNRT1;1、OsNRT1;5、OsNRT1;8和OsNRT2;1,銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因OsAMT1;1和OsAMT1;2,硝酸還原酶基因OsNR1,谷氨酰胺合成酶基因OsGS1;2及谷氨酸合酶基因OsNADH-GOGAT和OsFd-GOGAT以及天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因OsAS。水稻基因名稱和引物設(shè)計(jì)見表1。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃ 30 s；95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40個循環(huán)；從72 ℃至99 ℃,第1步維持45 s,以后每升高1 ℃維持5 s,按2-ΔΔCT方法計(jì)算。

表1 基因定量表達(dá)引物序列Tab.1 The primers sequences for quantitative expression of genes

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)至少3次重復(fù),用Excel數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)作圖,用SAS V8對測定結(jié)果進(jìn)行顯著性分析,不同小寫字母的差異代表在P<0.05水平上顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl脅迫對不同抗性水稻氮含量的影響

不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。圖2-7同。 Different lowercase letters represents significant difference among treatments(P<0.05).The same as Fig.2-7。

2.2 NaCl脅迫對不同抗性水稻硝酸還原酶(NR)活性的影響

2.3 NaCl脅迫對不同抗性水稻氨同化相關(guān)酶活性的影響

圖2 NaCl脅迫下不同品種水稻根和葉中NR活性的變化Fig.2 Changes of nitrate reductase activity in roots and leaves of different rice varieties under NaCl stress

圖3 NaCl脅迫下不同品種水稻根和葉中氨同化相關(guān)酶活性的變化Fig.3 Changes of ammonium assimilation enzymes in roots and leaves of different rice varieties under NaCl stress

2.4 NaCl脅迫對不同抗性水稻氮代謝相關(guān)基因相對表達(dá)量的影響

圖4 NaCl脅迫下不同品種水稻根和葉中硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(OsNRTs)相對表達(dá)量的變化Fig.4 Changes of OsNRTs relative expression in roots and leaves of different rice varieties under NaCl stress

圖5 NaCl脅迫下不同品種水稻根和葉中銨態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(OsAMTs)基因相對表達(dá)量的變化Fig.5 Changes of OsAMTs relative expression in roots and leaves of different rice varieties under NaCl stress

圖6 NaCl脅迫下不同品種水稻根和 葉中硝酸還原酶基因相對表達(dá)量的變化Fig.6 Changes of OsNR1 relative expression in roots and leaves of different rice varieties under NaCl stress

3 討論

圖7 NaCl脅迫下不同品種水稻根和葉中氨同化相關(guān)酶基因表達(dá)量的變化Fig.7 Changes of relative expression of genes involved in ammonium assimilation in roots and leaves of different rice varieties under NaCl stress

對氮代謝相關(guān)基因表達(dá)量進(jìn)行研究,Cai等[30]發(fā)現(xiàn),谷氨酰胺合成酶基因OsGS1;2過表達(dá)突變體能增強(qiáng)對非生物脅迫的抵抗能力。本研究表明,OsGS1;2在NaCl脅迫后顯著升高,與王歡[25]研究結(jié)果較一致。主要在根部表達(dá)的谷氨酸合酶基因OsNADH-GOGAT和在葉部表達(dá)的OsFd-GOGAT鹽脅迫后都升高,以保持在鹽脅迫下的GOGAT酶活性,東稻4號OsGS/OsFd-GOGAT表達(dá)量在脅迫條件下均高于日本晴,這與東稻4號GS/GOGAT酶活性高于日本晴相一致,同時升高表達(dá)量的還有OsAS基因,而Wang等[24]發(fā)現(xiàn),水稻不同抗性品種在鹽堿脅迫后OsNADH-GOGAT、OsFd-GOGAT、OsAS都有顯著降低。

本研究中根和葉部酶活性變化基本一致,不同基因在不同部位表達(dá)存在差異,但結(jié)果也表明,品種抗性與氮代謝相關(guān)基因表達(dá)量密切相關(guān),也為進(jìn)一步研究鹽脅迫下氮代謝相關(guān)基因提出了必要性。

綜合來看,抗性品種東稻4號在鹽脅迫下保持了較高的氮代謝酶活性及較穩(wěn)定的氮代謝方式,這也許是抗性水稻耐鹽的一個重要原因。