李 論,柯 杰,黃 鋼,劉紅詩,宋燕妮,張英潔,陳利紅

(江漢大學 系統(tǒng)生物學研究院,湖北 武漢 430056)

二穗短柄草是一種與擬南芥有類似優(yōu)勢且與小麥、大麥以及草坪草、牧草的親緣關系比水稻更近的新型模式植物,是冷季型禾本科早熟禾亞科中唯一完成全基因組測序的植物[1-2]，具有基因組小、生命周期短、自花授粉、易培植等諸多優(yōu)點。因此,以二穗短柄草為模式植物,利用比較基因組學及功能基因組學方法獲得二穗短柄草中重要基因的相關信息,必將加速牧草、草坪草與麥類作物的遺傳改良進程。

由于目前生態(tài)環(huán)境惡劣,外界低溫、干旱和鹽害等一些非生物脅迫是造成農作物和農副產業(yè)減產,甚至絕收的主要原因[3]。研究表明,溫帶及寒帶植物遭受這些脅迫時,不是通過被動的防御,而是通過主動的應答機制來抵御脅迫[4]。如植物遭受冷脅迫時,是通過主動的冷馴化機制來抵御低溫脅迫的。防御過程中,機體會產生一系列形態(tài)、生理生化和分子水平上的適應性變化,如改變膜系統(tǒng)穩(wěn)定性、積累可溶性蛋白和小分子滲透物質、激活響應信號通路中起關鍵作用的轉錄因子等[4-5]。AP2/EREBP轉錄因子超家族是一個龐大的基因家族,在植物生長發(fā)育[6-7]以及逆境應答[8-11]通路中扮演著極其重要的角色,是作物基因的優(yōu)良候選資源。

AP2/EREBP轉錄因子成員在擬南芥中有145個[12]、水稻中有163個[13]。前期在二穗短柄草中對該超家族進行了鑒定與表達分析,從中鑒定出159個AP2/EREBP成員,可分為4大類,即:AP2 (23個)、RAP(Related to ABI3/VP1,4個)、ERF(Ethylene response factor,57個)和CBF/DREB(C-repeat binding factor/dehydrate responsive element binding factor, 65個)[14]。CBF/DREB亞家族在應答植物低溫、干旱和高鹽脅迫過程中起著重要作用[9]。擬南芥中該家族包含干旱與高鹽誘導的CBF/DREB2和冷誘導的CBF/DREB1 2個小家族[15]。其中CBF/DREB1小家族成員通過結合COR(Cold regulated)、DHN(Dehydrin)及RD(Responsive to dehydration)等低溫應答基因啟動子區(qū)域的DRE/CRT順式作用元件,激活這類基因的表達,從而提高植物的抗寒性[16]。除了模式植物擬南芥之外,人們也從水稻[17]、大麥[18]、小麥[19]和梅花[20]等多個物種克隆出了CBF/DREB基因。目前對二穗短柄草CBF/DREB1小家族的CBF1[21]和CBF3[22]在提高植物抗冷、干旱方面的研究已有報道,但對二穗短柄草中CBF/DREB1小家族成員在提高植物抗氧化方面的研究尚未見報道。本研究前期利用實時熒光定量技術檢測了CBF/DREB1小家族中的BdDREB1-like基因在幾種非生物脅迫條件下的表達模式,發(fā)現(xiàn)該基因在氧化脅迫(H2O2)下誘導表達較顯著,因此,本研究將其構建到改造過的pBI121植物表達載體上,并通過農桿菌介導法轉化煙草,進而對其功能進行驗證。該研究將為進一步研究和解析禾本科植物CBF/DREB轉錄因子的功能提供一定的理論依據,對培育禾本科作物抗逆新品種具有一定的科研價值。

1 材料和方法

1.1 試驗材料、菌株與試劑

二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)和煙草(NicotianatabacumL.)材料為系統(tǒng)生物學研究院保存。大腸桿菌感受態(tài)細胞Trans1-T1、T載體(pEASY-Blunt Cloning Vector)、反轉錄試劑盒及實時熒光定量(SYBR Green)PCR試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；農桿菌感受態(tài)細胞EHA105購自上海士鋒生物科技有限公司；TRIzol試劑購自Invitrogen公司；膠回收試劑盒、Marker和質粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；PrimeSTAR高保真酶、限制性內切酶和T4DNA連接酶購自TaKaRa公司；pBI121載體為系統(tǒng)生物學研究院所保存；引物合成與測序均在蘇州金唯智完成。

1.2 BdDREB1-like基因的克隆及植物表達載體構建

將成熟飽滿的二穗短柄草種子剝皮后小心播種于含有3層紗布與營養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中,并置于25 ℃培養(yǎng)室進行培養(yǎng)。取生長14 d、狀態(tài)良好的二穗短柄草幼苗,利用TRIzol試劑對其總RNA進行提取,按照康為世紀公司的反轉錄試劑盒進行cDNA第一鏈的合成。根據BdDREB1-like基因(登錄號: XM_003570049)核苷酸序列,利用Primer Premier 5軟件設計3條巢式引物:DREB1F(5′-TGCTCTAGAATGGACCTCGGTGCT CTCAG-3′)、DREB1R(5′-CGCGGATCCGTAGCTCCAT AGGTTGACCTCG-3′)和DREB1Rc(5′-ACTGGACCG CCGTAAATCTG-3′),對其進行PCR擴增、目的片段連接、大腸桿菌Trans1-T1轉化與測序。測序正確的克隆提取質粒,并命名為pBdDREB1-like-T。然后分別對pBdDREB1-like-T質粒和改造的植物表達載體pBI121-GFP進行XbaⅠ和BamH Ⅰ雙酶切、目標片段回收與大腸桿菌Trans1-T1轉化,PCR和酶切檢測后陽性菌液送往蘇州金唯智測序并提取質粒。測序成功的植物重組表達載體pBI121-BdDREB1-like-GFP轉入農桿菌感受態(tài)細胞EHA105中,檢測正確的陽性菌株用于后續(xù)植物材料的轉化。

1.3 BdDREB1-like基因的生物信息學分析

利用NCBI中的在線開放閱讀框分析工具ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)對測序得到的BdDREB1-like核酸序列進行開放閱讀框分析；利用ExPaSy(http://web.expasy.org/protparam/)預測BdDREB1-like蛋白的理化性質；利用Cell-PLoc2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)進行亞細胞定位預測；利用InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)進行保守結構域分析；利用Clustalx[23]進行多序列比對并利用Mega 6[24](Molecular Evolutionary Genetics Analysis)進行進化分析。

1.4 轉基因煙草植株的獲得及亞細胞定位分析

把構建好的植物重組表達載體pBI121-BdDREB1-like-GFP轉入農桿菌感受態(tài)細胞EHA105中,經菌落PCR檢測正確后采用葉圓盤法對煙草進行遺傳轉化,進而獲得煙草轉化材料。具體過程如下:將長勢良好的煙草組培苗葉片切成0.5 mm大小的葉圓盤,25 ℃暗培養(yǎng)3 d,置于含有重組質粒pBI121-BdDREB1-like-GFP的農桿菌EHA105侵染液中侵染6～8 min,期間不停搖動三角瓶,使農桿菌充分接觸葉片。完成侵染后,多余的菌液用無菌濾紙吸干,然后將其放于鋪有無菌濾紙的共培養(yǎng)基上(MS+6-BA(2 mg/L)+NAA(0.2 mg/L)+Agar(8 g/L)+蔗糖(30 g/L),pH值5.8)25 ℃暗培養(yǎng)3 d，再移到分化培養(yǎng)基(MS+6-BA(2 mg/L)+NAA(0.2 mg/L)+羧芐青霉素Cb(500 mg/L)+卡那霉素kan(100 mg/L)+Agar(8 g/L)+蔗糖(30 g/L),pH值5.8)上,待分化的幼芽長到2～5 cm時將其切下轉入含有500 mg/L頭孢霉素的1/2 MS生根培養(yǎng)基上進行生根。待其根系發(fā)達后便可移栽至營養(yǎng)小缽中,提取基因組DNA,并利用BdDREB1-like基因引物DREB-F(5′-ATCATCAAGCCCGGAGCAA-3′)和DREB-R(5′-CAAGTATCCCTGCATCCCAAA-3′)進行陽性苗檢測,擴出的目標條帶大小為137 bp。最后把收獲的轉基因T0種子,次氯酸鈉消毒后,播于含有合適卡那霉素濃度(100 mg/L)的MS培養(yǎng)基上進行篩選,以用于后續(xù)的試驗。

亞細胞定位的分析過程如下:在載玻片上滴一滴含有10%甘油的無菌水,然后將篩選為陽性的煙草幼苗的根放于上面,輕輕蓋上載玻片,并保證操作過程中載玻片和蓋玻片之間無氣泡產生,然后置于熒光顯微鏡下觀察野生型和轉BdDREB1-like植株中是否有綠色熒光。

1.5 轉基因煙草植株非生物脅迫處理

分別在MS培養(yǎng)基上含有10 μmol/L H2O2的培養(yǎng)基上萌發(fā)野生型和表達量較高的2株轉基因株系的種子,21 d左右觀察其表型。同時將T2轉基因煙草的2個轉基因株系與野生型種子播種于MS培養(yǎng)基上發(fā)芽。待發(fā)芽14 d左右,將長勢一致的轉基因煙草和野生型煙草同時移栽到營養(yǎng)缽中,按時澆水。1個月后對其進行MV(模擬氧化脅迫的甲基紫精)處理,處理7 d后,測定H2O2、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(Peroxidase,POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和葉綠素含量。其中H2O2、CAT、POD、SOD按照南京建成生物工程研究所的試劑盒操作說明書進行。丙二醛含量測定參照Heath和Packer[25]的方法進行。取野生型和轉基因煙草正常生長和氧化處理條件下的少許葉片,用pH值7.8的50 mmol/L磷酸緩沖液在研缽中研磨葉片,隨后把研磨液轉入50 mL離心管中,并用磷酸緩沖液多次沖洗研缽使其定容至10 mL；9 487 r/min高速離心10 min后,取1.5 mL上清液(對照為1.5 mL蒸餾水)并加入0.5%的硫代巴比妥(TBA)溶液搖勻后沸水浴中煮沸30 min,然后取出冷卻后6 000 r/min 離心10 min；取上清在532,600,450 nm波長處分別測定其吸光度值。丙二醛含量的計算公式為:MDA=(6.542×(D532-D600)-0.559×D450)×VT/VS×FW(VT:提取液的總體積；VS:測定時用的體積；FW:樣品質量)。葉綠素的含量測定分別參照李飛鴻等[26]的提取方法進行。每個品系試驗重復3次。對所取得的數據采用Microsoft Excel進行統(tǒng)計分析,顯著水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 BdDREB1-like基因的克隆與序列獲得

以二穗短柄草葉片cDNA為模板,通過RT-PCR擴增,在瓊脂糖電泳凝膠上可以擴增出一條在500～800 bp的特異條帶(圖1)。將其切膠回收后連接至pEASY-Blunt-T載體上,并轉入大腸桿菌中,菌落PCR陽性的菌株拿去測序,測序結果顯示,擴增片段與目標片段大小相同,獲得的含有DREB1-like基因的重組質粒被命名為pBdDREB1-T。序列分析結果表明,該基因開放閱讀框684 bp,編碼228個氨基酸,只含有一個AP2結構域,根據前人以及系統(tǒng)生物學院研究院團隊對AP2/EREBP亞家族的分類特點,發(fā)現(xiàn)該基因屬于AP2/EREBP的DREB亞家族。

M.DNA Marker Ⅲ；1. DREB1-like基因。 M. DNA Marker Ⅲ; 1.DREB1-like gene.

2.2 BdDREB1-like基因的生物信息學分析

蛋白質在線分析軟件Protparam分析結果顯示,BdDREB1-like蛋白的預測分子量為24.178 ku,等電點5.87,不穩(wěn)定系數53.6,屬于不穩(wěn)定蛋白。蛋白的親水/疏水性預測分析結果表明:BdDREB1-like蛋白含有24個堿性氨基酸殘基和28個酸性氨基酸殘基,脂肪系數為57.84,平均親水系數(GRAVY)為-0.486,因此,該蛋白很可能為一種親水蛋白?？缒そY果分析顯示,BdDREB1-like蛋白無跨膜區(qū),無信號肽序列,為非分泌蛋白。

將BdDREB1-like基因編碼的氨基酸序列在NCBI進行BlastP搜索查找其同源的蛋白序列,選取黑麥(Secalecereal,ARK38716.1)、大麥(Hordeumvulgare,AAL84170.1)、小麥(Triticumaestivum,AFR67776.1)、小米(Setariaitalica,XP_004953437.2)、水稻(OryzasativaJaponicaGroup,XP_015624757.1)、筇竹(Chimonobambusatumidissinoda,AHB34586.1)、慈竹(Bambusaemeiensis,AFH68054.1)、玉米(Zeamays,NP_001150858.2)、黍(Panicummiliaceum,RLN09905.1)、高粱(Sorghumbicolor,XP_002454484.2)10個與其同源性較高的蛋白序列以及模式植物擬南芥的AtDREB1A(Q9M0L0)序列進行多序列比對(圖2),結果顯示:BdDREB1-like蛋白與黑麥ScCBFI-1、大麥HvCBF1、小麥TaCBF和OsDREB1G具有較高的相似性,序列一致性分別為95.00%,91.78%,91.10%,91.10%。其次與筇竹CtCBF1、慈竹BeCBF1、玉米ZmDREB1A、高粱SbDREB1G、小米SiDREB1G、黍PmDREB1G-like蛋白的序列一致性分別為:87.67%,89.73%,88.33%,87.50%,87.90%和87.30%。而與擬南芥的AtDREB1A的同源性最低,序列相似性僅為78.31%。采用鄰位相連法構建進化樹。如圖3所示,二穗短柄草DREB1A-like基因編碼的氨基酸序列與早熟禾亞科的小麥、大麥和黑麥屬于同一個進化支,親緣關系最近,然后與其他禾本科植物聚為一大支。

2.3 植物重組表達載體的構建、轉基因煙草植株的獲得與分子鑒定

用XbaⅠ和BamH Ⅰ酶分別雙酶切重組質粒pBdDREB1-T改造的植物表達載體pBI121-GFP,回收目的片段,經菌落PCR和測序正確后,獲得植物表達載體pBI121-BdDREB1-GFP(圖1-C),然后將該重組質粒轉入農桿菌EHA105中,經菌落PCR檢測正確的再通過葉圓盤法轉化煙草。轉BdDREB1-like基因的煙草經卡那霉素篩選后共得抗性苗17株,移栽后剩余12株成活；隨機挑選7株提取其和野生型煙草基因組的DNA,其中以野生型煙草作為陰性對照進行PCR鑒定。BdDREB1-like基因的煙草中有5株擴增出預期大小一致的目的條帶(137 bp),表明BdDREB1-like基因已整合到煙草基因組中(圖4-A)。從初步篩選得到的陽性植株中隨機選出3株提取RNA,以反轉錄獲得cDNA為模板,利用RT-PCR進一步檢測,結果顯示轉基因的煙草有2個株系能擴增出預期大小目的條帶(圖4-B),說明BdDREB1-like基因不僅整合到煙草基因組中而且還能穩(wěn)定表達。

圖2 BdDREB1-like 蛋白與其他物種DREB/CBF蛋白的氨基酸比對Fig.2 Alignment of amino acid sequences of BdDREB1-like and other plant DREB/CBF proteins

圖3 多個物種DREB/CBF蛋白的系統(tǒng)進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of DREB/CBF proteins from multiple plant species

2.4 BdDREB1-like基因的亞細胞定位

Cell-PLoc 2.0亞細胞定位預測顯示BdDREB1-like基因定位在細胞核中,為了進一步確認BdDREB1-like基因是否定位在細胞核中,利用熒光顯微鏡觀察了轉空載體、轉BdDREB1-like基因的煙草植株的根系發(fā)現(xiàn)轉空載體的煙草植株根細胞的細胞核、細胞質、細胞膜上都能觀察到綠色熒光；轉BdDREB1-like基因的煙草植株根細胞只有細胞核上能觀察到綠色熒光(圖5)。這些結果表明,BdDREB1-like基因的確實定位在細胞核中。

A.部分T0轉基因煙草PCR陽性檢測結果:M.DL2000；1.陽性對照質粒；2.野生型；3-9.轉基因煙草T0單株。B.部分T0轉基因煙草RT-PCR陽性檢測結果:T1,T3和T4.轉基因煙草T0單株；WT.野生型。

A.The results of positive detection by PCR in some T0 of transgenic tobacco:M. DL2000; 1.Positive plasmid; 2.Wild type; 3-9.The plant of T0 of transgenic tobacco. B.The results of positive detection through RT-PCR in some T0 of transgenic tobacco: T1, T3 and T4 represent the transgenic tobacco plants；WT.Wild type.

圖4BdDREB1-like基因T0轉基因煙草的PCR 檢測(A)與RT-PCR檢測(B)
Fig.4 The PCR and RT-PCR results in T0 of transgenic tobacco containingBdDREB1-likegene

2.5 轉基因煙草的抗氧化性鑒定

由于前期分析BdDREB1-like基因表達譜時,發(fā)現(xiàn)其受氧化脅迫誘導,因此把轉BdDREB1-like基因的煙草在未處理的MS培養(yǎng)基以及含有10 μmol/L H2O2的MS培養(yǎng)基上,進行種子萌發(fā),以觀察轉BdDREB1-like基因的煙草和WT煙草在未處理和氧化脅迫處理培養(yǎng)上的發(fā)芽情況。結果表明,在MS培養(yǎng)基上,播種21 d后,野生型轉BdDREB1-like基因煙草種子的發(fā)芽率沒有顯著的差異。在含有10 μmol/L H2O2的MS培養(yǎng)基上,播種21 d后,相對于野生型煙草種子,轉BdDREB1-like基因煙草種子具有較高的發(fā)芽率(圖6)。為了進一步確定BdDREB1-like基因與氧化脅迫的關系,又對1個月大的轉基因煙草進行MV(模擬氧化脅迫的甲基紫精)處理,并測定H2O2(以鮮質量計)、過氧化氫酶(CAT)(以鮮質量計)、過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)(以鮮質量計)、丙二醛(MDA)(以鮮質量計)和葉綠素的含量。結果表明,在正常生長條件下,T3轉基因株系除了SOD含量顯著高于野生型中的含量外,以上測定的其他各種生理指標均與野生型無顯著差異, T1轉基因株系中的POD含量顯著高于野生型中的含量,葉綠素含量顯著低于野生型中的含量,其他生理指標與野生型中的無顯著差異。在氧化脅迫處理條件下,轉BdDREB1-like基因的煙草植株相對于野生型,具有較高的過氧化物酶活力、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和葉綠素的含量(圖7)和較低的丙二醛和過氧化氫含量。結果表明,過表達BdDREB1-like基因增強了植物對氧化脅迫的耐受性。

圖5 BdDREB1-like基因在煙草根中的亞細胞定位Fig.5 Subcellular localizations of BdDREB1-like gene in the root of tobacco

圖6 野生型(WT)煙草和轉基因 株系氧化脅迫處理后的發(fā)芽情況Fig.6 Germination conditions of transgenic tobacco lines and WT under oxidative stress

不同字母表示同一脅迫條件下不同植株材料間的差異顯著。 Different lowercase letters represent the significant differences among different plant materials under the same stress condition.

3 討論與結論

植物在生長過程中,經常會受到低溫、干旱、高鹽等惡劣環(huán)境所帶來的影響。植物遭受這些脅迫時一般會產生大量的活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS),進而對植物造成氧化脅迫。而植物體內含有的種類繁多的轉錄因子家族,在抵御逆境脅迫方面扮演者重要角色。其中,AP2/EREBP轉錄因子超家族在植物中成員數目較多,它不僅參與調控植物的生長發(fā)育[6-7],也在逆境應答、植物激素信號轉導等過程中發(fā)揮著重要作用[8-11]。

第1個AP2/EREBP轉錄因子成員是1994年在模式植物擬南芥中被分離鑒定出來的,它主要調控花的發(fā)育過程[27]。之后相繼從水稻[17]、大麥[18]、小麥[19]和梅花[20]等多種其他植物中克隆出來了DREB轉錄因子,很多研究表明,DREB轉錄因子是通過特異結合下游調控因子的DRE順式作用元件進而調控其下游靶基因的表達,進而增強植物多逆境脅迫的耐受力[28]。如擬南芥中的DREB1A/CBF3、DREB1B/CBF1和DREB1C/CBF2能快速響應冷脅迫刺激,過表達這3個基因的任何一個均能提高植物對干旱、鹽及冷的耐受力,而過量表達AtDREB2A基因的擬南芥只顯著增強了干旱能力[29]。過表達AtDREB1A基因的菊花相對于野生型,通過降低植物葉片的電解質泄露而提高了植物的成活率[30]。過表達綠豆DERB基因的擬南芥對干旱和鹽的耐受能力有所提高,而擬南芥的其他性狀沒有明顯變化[8]。過表達短柄草CBF/DREB的CBF1[21]和CBF3[22]提高了植物的抗冷、干旱特性方面的研究已有報道,但對短柄草CBF/DREB成員在提高植物抗氧化方面的研究尚未見報道。

本研究克隆了CBF/DREB亞家族的BdDREB1A-like基因,將其過表達到煙草中,發(fā)現(xiàn)轉BdDREB1A-like基因的煙草相對于野生型具有較低的MDA和過氧化氫含量,和較高的POD、CAT、SOD和葉綠素含量。MDA是反映機體抗氧化潛在能力的重要參數,其含量的高低直接反映了細胞膜受損害程度的大小。CAT和POD具有清除H2O2的能力,SOD是氧自由基的自然天敵,是機體內氧自由基的頭號殺手,它能及時清除植物體內的氧自由基,是植物逆境中最主要的一種抗氧化酶,SOD活性的高低與植物體的抗逆性密切相關。轉BdDREB1A-like基因的煙草,相對于野生型煙草具有較高的POD、CAT、SOD含量,表明該基因的轉入提高了植物對氧化脅迫的耐受力,在植物響應逆境脅迫過程中發(fā)揮著重要作用,因此有望用于植物遺傳改良工程。