周俊飛,高利芬,汪偉航,陳利紅,方治偉,李 論,李甜甜,彭 海

(江漢大學(xué) 系統(tǒng)生物學(xué)研究院,湖北 武漢 430056)

水稻是人類賴以生存的主要糧食作物之一,稻米品質(zhì)一直備受水稻育種家的關(guān)注,也是水稻品種改良的主要方向,其中香味是最受消費(fèi)者歡迎的一個(gè)重要蒸煮品質(zhì)。稻米的香味主要來源于一類揮發(fā)性物質(zhì)-2-乙?；?1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline, 2AP)[1],因此2AP含量成為衡量稻米香味的重要指標(biāo)。研究表明,當(dāng)甜菜醛脫氫酶基因Badh2功能缺失時(shí),合成2AP的前體物質(zhì)氨基丁醛積累,并轉(zhuǎn)化成吡咯啉,與乙?；鶊F(tuán)結(jié)合形成2-乙?；?吡咯啉,從而使2AP含量增多[2-3]。因此,可通過對(duì)Badh2基因進(jìn)行遺傳改造,實(shí)現(xiàn)對(duì)水稻香味品質(zhì)的遺傳改良。

傳統(tǒng)的雜交育種方法改良水稻的香味品質(zhì)需要數(shù)年的雜交選育,而且選育過程中不可避免地會(huì)引入其他非目的性狀,耗時(shí)費(fèi)力?；蚓庉嫾夹g(shù)的興起和不斷發(fā)展,為香稻育種提供了新途徑,使得定向編輯基因、快速獲得具有理想性狀的品種成為可能。近年來,最主要的基因編輯技術(shù)包括人工介導(dǎo)的鋅指核酸酶技術(shù)(Zinc finger nucleases, ZFNs)[4]、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)核酸酶技術(shù)(Transcription activator-like effectors nucleases, TALENs)[5]和規(guī)律成簇的間隔回文重復(fù)相關(guān)蛋白技術(shù)(CRISPR/Cas9)[6-7],其中CRISPR/Cas9技術(shù)具有靈活高效的特點(diǎn),成為最受歡迎的基因編輯工具,發(fā)展最為迅速,應(yīng)用范圍最廣。高彩霞課題組利用TALEN技術(shù)成功獲得badh2突變體,突變體的香味物質(zhì)含量明顯提高[8]。然而TALEN技術(shù)在構(gòu)建載體時(shí)過程較為繁雜,需要將多個(gè)重復(fù)單元進(jìn)行克隆并串聯(lián)起來,構(gòu)建難度大,成本高。因此,邵高能等[9]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)Badh2基因進(jìn)行編輯,也成功獲得香味物質(zhì)提高的突變體材料。目前所知,香稻的badh2基因突變類型有2種,一種是在第2個(gè)外顯子上存在7 bp的堿基缺失,另一種是在第7個(gè)外顯子上缺失8 bp,這2種堿基缺失均會(huì)造成移碼突變,使Badh2不表達(dá),功能缺失[10-11]。以上研究表明,通過對(duì)Badh2基因進(jìn)行靶向編輯以改良水稻的香味品質(zhì)是切實(shí)可行的。

超級(jí)稻品種龍粳31是由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院育成,具有早熟、高產(chǎn)、抗稻瘟病、抗倒伏、耐寒等諸多優(yōu)良性狀[12-13],因其綜合性狀表現(xiàn)突出,近年來成為黑龍江省種植面積最大的水稻品種,但沒有明顯的香味,食味品質(zhì)有提升空間。

本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng),對(duì)龍粳31品種的Badh2基因進(jìn)行靶向編輯,在T1選育出純合的、無轉(zhuǎn)基因序列遺留且香味品質(zhì)明顯改良的香稻株系,創(chuàng)制具有香味的龍粳31品種,不僅提高了龍粳31的食味品質(zhì),也為香稻品種育種提供了很好的育種材料,本研究具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 植物材料

水稻轉(zhuǎn)化受體材料是超級(jí)稻品種龍粳31,受體材料種植于湖北省武漢市實(shí)驗(yàn)基地,與武漢地區(qū)的早稻種植時(shí)間一致,常規(guī)田間種植管理。

1.2 載體構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化

根據(jù)水稻基因組注釋網(wǎng)址(http://rice.plantbiology.msu.edu/)提供的Badh2基因(登錄號(hào)LOC_Os08g32870)序列信息,設(shè)計(jì)sgRNA-E2和sgRNA-E32個(gè)靶位點(diǎn),靶位點(diǎn)sgRNA-E2跨Badh2基因的第2個(gè)內(nèi)含子和第2個(gè)外顯子(20380166-20380188),靶位點(diǎn)sgRNA-E3位于第3外顯子(20381374-20381396)(圖1),靶序列長20 bp,其后面是PAM序列(Protospacer adjacent motif)NGG,2個(gè)靶位點(diǎn)均位于現(xiàn)有香稻品種突變位置的上游,使獲得有效突變的概率更大。載體構(gòu)建參照Gao等[14]的方法,簡述如下：以含U6表達(dá)框的載體pCXUN-Cas9/U6為模板進(jìn)行2輪PCR擴(kuò)增,第1輪用引物對(duì)sgRNA-E2-F和OsU6-R進(jìn)行擴(kuò)增,第2輪用sgRNA-E2-R和OsU6-F進(jìn)行擴(kuò)增；將2輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合,以O(shè)sU6-F和OsU6-R為引物進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物連接到用KpnⅠ酶切后的pCXUN-Cas9載體骨架上,獲得最終的表達(dá)載體pCXUN-Cas9-E2。sgRNA-E3的表達(dá)載體pCXUN-Cas9-E3構(gòu)建方法同pCXUN-Cas9-E2。通過酶切和測序確定表達(dá)載體是否構(gòu)建成功。將正確的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。植物受體材料的遺傳轉(zhuǎn)化由杭州百格生物技術(shù)有限公司完成。

圖1 2個(gè)靶位點(diǎn)在Badh2基因上的位置Fig.1 Positions of the two target sites of the gRNA in Badh2

1.3 轉(zhuǎn)基因陽性水稻株系檢測及突變植株的篩選

用CTAB法提取野生型龍粳31和轉(zhuǎn)基因T0植株葉片的基因組DNA,用潮霉素引物Hpt-F/Hpt-R(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,鑒定轉(zhuǎn)基因陽性單株。

在2個(gè)gRNA的靶位點(diǎn)上下游分別設(shè)計(jì)引物GPE2-F/GPE2-R和GPE3-F/GPE3-R(表1),對(duì)2個(gè)靶位點(diǎn)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pEASY-T載體后,每個(gè)單株選10個(gè)單克隆用M13F通用引物進(jìn)行Sanger測序。突變體和野生型的測序結(jié)果用MEGA 6軟件進(jìn)行序列比對(duì)。

1.4 突變體中Badh2基因表達(dá)情況

針對(duì)水稻Badh2基因的CDS序列,用在線引物設(shè)計(jì)工具Primer-Blast(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物QBadh2-F/QBadh2-R(表1)。用TRIzol法提取野生型和突變株系成熟植株葉片的總RNA,用DNase Ⅰ消化總RNA中殘留的DNA之后,以O(shè)ligo(dT)18為引物,按照M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(NEB,英國)的使用說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用SYRB GREEN方法對(duì)Badh2在野生型和突變體中的表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量,以水稻Ubiquitin基因作為內(nèi)參基因,用TransStart?TipTop Green qPCR SuperMix reagent(全式金,北京)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng),qPCR儀為ABI StepOne Plus。數(shù)據(jù)處理采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[15]。用Student′st-test方法計(jì)算Badh2基因在野生型和突變體中表達(dá)的差異顯著性。

表1 所用引物列表Tab.1 List of primers used in this study

1.5 香味物質(zhì)測定

用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)測定香稻特征化合物2-乙酰-1-吡咯啉(2AP)的含量。方法參照Bergman等[16],用2AP和2,4,6-三甲基吡啶(2,4,6-trimethylpyridine, TMP)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。取2 g T1水稻種子脫殼,研磨成粉末置于頂空瓶中,加入TMP作為內(nèi)標(biāo)物,在Agilent 7890氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀上檢測。色譜柱為HP-INNOWax(32 m×250 μm×0.25 μm),色譜及質(zhì)譜條件參照應(yīng)興華等[17],檢測工作由上海百趣生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。

1.6 轉(zhuǎn)基因T1突變體農(nóng)藝性狀調(diào)查

龍粳31是超級(jí)稻品種,在改良稻米香味的同時(shí),不能破壞該品種原有的優(yōu)良性狀。因此,統(tǒng)計(jì)并分析了T0突變單株的自交后代群體的基本農(nóng)藝性狀,株高、有效分蘗數(shù)和千粒質(zhì)量。每個(gè)株系選10個(gè)單株,測量株高,記錄有效分蘗數(shù)、千粒質(zhì)量的計(jì)算方式是隨機(jī)選取300粒飽滿的種子稱質(zhì)量,然后換算成千粒質(zhì)量。

1.7 無轉(zhuǎn)基因序列的突變株鑒定

對(duì)6個(gè)突變株系的T1單株用引物Hpt-F/Hpt-R和Cas9-F/Cas9-R(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,2對(duì)引物都不能擴(kuò)增出載體目的片段的植株為無轉(zhuǎn)基因序列的突變株。同時(shí)用靶位點(diǎn)擴(kuò)增引物GPE2-F/GPE2-R和GPE3-F/GPE3-R(表1)檢測T1植株的突變情況。

所有結(jié)果用Graphpad軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體的獲得及靶位點(diǎn)突變類型分析

提取轉(zhuǎn)基因植株葉片的基因組DNA,用潮霉素特異引物檢測T0轉(zhuǎn)基因植株,2個(gè)轉(zhuǎn)化載體pCXUN-Cas9-E2和pCXUN-Cas9-E3分別獲得轉(zhuǎn)基因陽性單株7,4株(圖2-A)。

進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)基因陽性植株的突變類型進(jìn)行分析,現(xiàn)有報(bào)道將CRISPR/Cas9技術(shù)獲得的突變體分為三類：純合突變、復(fù)雜雜合突變和雙等位突變[18]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖2-B),在轉(zhuǎn)基因T0獲得2個(gè)純合突變株badh2-E2-6和badh2-E2-11,4個(gè)雙等位突變株badh2-E2-9、badh2-E2-13、badh2-E3-6和badh2-E3-14,這些株系的突變類型包括堿基缺失堿基插入、堿基突變。所有的突變均出現(xiàn)在gRNA區(qū)間,純合突變株badh2-E2-6缺失7 bp,badh2-E2-11株插入8 bp；雙等位突變株badh2-E2-9缺失7,2 bp,badh2-E3-6株插入1 bp(A/T),badh2-E3-14株缺失1 bp和插入1 bp。其中,badh2-E2-13出現(xiàn)不同程度的大片段缺失,在靶位點(diǎn)上下游分別缺失64,108 bp。

A.潮霉素基因PCR檢測；B.T0突變位點(diǎn)序列分析。M.Marker DL2000；P.質(zhì)粒；WT.野生型；E2-6、E2-9、E2-11、E2-13、E3-6、E3-14.Badh2的突變體。黑色粗體大寫字母為靶位點(diǎn)序列,帶下劃線的字母為PAM序列；加粗小寫字母.堿基插入或突變；-.堿基缺失。Ho.純合突變；di.雙等位突變。圖3-4同。

A.PCR detectingHpt; B.Sequence analysis of T0mutation sites.M. Marker DL2000; P.Plasmid; WT.Wild type;E2-6,E2-9,E2-11,E2-13,E3-6,E3-14.Indicates mutant ofBadh2. The target site is shown in bold capital letters; The underlined letter is the PAM sequence; Bold lowercase letter.Base insertion or mutation; Bolddashes.Deleted base. Ho.Homozygote; di.Di-allelic mutations.The same as Fig.3-4.

圖2 T0突變位點(diǎn)序列分析
Fig.2 Sequence analysis of T0mutation sites

2.2 突變體中Badh2基因的表達(dá)量顯著降低

基因組水平上Badh2基因的突變體在靶位點(diǎn)處發(fā)生了堿基變化,為了檢測這種變化在轉(zhuǎn)錄水平上是否延續(xù),進(jìn)一步檢測了Badh2基因在突變體和野生型植株的表達(dá)情況。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示(圖3-A)：在突變體中,Badh2基因的表達(dá)量相對(duì)野生型顯著下調(diào)。其中在badh2-E2-6、badh2-E2-9、badh2-E2-11、badh2-E2-13、badh2-E3-6和badh2-E3-14的表達(dá)相比野生型差異顯著(P<0.05),表明2個(gè)靶點(diǎn)的突變能顯著降低Badh2基因的表達(dá)。

2.3 香味物質(zhì)含量的測定

利用氣相質(zhì)譜聯(lián)用的方法測定部分突變體的香味物質(zhì)2AP含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖3-B),這些突變體的2AP濃度在0.032～0.098 mg/kg,badh2-E2-6、badh2-E2-9、badh2-E2-11、badh2-E2-13、badh2-E3-6這5個(gè)株系較野生型差異顯著(P<0.05),與應(yīng)興華等[17]測定的結(jié)果相符。其中,突變體badh2-E2-13相比野生型2AP的含量提高了4倍,相比對(duì)照香稻品種信香粳1號(hào)提高了1倍,顯著提高了香味物質(zhì)的含量。

A.突變體Badh2基因的表達(dá)情況；B.突變體中香味物質(zhì)(2AP)的含量測定。 XJ-1.信香粳1號(hào)。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖4同。 A.The expression of Badh2 in the mutants; B.The content determination of aroma components (2AP). XJ-1.Xinxiangjing 1.Different lowercase letter indicate significant differences(P<0.05).The same as Fig.4.

2.4 突變體農(nóng)藝性狀調(diào)查

為了確定在編輯Badh2基因的同時(shí)是否對(duì)受體材料的其他農(nóng)藝性狀尤其是產(chǎn)量相關(guān)性狀造成影響,調(diào)查了6個(gè)突變株系T1的株高、分蘗數(shù)和千粒質(zhì)量。統(tǒng)計(jì)分析表明,株高和有效分蘗數(shù)沒有差異,有3個(gè)株系的千粒質(zhì)量在P<0.05水平差異顯著(圖4)。綜合農(nóng)藝性狀的調(diào)查結(jié)果,篩選出3個(gè)株系(badh2-E2-6、badh2-E2-9、badh2-E3-6),在香味品質(zhì)較野生型均顯著改良的同時(shí),其他主要農(nóng)藝性狀和受體保持一致,對(duì)這3個(gè)株系分單株套袋收種,用于后續(xù)的繁種和育種應(yīng)用。

圖4 T1突變體與野生型農(nóng)藝性狀調(diào)查Fig.4 Investigation of agronomic traits in wild type and T1 mutants

2.5 無轉(zhuǎn)基因序列遺留的突變體獲得

轉(zhuǎn)基因序列在突變體中的存在會(huì)對(duì)其繼續(xù)進(jìn)行基因編輯,為了得到能穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因突變體,在T1中對(duì)無標(biāo)記基因Hpt和載體骨架序列整合的單株進(jìn)行篩選?？偣舱{(diào)查了6個(gè)突變體的T1單株,絕大部分單株的轉(zhuǎn)基因元件與突變靶點(diǎn)發(fā)生分離,共篩選到Cas9和Hpt基因檢測陰性的單株10株(表2),badh2-E3-14株系沒有獲得無轉(zhuǎn)基因序列的單株。進(jìn)一步檢測這些不含轉(zhuǎn)基因序列的突變單株的突變情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖5),在T0表現(xiàn)為純合突變的單株badh2-E2-6,其后代的突變與T0保持一致；突變株badh2-E2-9的T13個(gè)單株均為純合突變(PCR產(chǎn)物測序峰圖為單峰),其中2株表現(xiàn)為缺失7 bp,1株為缺失2 bp；badh2-E3-6的T1分別檢測到2株純合單株,均表現(xiàn)為插入1 bp(A/T),與T0突變類型保持一致。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)突變株系badh2-E2-11和badh2-E2-13的T1與T0的突變沒有保持一致,badh2-E2-11-3表現(xiàn)為缺失7 bp,badh2-E2-13檢測到2種純合單株,缺失19 bp和缺失50 bp,仍然存在大片段缺失(圖5)。將10個(gè)篩選到的無轉(zhuǎn)基因元件的純合單株套袋收種。

注：+.檢測到；-.未檢測到。

Note：+.Cas9orHptdetected;-.Cas9orHptnot detected.

WT.野生型；E2-6-4、E2-9-3、E2-11-3、E2-13-1、E2-13-5、E3-6-2、E3-6-7.Badh2突變體的T1單株。m.堿基突變。 WT.Wild type; E2-6-4，E2-9-3，E2-11-3，E2-13-1，E2-13-5，E3-6-2，E3-6-7.T1 of Badh2 mutants. m.Base mutation.

3 討論與結(jié)論

稻米的蒸煮品質(zhì)是水稻改良育種的一個(gè)主要方向,香味是其中一個(gè)最重要的食味品質(zhì)。獲得香稻的傳統(tǒng)育種方法是通過與香稻品種進(jìn)行雜交選育,再經(jīng)過多年的回交獲得性狀穩(wěn)定的純合品種。此過程繁雜,而且費(fèi)時(shí)費(fèi)力,易與產(chǎn)量、抗病等性狀產(chǎn)生連鎖累贅,導(dǎo)致選育結(jié)果不理想。已有研究報(bào)道,利用RNAi和TALEN技術(shù)對(duì)水稻Badh2基因進(jìn)行編輯[8, 19],有助于加快香稻育種進(jìn)程。近年來興起的CRISPR/Cas9技術(shù)能靶向編輯目標(biāo)基因,快速穩(wěn)定的獲得可遺傳的突變,可實(shí)現(xiàn)單堿基變異,可在轉(zhuǎn)基因當(dāng)代就可以獲得純合突變[20],該體系已經(jīng)成功應(yīng)用于動(dòng)植物中,在水稻中的應(yīng)用也日漸成熟[21]。

中國水稻育種經(jīng)歷高產(chǎn)、超高產(chǎn)到超級(jí)稻,單產(chǎn)不斷突破,但是存在高產(chǎn)不優(yōu)質(zhì)的普通問題[22]。本研究中選用的受體材料是超級(jí)稻品種龍粳31,是我國年種植面積最大的超級(jí)稻品種,具有高產(chǎn)、抗病、抗倒伏等優(yōu)良性狀,但是稻米香味不明顯。邵高能等[9]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)中花11的Badh2基因進(jìn)行編輯,獲得在第1個(gè)外顯子上突變1個(gè)堿基的突變體材料,香味物質(zhì)含量顯著提高。本研究通過CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)龍粳31的Badh2基因進(jìn)行編輯,獲得香味物質(zhì)含量較受體顯著提高的突變體,達(dá)到現(xiàn)有香稻的水平。本研究與邵高能等[9]的突變位點(diǎn)不同,分別在水稻Badh2基因的第2個(gè)內(nèi)含子與第2個(gè)外顯子間和第3個(gè)外顯子上設(shè)計(jì)gRNA,以超級(jí)稻品種龍粳31為受體,進(jìn)行靶向編輯,成功獲得多種Badh2基因序列有變化的突變體,在轉(zhuǎn)基因當(dāng)代就獲得純合突變的單株badh2-E2-6和badh2-E2-11,且突變穩(wěn)定遺傳至T1。而突變體Badh2-E2-13在T0是雙等位突變,表現(xiàn)為缺失64,108 bp,在T1則出現(xiàn)與T0不同的2種純合突變株系,表現(xiàn)為19,50 bp的缺失,這與前人報(bào)道的結(jié)果一致,可能是T1仍存在gRNA的識(shí)別位點(diǎn),從而再次對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行編輯[23-24],產(chǎn)生新的突變,到了T2以后轉(zhuǎn)基因元件被剔除,突變即可穩(wěn)定遺傳[25]。因此，為了獲得穩(wěn)定的基因編輯系,有必要選擇無轉(zhuǎn)基因元件遺留的單株進(jìn)行傳代,在T1獲得10個(gè)無轉(zhuǎn)基因元件的株系以供后續(xù)研究。

通過改良香味基因來提高稻米香味物質(zhì)含量已經(jīng)被報(bào)道,但是提高的程度各不一樣。有報(bào)道指出非香稻品種并非不含香味物質(zhì),而是香味不明顯[26]。本研究中所用的受體材料本身的2AP含量有0.018 mg/kg,而突變體相對(duì)于受體提高了1～4倍,達(dá)到已報(bào)道的香稻水平[17],但沒有邵高能、Shan等[8-9]報(bào)道的2AP含量高,這可能與受體材料本身特性有關(guān)。

突變Badh2基因可能會(huì)影響部分株系的產(chǎn)量,在本研究中調(diào)查了突變體T1植株的主要農(nóng)藝性狀,2AP含量最高的突變體Badh2-E2-13的千粒質(zhì)量較野生型有顯著降低,這可能與其大片段缺失有關(guān),同時(shí)轉(zhuǎn)基因過程也可能會(huì)影響突變株系的農(nóng)藝性狀。后期可以通過與野生型回交,結(jié)合香味物質(zhì)含量和產(chǎn)量性狀進(jìn)行田間選育,優(yōu)先地選擇沒有影響受體主要農(nóng)藝性狀的單株進(jìn)行后續(xù)的育種應(yīng)用,或者可以通過與野生型進(jìn)行回交,選育出既保留龍粳31品種原有的優(yōu)良性狀,同時(shí)香味物質(zhì)含量高的單株進(jìn)行后續(xù)的應(yīng)用。

本試驗(yàn)利用CRISPR/Cas9技術(shù)改良超級(jí)稻品種龍粳31的香味品質(zhì),對(duì)香味基因Badh2進(jìn)行準(zhǔn)確的基因編輯,獲得了Badh2基因的表達(dá)量顯著降低、香味物質(zhì)含量顯著提高且無轉(zhuǎn)基因元件遺留的穩(wěn)定突變株系,提高了龍粳31的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,也為香稻品種選育提供了育種材料。