劉 丹,趙子龍,梁 丹,曹婷婷,李素敏,王從磊, 時曉偉,楊曉然,張 明,朱 銘,王建賀,馮 剛,李素英

(1.天津市農(nóng)作物研究所,天津市農(nóng)作物遺傳育種重點實驗室,天津 300384；2.唐山師范學院 生命科學系,河北 唐山 063000)

谷子起源于我國,已有8 700年的栽培歷史,營養(yǎng)均衡,歷史上曾是養(yǎng)育中華民族的主糧。目前,谷子主要分布于中國、印度等發(fā)展中國家,中國谷子種植面積占全球的80%左右。小麥起源于亞洲西部,公元前2 000年左右,我國開始種植小麥[1]。由于小麥適口性突出,逐步發(fā)展為全球性主糧,在我國也逐步取代谷子的主糧地位；而谷子雖然具有營養(yǎng)全面、均衡,但由于適口性較差,逐步退出主糧地位、成為雜糧,也成為制約其產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要限制因素。

蛋白質(zhì)、淀粉是作物籽粒的主要營養(yǎng)成分,二者共同決定了作物的品質(zhì)及產(chǎn)量,對作物具有重要意義[2-3]。小麥中的蛋白可形成面筋,用于制作面包、面條、饅頭等食物[4],而谷子、水稻、玉米中籽粒的成分基本不能形成面筋,難以單獨制作面包、面條、饅頭等食物。淀粉為多聚葡萄糖,占籽粒成分的80%左右,依據(jù)糖苷鍵的不同分為直鏈淀粉和支鏈淀粉兩類[5],兩類淀粉均以顆粒狀形態(tài)積累在胚乳中,體積大的淀粉顆粒為A型淀粉粒,體積小的淀粉顆粒為B型淀粉粒,體積最小的淀粉顆粒為C型[6-8]。在掃描電鏡下,淀粉粒呈現(xiàn)圓球形、橢球形、多面形,且不同作物A型、B型、C型淀粉顆粒含量明顯不同。作物籽粒中的蛋白質(zhì)占籽粒成分的10%～15%,依據(jù)溶解性的不同,分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白,其中清蛋白為水溶性蛋白,球蛋白為鹽溶性蛋白,醇溶蛋白主要溶解于醇類物質(zhì),而谷蛋白主要溶解于酸或堿[9-10]。不同作物間蛋白種類及其構成比例和構成蛋白質(zhì)的氨基酸種類和含量存在較大差異[11-13]。因此,如何通過研究籽粒蛋白、淀粉構成及結構,改良谷子品質(zhì),成為擺在廣大農(nóng)業(yè)科研工作者面前的一個重要課題,也是解決制約谷子產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸難題的關鍵所在。

關于小麥蛋白成分及其構成比例已有一些報道。Henkrar等[14]研究表明,小麥籽粒中,麥谷蛋白和醇溶蛋白均占蛋白總量的40%左右,二者通過蛋白質(zhì)之間的相互作用形成面筋。谷蛋白決定了面團的彈性,彈性好的小麥粉,即強筋小麥粉適合制作面包,而彈性小,延展性好的面粉,即弱筋小麥粉,適合制作餅干[15-18]。因此,谷蛋白與小麥的營養(yǎng)品質(zhì)及加工品質(zhì)密切相關；麥谷蛋白為復合體蛋白,各個亞基之間通過分子內(nèi)及分子間二硫鍵、氫鍵連接聚合,通過巰基乙醇及二硫蘇糖醇等還原劑可形成單體蛋白,這些單體蛋白按照其在SDS-PAGE電泳中的遷移速率可分為高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)和低分子量谷蛋白亞基(LMW-GS)[19-21]。醇溶蛋白(Gliadin)作為面筋的主要成分之一,決定了面筋的黏性和延展性[22],不同于麥谷蛋白,Gliadin為單體蛋白,分子量介于20～100 ku,分子間沒有二硫鍵,依托分子內(nèi)二硫鍵、氫鍵及疏水作用力形成球狀結構[22]。根據(jù)醇溶蛋白在A-PAGE電泳圖譜上的相對遷移速率可以將醇溶蛋白分為α、β、γ、ω4類,其中α型醇溶蛋白占Gliadin總量的25%,β型醇溶蛋白占Gliadin總量的30%,γ型醇溶蛋白占Gliadin總量的30%,ω型醇溶蛋白占Gliadin總量的15%[23-25]。然而,目前,對于谷子籽粒蛋白的研究相對較少,也缺乏研究的深度和廣度。

關于小麥淀粉成分及其構成比例也有一些研究。小麥籽粒中80%以上為淀粉,淀粉質(zhì)體為其合成的場所,在高等植物中存在的原質(zhì)體、葉綠體、淀粉質(zhì)體相互轉化的現(xiàn)象,同時也伴隨著淀粉的合成與降解[26]。有研究認為,淀粉質(zhì)體是由原質(zhì)體和葉綠體發(fā)育而來,原質(zhì)體和葉綠體中的淀粉積累充分后,二者便轉化為淀粉質(zhì)體；淀粉質(zhì)體合成的淀粉粒為A型淀粉粒,A型淀粉粒通過自身生長的小淀粉粒發(fā)育成B型淀粉粒,對于C型淀粉粒的來源目前尚無研究證實[8, 11]。A型淀粉粒占籽粒淀粉數(shù)量的5%左右,質(zhì)量為籽?？偟矸哿康?0%,B型淀粉粒占籽粒淀粉粒總量的95%,但是質(zhì)量僅占籽粒淀粉總量的25%～30%[8, 11]。同時表達譜分析表明,A型淀粉粒出現(xiàn)在開花后的4～14 d,B型淀粉粒則出現(xiàn)在開花后14 d到籽粒成熟,說明B型淀粉?？赡軄碓从谝呀?jīng)發(fā)育成熟的A型淀粉粒。同時A型淀粉粒和B型淀粉粒對于品質(zhì)的貢獻也不相同,A型淀粉粒含量高的小麥制作的面包體積較大,質(zhì)量較好。然而,目前,對于谷子籽粒淀粉的研究相對較少,對于品質(zhì)貢獻方面的研究也鮮有報道。

谷子和小麥的淀粉、蛋白質(zhì)結構、形狀以及成分均存在較大差別,這也是造成它們營養(yǎng)品質(zhì)、加工品質(zhì)以及適口性等差別的主要原因,也是造成谷子逐步退出主糧地位以及制約其產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關鍵所在。本研究利用掃描電鏡對小麥、谷子籽粒結構的進行觀察,探明小麥和谷子中淀粉、蛋白質(zhì)的形態(tài)差異及排布特征,并通過對谷蛋白和醇溶蛋白的提取,研究谷蛋白和醇溶蛋白在分子量及組成上的差異,為探明谷子和小麥品質(zhì)間差異形成的原因提供理論依據(jù),為進一步通過分子手段改良小米品質(zhì)提供技術支撐,為拓寬谷子品質(zhì)改良的途徑提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試谷子材料由唐山師范學院生命科學系提供,供試小麥材料由天津市農(nóng)作物研究所小麥中心提供(表1)。

表1 材料Tab.1 Materials

1.2 谷蛋白提取

試驗在唐山師范學院進行,采用同時提取高分子量谷蛋白和低分子量谷蛋白的方法對小麥的谷蛋白進行提取,取1粒小麥種子磨碎,將粉末置于2.0 mL離心管中,加入800 μL Buffer A (7.5%異丙醇； 0.3 mol/L NaI),于65 ℃提取1 h,其間10 min用振蕩儀振蕩1次后10 000 r/min,離心3 min,棄上清,并重復1次；在沉淀中加入200 μL Buffer B(25% 異丙醇,0.04 mol/L Tris-HCl(pH=8.0),10%SDS,2%DTT),渦旋充分后,于65 ℃提取1 h,其間不斷搖動(10 min渦旋1次)；再加入200 μL Buffer C (25%異丙醇,0.04 mol/L Tris-HCl(pH=8.0),10%SDS,1.4%乙烯基吡啶),渦旋混勻,于65 ℃提取30 min,10 000 r/min,離心5 min；將上述400 μL的上清吸取出來,轉移到另一干凈離心管中,加入200 μL Buffer D(0.625 mol/L Tris-HCl(pH=6.8),5%硫基乙醇,20%甘油,2%SDS,0.2%溴酚藍),渦旋混勻,靜置30 min后,放入沸水中100 ℃,變性5 min,自然冷卻,該溶液即為含有HMW-GS和LMW-GS的提取液,可做電泳分析用。通過SDS-PAGE,濃縮膠濃度為10%,分離膠濃度為5%,穩(wěn)流15 mA/板,電泳16 h,對小麥谷蛋白進行鑒定。

通過植物總提蛋白方法,對谷子冀谷32進行籽粒蛋白總提(提取Buffer:0.625 mol/L Tris-HCl,5%硫基乙醇，20%甘油，2% SDS，0.2%溴酚藍；渦旋混勻，靜置30 min),通過60%異丙醇去除醇溶蛋白的方法對谷蛋白進行提取,并通過SDS-PAGE對谷子總蛋白、谷蛋白進行鑒定。

1.3 醇溶蛋白提取

采用70%乙醇對春小麥、冬小麥醇溶蛋白進行提取,采用ISTA 1986年頒布的A-PAGE電泳流程對小麥醇溶蛋白進行鑒定[27]；采用65%異丙醇對谷子籽粒進行醇溶蛋白提取,并通過A-PAGE對谷子醇溶蛋白進行鑒定。

1.4 籽粒電鏡觀察

選擇外形完整、顆粒飽滿的谷子、小麥籽粒,各種籽粒隨機選取3粒。將干燥好的籽粒,用徒手切片法切下斷裂面,厚度約為1～2 mm,即為樣品。將樣品自然斷裂面朝上,切割面朝下,用導電膠粘著于樣品臺上,然后將樣品臺置于樣品室放在場發(fā)射掃描電鏡(ZEISS Sigma 300)下,依次觀察各個籽粒蛋白斷裂面的腹部、中部、背部,并拍照記錄。

2 結果與分析

2.1 谷子與小麥谷蛋白的對比分析

2.1.1 小麥谷蛋白SDS-PAGE分析 SDS-PAGE電泳分析結果表明：小麥品種中國春、津強8號、津強9號、津強11號、津強12號、106、CB037、輪選987、津硬8號中均存在高分子量谷蛋白亞基和低分子量谷蛋白亞基,但高分子量谷蛋白亞基條帶較少,一般表達4～5種高分子量谷蛋白亞基,而低分子量谷蛋白亞基組成較為復雜,品種間變異較為豐富(圖1)。前人研究表明,中國春的高分子量組蛋白為Dx2+Dy12和Bx7+By8,A基因組上的高分子量谷蛋白呈沉默狀態(tài),不表達[28]。津強8號高分子量谷蛋白表達模式與中國春類似,僅4種高分子量谷蛋白表達,而津強9號、津強11號、津強12號、106與中國春相比,除了B基因組和D基因組的高分子量谷蛋白表達,A基因組上也有一個位點表達產(chǎn)生了高分子量谷蛋白,因此這些品種具有5條高分子量谷蛋白條帶(圖1)。CB037和輪選987B組染色體上谷蛋白與中國春存在明顯差異,Bx和By的分子量接近。津硬8號為四倍體小麥,僅含有A基因組和B基因組,但其高分子量谷蛋白也有4個位點表達(圖1),說明在進化過程中,四倍體小麥的A基因組上的高分子量谷蛋白編碼基因并未沉默。低分子量谷蛋白編碼位點較多,且表達具有品種間特異性,但目前對于低分子量谷蛋白分布及功能的研究較少。

圖1 小麥谷蛋白亞基Fig.1 Wheat gluten subunit

2.1.2 谷子谷蛋白SDS-PAGE分析 對谷子總蛋白和谷蛋白的分析結果(圖2)表明：谷子新品種—冀谷320.12,0.15,0.18,0.21,0.24 g籽粒提取的蛋白濃度逐漸上升,0.12 g谷子籽粒所提取的蛋白與0.015 g小麥籽粒提取的總蛋白亮度接近,說明谷子籽粒蛋白質(zhì)含量不如小麥含量豐富,同時對谷子谷蛋白提取發(fā)現(xiàn),谷子谷蛋白含量很低,僅有1條明顯的谷蛋白條帶和2條較弱的谷蛋白條帶。

對比小麥總蛋白帶譜發(fā)現(xiàn),谷子總蛋白的遷移速率顯著低于小麥總蛋白遷移速率,說明谷子蛋白的分子量顯著低于小麥蛋白分子量。

1.小麥(中國春),0.015 g籽?？偟鞍?；2-6. 0.12,0.15,0.18,0.21,0.24 g谷子籽?？偟鞍?；7-11. 0.12,0.15,0.18,0.21,0.24 g谷子籽粒谷蛋白。

1.Wheat(Chinese spring), 0.015 g grain for total protein extraction; 2-6. 0.12, 0.15, 0.18, 0.21, 0.24 g grain for total protein extraction of foxtail millet; 7-11. 0.12, 0.15, 0.18, 0.21, 0.24 g grain for glutenin extraction of foxtail millet.

圖2 谷子總蛋白及谷蛋白
Fig.2 Protein of foxtail millet

2.2 谷子與小麥醇溶蛋白的對比分析

2.2.1 小麥醇溶蛋白分析 通過單粒小麥種子(約0.06 g),進行醇溶蛋白提取,并利用酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(A-PAGE)對醇溶蛋白進行分析,發(fā)現(xiàn)在小麥的醇溶蛋白在ω、γ、β、α區(qū)均有分布,且醇溶蛋白含量豐富,組成復雜,每個品種均具有自身的條帶構成特征,且變異豐富(圖3)。中國春與Fielder在ω區(qū)存在差異,Fielder ω區(qū)有4個位點表達,中國春有5個位點表達；γ區(qū)Fielder表達的位點多于中國春；α/β區(qū),2個品種的表達相似。濟南17與Fielder在ω區(qū)醇溶蛋白組成相似,但是在α/β區(qū)存在顯著差異；濟南44與中國春在ω區(qū)醇溶蛋白組成相似?？傮w說明,醇溶蛋白的組成具有品種間特異性(圖3-A)。對于天津市農(nóng)作物研究所的冬麥資源分析發(fā)現(xiàn),冬麥材料的醇溶蛋白在ω、γ、β、α區(qū)均存在明顯差異,品種特異性差異顯著(圖3-B)。說明,小麥中醇溶蛋白具有明顯的品種間特異性。

圖3 小麥醇溶蛋白Fig.3 Gliadin of wheat varieties

2.2.2 谷子醇溶蛋白分析 通過提取谷子醇溶蛋白(約0.06 g),進行A-PAGE電泳分析(圖4)表明,鐵谷8(V1)、興谷88(V2)、壩谷214(V3)、朝谷13(V4)、延谷12(V5)、公谷70(V6)、赤谷4(V7)、大同29(V8)、鄭9188(V9)品種中,均含一定量的醇溶蛋白,谷子醇溶蛋白約10～20條條帶,在不同品種間存在多態(tài)性,條帶種類和組成具有品種特征。V1中含有12個醇溶蛋白條帶,其中有2個條帶表達量較高,其余條帶表達較弱；V2有9條醇溶蛋白條帶,表達量較高的條帶與V1品種的條帶位置不同；V3、V4、V9的醇溶蛋白帶譜相似；V5、V7醇溶蛋白帶譜相似,醇溶蛋白條帶亮度低,說明表達豐度較低；V8有3條高亮度條帶。說明谷子不同品種醇溶蛋白含量可能存在一定差異,并且醇溶蛋白存在品種間特異性。

圖4 谷子醇溶蛋白Fig.4 Alcohol-soluble protein of foxtail millet

2.3 籽粒電鏡觀察

通過掃描電鏡觀察表明,谷子和小麥籽粒中均含有淀粉粒和蛋白體。在常規(guī)谷子品種冀谷32、恢復系JK4-227、不育系51A中,均含有兩類淀粉粒,一類體積較大,成多邊形,直徑5～10 μm,屬于B型淀粉粒,含量豐富；另一類體積較小,為球形,直徑約2 μm,屬于C型淀粉粒,含量少于B型淀粉粒；在淀粉粒間隙填充著較少的蛋白體。在春小麥津強1號、冬小麥津農(nóng)10號、輪選987中存在三類淀粉粒,大小不同,其中,一類淀粉粒體積較大,直徑10～30 μm,呈盤子狀,為A型淀粉粒,含量豐富；第二類淀粉粒體積比A型淀粉粒小,直徑5～10 μm,成球形或者多邊形,為B型淀粉粒；第三類淀粉粒體積最小,直徑小于2 μm,為C型淀粉粒,B型、C型淀粉粒顯著少于A型淀粉粒；同時淀粉粒間隙中填充著較為豐富的蛋白體,不同品種淀粉體覆蓋的蛋白含量不同,津農(nóng)10號淀粉體表面較為平滑,而津強1號淀粉粒表面被蛋白體緊密包裹(圖5)。

谷子冀谷32為常規(guī)品種、JK4-227為恢復系、51A為不育系；小麥津強1號(春小麥,強筋)、 津農(nóng)10號(冬小麥,中筋)、輪選987(冬小麥,中筋)。 Jigu 32 was a conventional variety of foxtail millet, JK4-227 was a restorer line, and 51A was a sterile line； Jinqiang 1 (spring wheat, strong-gluten), Jinnong 10 (winter wheat, middle-gluten), Lunxuan 987 (winter wheat, middle-gluten).

3 討論

小麥面筋含量高,因此可用于制作面包、面條、蛋糕等食品；而谷子幾乎不含有面筋,但營養(yǎng)豐富。因此,可以以小米面主要作為配粉,按照一定比例,添加到小麥粉中,制作面包、面條、蛋糕,既可增加這些產(chǎn)品的營養(yǎng)價值,又可提高小米的適口性和商業(yè)價值,從而擴大小米的用量,解決制約谷子產(chǎn)業(yè)發(fā)展的小米用途窄的難題。

據(jù)報道,小麥籽粒蛋白含量約13%[29],而谷子的蛋白含量為10%[30]。本研究發(fā)現(xiàn),谷子不僅總蛋白含量低于小麥,在SDS-PAGE上,谷子總蛋白遷移速率顯著快于小麥蛋白遷移速度,說明谷子籽粒蛋白的分子量顯著低于小麥總蛋白。小麥與谷子的蛋白質(zhì)含量差異不大,不同品種的小麥籽粒中均含有谷蛋白和醇溶蛋白,二者共同形成面筋。本研究也證實,小麥品種都含有高分子量谷蛋白亞基和低分子量谷蛋白亞基,而谷子的籽粒中谷蛋白很少,且與小麥相比,谷蛋白的分子量很低,說明谷子含有谷蛋白的水平很低,并且都是一些分子較小的谷蛋白,與小麥谷蛋白存在明顯差異。醇溶蛋白研究發(fā)現(xiàn),谷子的醇溶蛋白條帶較少,多態(tài)性不如小麥籽粒醇溶蛋白豐富,說明谷子中編碼醇溶蛋白的基因少于小麥,在改良谷子品質(zhì)時,可以適當引入分子量大的谷蛋白、醇溶蛋白亞基,增加谷子蛋白的分子量。

谷子中的谷蛋白和醇溶蛋白含量與小麥存在較大差異,說明二者蛋白質(zhì)性質(zhì)和構成差異均較大,谷子的蛋白質(zhì)含量雖然接近小麥,但是由于其谷蛋白和醇溶蛋白含量少,且分子量與小麥存在較大差異,所以不能形成面團,制作面包等商品。

研究發(fā)現(xiàn),小麥籽粒蛋白中20%為清蛋白和球蛋白,其余80%為谷蛋白和醇溶蛋白,谷蛋白和醇溶蛋白的比例接近1∶1[10, 31]。本研究發(fā)現(xiàn),從帶譜圖上看,谷子含有一定的醇溶蛋白,也具有一定的多態(tài)性,但是谷子谷蛋白含量極低,分子量也較小,這說明谷子醇溶蛋白的含量遠遠高于谷蛋白含量,與小麥谷蛋白和醇溶蛋白的比例差異較大,也暗示由于谷子谷蛋白和醇溶蛋白含量差異懸殊,因此不能形成面筋。

谷子、小麥除了蛋白質(zhì)存在差異外,在淀粉粒上也存在較大差異。小麥主要存在A、B、C三類淀粉體,其中A型淀粉粒體積較大,直徑10～30 μm,呈盤子狀；B型淀粉粒體積比A型淀粉粒小,直徑5～10 μm,呈球形或者多邊形；C型淀粉粒體積最小,直徑小于10 μm,與蛋白體鑲嵌在一起[32]。谷子的淀粉體大部分呈多邊形,直徑約10 μm,屬于B型淀粉粒；也發(fā)現(xiàn)大量C型淀粉粒,但未發(fā)現(xiàn)A型淀粉粒。說明在淀粉體排布上,谷子與小麥也存在一定差異,這也是造成小米適口性較差的原因之一。在谷子品質(zhì)改良實踐中,可改造淀粉合成基因、調(diào)控基因,增加谷子淀粉體體積、改變不同類型淀粉體的比例從而提升谷子品質(zhì)。

目前,對于谷子品質(zhì)形成的研究進展緩慢,而品質(zhì)的成因主要由蛋白和淀粉決定,因此通過開展蛋白體結構和淀粉特征等表型研究,從而為從分子水平解析谷子品質(zhì)的形成及影響因素奠定基礎,也為從轉基因及基因組編輯等方面改良谷子品質(zhì)提供理論依據(jù)。