劉菲，張昊，劉博，譚文

(廣東工業(yè)大學生物醫(yī)藥研究院，廣東 廣州 510006)

腦卒中是腦血管阻塞或破裂引起的急性缺血缺氧性腦病[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報道，在我國，腦卒中的致死率居各類疾病的首位，每年造成至少600萬人死亡,而永久性缺血性腦卒中又是其中很重要的一部分[1-2]。N2a細胞是小鼠神經元母細胞瘤細胞株[3]，是目前研究神經系統(tǒng)疾病的主要模式細胞。研究體外缺氧常用氯化鈷(CoCl2)誘導N2a細胞缺氧損傷模型，該模型通過化學缺氧能夠很好地模擬體內缺氧過程，但具體機制仍不十分明確。本研究擬采用CoCl2處理N2a細胞建立缺氧模型，并通過觀察細胞缺氧損傷情況探討細胞缺氧損傷的機制，為相關藥物研發(fā)提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

細胞培養(yǎng)類試劑與JC-1試劑(T3168)、DAPI染色液(1217226)購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司；DCFH-DA探針(SLBF6547V)購于Sigma-Aldrich公司；IKK(3416)、p-IKK(2697)、NF-κB(8242)、p-NF-κB(3033)購于CST公司；細胞增殖與凋亡檢測試劑盒(C1098)購于上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CoCl2誘導N2a細胞化學缺氧模型的建立 參考Gotoh等[4]的方法建立缺氧模型，將細胞分為正常組和CoCl2處理組，正常組用無糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，CoCl2處理組用無糖培養(yǎng)基配制，濃度分別為：10 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、300 μmol/L、600 μmol/L、1 200 μmol/L，37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.2.2 CCK-8方法檢測N2a細胞活性 在96孔板上每孔加入1×105個細胞，按照“1.2.1”建立缺氧模型后檢測細胞存活率，細胞存活率=(對照孔吸光度-實驗空白孔吸光度)/(對照組吸光度-空白孔吸光度)。

1.2.3 TUNEL法檢測體外細胞凋亡 根據(jù)試劑盒說明書收集細胞，染色后在熒光顯微鏡下選取10個視野計算細胞凋亡率,凋亡率=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)。

1.2.4 線粒體膜電位的測定 按照“1.2.1”造模后，配制1 μg/mL 的JC-1工作液，37 ℃避光孵育20 min，PBS清洗后，放置于共聚焦顯微鏡下拍攝，每組選取10個視野，計算紅色熒光與綠色熒光比值。

1.2.5 活性氧(ROS)檢測 N2a細胞在CoCl2化學誘導缺氧24 h后，加入10 μmol/L的DCFH-DA探針，37 ℃避光染色20 min后置于激光共聚焦顯微鏡下拍攝，每組選取10個視野計算綠色熒光的含量。

1.2.6 細胞免疫熒光染色實驗 在激光共聚焦專用皿上種1×105個細胞，建模后經多聚甲醛固定30 min后用TritonX-100通透，室溫下用2%的BSA封閉80 min。在激光共聚焦專用皿中心滴加50 μL NF-κB抗體(1∶50)，4 ℃過夜。第2天用PBST清洗后加入熒光二抗，室溫下孵育90 min。用DAPI染核后在激光共聚焦顯微鏡下拍照。

1.2.7 Western blot測定實驗 將細胞按照建模方法處理后，提取總蛋白，以β-actin為內參抗體，將各目標條帶與內參做均一化處理，對比結果。

2 結果

2.1 不同濃度CoCl2化學誘導缺氧條件下對N2a細胞活性的影響

不同濃度的CoCl2處理N2a細胞24 h后，細胞存活率隨著CoCl2濃度的增加而降低，由圖1可知，10～100 μmol/L CoCl2損傷細胞相對存活率均大于80%，300 μmol/L的CoCl2處理后細胞活力為56.16%，600 μmol/L CoCl2損傷細胞相對存活率為32.10%，1 200 μmol/L CoCl2處理后，細胞存活率僅為10%左右。

與正常組比較：*P< 0.05，**P<0.01。

圖1 不同濃度CoCl2對N2a細胞活性的影響

Figure 1 Effect of different concentrations of CoCl2on the activity of N2a cells

2.2 不同濃度CoCl2化學誘導缺氧條件下對N2a細胞凋亡的影響

不同濃度的CoCl2處理N2a細胞24 h后，細胞凋亡率隨著CoCl2濃度的增加而增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中，10 μmol/L和50 μmol/L的CoCl2對細胞的凋亡率都小于20%，100 μmol/L的CoCl2對細胞的凋亡率為23%左右，300 μmol/L的CoCl2對細胞的凋亡率為38%，而600 μmol/L的CoCl2對細胞的凋亡率達到67%，1 200 μmol/L的CoCl2對細胞的凋亡率達到88%。

與正常組比較：**P< 0.01。

圖2 不同濃度CoCl2對N2a細胞凋亡的影響

Figure 2 Effect of different concentrations of CoCl2on apoptosis of N2a cells

2.3 CoCl2化學誘導缺氧條件下N2a細胞線粒體膜電位的影響

如圖3所示，A圖為模型建立后，經過1 μg/μL的JC-1處理后，confocal拍攝的N2a細胞線粒體膜電位圖,其中紅色的熒光是JC-1多聚體,綠色熒光為JC-1單聚體。由圖3A中可以看出,正常組細胞多表達為JC-1多聚體,線粒體形態(tài)清晰,均勻分布在細胞核四周,300 μmol/L CoCl2處理后綠色熒光增強。B圖為線粒體膜電位的統(tǒng)計圖，從圖中可以看出,經CoCl2處理后,紅色熒光與綠色熒光比值降低,線粒體膜電位降低(P<0.05)。

A．激光共聚焦掃描顯微鏡拍攝的JC-1染色后的N2a細胞，紅色為JC-1多聚體，綠色為JC-1單聚體； B.線粒體膜電位即A圖中紅色熒光與綠色熒光比值的統(tǒng)計結果圖。與正常組比較：*P<0.05。

圖3 300 μmol/L CoCl2化學誘導缺氧條件下N2a細胞線粒體膜電位的影響

Figure 3 Effect of 300 μmol/L CoCl2-induced hypoxia on MMP of N2a cells

2.4 CoCl2化學誘導缺氧條件下N2a細胞胞內ROS水平的影響

如圖4所示，A圖為10 μmol/L的DCFH-DA探針染色后用confocal拍攝的細胞內ROS的熒光圖，其中ROS表達綠色熒光。B圖為其對應的統(tǒng)計圖。細胞缺氧損傷會誘導ROS的產生，過量的ROS會氧化損傷細胞多種DNA、蛋白和脂質，最后導致細胞的凋亡，對細胞造成不可逆損傷。綠色熒光的強弱代表細胞內ROS含量的多少，由圖4可以看出，經過CoCl2刺激后，細胞中綠色熒光明顯增多，與正常組比較，CoCl2組ROS含量為正常組的4倍左右，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

A.細胞拍攝的confocal圖片，綠色熒光為細胞內ROS的含量； B.ROS含量的統(tǒng)計圖。與正常組比較：**P< 0.01。

圖4 300 μmol/L CoCl2化學誘導缺氧條件下N2a細胞內ROS水平

Figure 4 ROS level in N2a cells under hypoxia induced by 300 μmol/L CoCl2

2.5 CoCl2化學誘導缺氧條件下N2a細胞NF-κB表達的影響

由圖5可以看出，正常培養(yǎng)的細胞，經過免疫熒光染色后可發(fā)現(xiàn)NF-κB蛋白(綠色熒光)集中在胞質中，胞核(藍色熒光)清晰，Merge圖可以明顯看到NF-κB蛋白集中表達在細胞質中；而經過CoCl2缺氧培養(yǎng)24 h后，能明顯看到綠色熒光均勻分布在整個細胞中，與正常組相比，細胞核中綠色熒光明顯增多，說明CoCl2誘導促進了NF-κB的入核，而NF-κB信號通路的作用主要是基于NF-κB進入細胞核促進相應的促炎促凋亡基因的轉錄來達到相應的病理進程，進一步確定了CoCl2對細胞的損傷。

2.6 Western blot檢測NF-κB信號通路的表達

由圖6可以看出，正常組細胞IKK、p-IKK、NF-κB、p-NF-κB這兩組蛋白條帶不明顯，蛋白含量較低，而經過CoCl2誘導刺激后各蛋白條帶明顯增寬(圖6A)，由統(tǒng)計圖(圖6B)可以看出，經過CoCl2誘導刺激后IKK、p-IKK、NF-κB、p-NF-κB蛋白含量均增加(P<0.01)，說明CoCl2誘導激活了IKK信號通路，使p-IKK的磷酸化水平增加，同時被激活的還有NF-κB與p-NF-κB，NF-κB進入細胞核，從而誘導一系列反應。

2.7 CoCl2化學誘導缺氧條件下N2a細胞表達NF-κB信號通路激活后對下游凋亡因子表達的影響

由圖7中可以看出，經過CoCl2處理后，Bcl-2蛋白表達降低，而Bax和 Cleaved caspase-3條帶增寬，含量明顯增加，且通過右圖可以看出，各蛋白表達差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)，具體表現(xiàn)為細胞凋亡加劇，促凋亡因子顯著增加，抗凋亡因子顯著降低。

圖5 免疫熒光法測CoCl2化學誘導缺氧條件下N2a細胞NF-κB蛋白的表達( 100×)

Figure 5 Expression of NF-κB in N2a cells under hypoxia induced by CoCl2(100×)

A.不同蛋白的蛋白印記圖； B.對應的統(tǒng)計圖。與正常組比較：**P<0.01。

圖6 CoCl2化學誘導缺氧條件下N2a細胞NF-κB及其相關蛋白的表達
Figure 6 Expression of NF-κB and its related proteins in N2a cells under CoCl2-induced hypoxia

A.不同蛋白的蛋白印記圖； B.對應的統(tǒng)計圖。與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01。

圖7 CoCl2化學誘導缺氧條件下N2a細胞NF-κB下游凋亡因子的表達
Figure 7 Expression of NF-κB downstream apoptosis factors in N2a cells under CoCl2-induced hypoxia

3 討論

目前體外模擬腦卒中的方式有2種，一種為低壓氧艙培養(yǎng)法[5]，通過建立氧糖剝奪模型來模擬缺氧缺糖的環(huán)境，另一種是化學誘導法[6]，在細胞或者組織培養(yǎng)液中添加鐵的螯合劑，阻斷氧信號的轉導。本實驗的目的是評估永久性缺血造成的腦卒中，用氧糖剝奪模型需要特殊的缺氧培養(yǎng)設備來精確控制氧氣濃度，且造模后由于環(huán)境因素容易造成復灌，實驗的穩(wěn)定性不好，限制了其在實驗中的廣泛使用。故用化學誘導法去模擬永久性缺血更適宜。雖然已經有研究應用CoCl2來誘導大鼠腦微血管內皮細胞(BMECs)、PC12細胞、 SH-SY5Y細胞等來評價缺血，但不同的研究中，CoCl2建模的量效關系是不同的，不同細胞的最適宜濃度分布在200～1 000 μmol/L之間[6-9]，且N2a細胞是目前研究神經系統(tǒng)疾病的主要模式細胞，具有類似神經元形態(tài)和功能的特性，能夠很好地反映腦卒中發(fā)生過程中神經細胞的變化。用CoCl2誘導N2a細胞來建立模型，模擬的是永久性缺血造成的腦卒中的病理生理變化，通過對該模型的具體機制研究，可以有針對地研發(fā)藥物來解決永久性缺血所造成的腦損傷。本實驗參照Gotoh等[4]設計永久性缺氧實驗的方式選擇化學誘導法建立模型并進行優(yōu)化，摸索了最適宜的CoCl2誘導N2a細胞缺氧缺糖模型的最適宜條件，通過CCK-8法檢測細胞活力和Tunnel測細胞凋亡2個實驗，同時參考Miglio等[10]選擇缺氧條件的標準，確定300 μmol/L CoCl2誘導缺氧符合構建永久性缺血穩(wěn)定模型的要求。

線粒體膜電位是線粒體形態(tài)和功能完整性的重要指標，測量線粒體膜電位是探究缺氧模型機制的必要條件[11]。實驗采用JC-1進行線粒體染色，正常組線粒體完整、膜電位較高；300 μmol/L CoCl2處理24 h后，線粒體膜電位降低到正常組的60%左右，線粒體膜電位降低，進而發(fā)生一系列級聯(lián)反應，產生大量的ROS。同時，過量的ROS又可以造成線粒體損傷，ROS與線粒體損傷之間產生惡性循環(huán)，進而造成更嚴重的細胞損傷。同時過量ROS又能夠激活下游的MAPK家族及caspase級聯(lián)反應[12]，最終導致細胞凋亡。因此，抑制細胞中過量的ROS、保護線粒體的形態(tài)和功能是開發(fā)治療腦卒中藥物考慮的重要方面。

NF-κB是由5個亞單位構成的同源或異源二聚體。在正常狀態(tài)下與IκB結合以無活性的狀態(tài)留于細胞漿[13]。當細胞受到刺激時，IKKs復合體磷酸化，使IκB發(fā)生構象改變而與NF-κB解離，NF-κB進入細胞核，細胞凋亡相關基因表達增高[14]。此外，有研究指出Bcl-2是通過抑制細胞膜中脂質過氧化反應、抑制活性氧的蓄積發(fā)揮作用的[15-16]，也能夠干擾NF-κB入核的遷移[17]。在本實驗中，細胞經過CoCl2處理后，胞核內的NF-κB含量增加，NF-κB入核明顯，同時下游的凋亡因子蛋白含量增多，抗凋亡因子Bcl-2含量降低。

綜上所述，300 μmol/L CoCl2可以穩(wěn)定誘導N2a細胞缺氧模型，可以顯著抑制細胞活性、誘導細胞凋亡；其主要缺氧損傷機制是通過促凋亡作用產生，而胞內線粒體膜電位的下調、 ROS的含量的增加、NF-κB的入核和促凋亡蛋白含量的增加共同作用誘導了CoCl2對N2a細胞的損傷。