劉小赟，吳小詩(shī)，潘敬靈，梁玉婷，唐春萍，沈志濱,2,3

(1.廣東藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.廣東省局部精準(zhǔn)藥物遞藥制劑工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006； 3.廣東省化妝品工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006)

雄激素性脫發(fā)(androgenetic alopecia,AGA)，又稱為脂溢性脫發(fā)，是一種最常見的脫發(fā)類型[1]。近年來(lái)，隨著生活節(jié)奏加快與壓力的增加，AGA的患病率也逐漸升高，且向年輕化發(fā)展。非那雄胺(finasteride)和米諾地爾(minoxidil)是現(xiàn)代臨床常用于治療AGA的藥物，具有較顯著的治療效果，但與此同時(shí)具有較多的不良反應(yīng)和副作用[2-3]。

女貞子是木犀科女貞屬植物(LigustrumlucidumAit.)女貞果實(shí)，性涼、味干、微苦，歸肝、腎經(jīng)，具有明目烏發(fā)、滋補(bǔ)肝腎功效，常用于治療肝腎陰虛、眩暈耳鳴、腰膝酸軟、須發(fā)早白等病證[4]。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)女貞子的研究主要集中在抗骨質(zhì)疏松、抗癌、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)等作用[5-6]，但女貞子醇提物對(duì)雄激素所致脫發(fā)的促毛發(fā)生長(zhǎng)作用研究還未見報(bào)道。本文通過(guò)女貞子醇提物對(duì)模型小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)的影響評(píng)價(jià)其促毛發(fā)生長(zhǎng)作用，并初步探討其作用機(jī)制，為女貞子在預(yù)防和治療脫發(fā)藥物的進(jìn)一步研究提供有價(jià)值的理論參考依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

Epoch型酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司)；LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司)；UV 2301-II紫外分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司)；BA310-T型生物顯微(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)；JJ-12J型脫水機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)；JB-P5型包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)；RM2016型病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)；JB-L5型凍臺(tái)(武漢俊杰電子有限公司)；KD-P型組織攤片機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)；GFL-230型烤箱(天津市萊玻瑞儀器設(shè)備有限公司)；KH-IⅡ型全自動(dòng)研磨儀(武漢塞維爾生物科技有限公司)；TGL-16型高速低溫離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)。

1.2 主要藥品與試劑

女貞子(果)購(gòu)買于廣州同仁堂藥業(yè)；二氫睪酮ELISA試劑盒(武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司，批號(hào) L190809514)；雌二醇ELISA試劑盒(武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司，批號(hào) L190923228)；睪酮ELISA試劑盒(武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司，批號(hào) L191014889)；丙酸睪酮(98%，上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào) C10232992)；5%米諾地爾酊(廈門美商醫(yī)藥有限公司，批號(hào) 190715)；睪酮(T，>98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào) G1820042)；非那雄胺(>98%，上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào) J1810113)；還原性輔酶II(NADPH，>98%，上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào) C10526802)；二硫蘇糖醇(DTT，>98%，上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào) C10182317)；苯甲基磺酰氟(PMSF，>98%，上海麥克林生化科技有限公司公司，批號(hào) C10090911)；甲醇為色譜純；其余試劑均為分析純，水為去離子水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6小鼠60只，雄性，6周齡，SPF級(jí)，體質(zhì)量 18～25 g，由廣東省動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2018-0002。SD大鼠，3只，雄性，9周齡，SPF級(jí)，體質(zhì)量260～280 g，由廣東省動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2018-0002。

2 方法

2.1 供試樣品的制備

女貞子醇提物的制備：稱取女貞子干燥粉末20 g，采用95%(φ)乙醇回流提取2次，料液比分別為1∶10、1∶8；提取時(shí)間分別為2 h、1.5 h；合并2次濾液，減壓濃縮后，冷凍干燥制成凍干粉，得到女貞子醇提物2.054 g(提取率10.27%)，4 ℃冷藏備用；本文中女貞子醇提物均為95%乙醇提取物。

準(zhǔn)確稱取適量女貞子醇提物，采用75%(φ)乙醇溶解，配置濃度為5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL的女貞子醇提物溶液，作為促毛發(fā)生長(zhǎng)作用實(shí)驗(yàn)中女貞子低、中、高劑量組樣品溶液。

準(zhǔn)確稱取適量女貞子醇提物，采用75%的乙醇溶解，配置濃度為0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL的女貞子醇提物溶液，作為Ⅱ型5α-還原酶抑制活性待測(cè)樣品溶液。

2.2 女貞子醇提物對(duì)雄激素性脫發(fā)C57BL/6小鼠模型毛發(fā)生長(zhǎng)的影響

2.2.1 動(dòng)物分組及給藥方式 米諾地爾是目前臨床常用于治療AGA的外用藥，本實(shí)驗(yàn)采用其作為外用促毛發(fā)生長(zhǎng)作用實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照。雄性 C57BL/6小鼠60只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量編號(hào)并用Excel軟件根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分為6組，使用脫毛膏在其背部脫除約3×4 cm2，皮膚呈粉紅色且無(wú)破損，確認(rèn)小鼠毛囊處于休止期。參考文獻(xiàn)[7]進(jìn)行動(dòng)物造模，除空白組外，各組小鼠背部脫毛區(qū)皮膚皮下多點(diǎn)注射丙酸睪酮溶液5 mg/(kg·d)，丙酸睪酮處理30 min后，各組小鼠背部脫毛區(qū)域涂抹200 μL的藥物溶液，每天1次，連續(xù)35 d?？瞻捉M與模型組給予75%乙醇溶液，米諾地爾組給予5%米諾地爾溶液，女貞子低、中、高劑量組給予女貞子醇提物溶液，小鼠給藥劑量分別為1 mg/(只·d)、2 mg/(只·d)、4 mg/(只·d)。

2.2.2 毛發(fā)生長(zhǎng)狀況觀察 每天觀察各組小鼠脫毛部位皮膚及毛發(fā)生長(zhǎng)狀況，并記錄每只小鼠脫毛區(qū)皮膚顏色由粉紅變成黑色的時(shí)間及開始長(zhǎng)毛發(fā)的時(shí)間，評(píng)價(jià)藥物對(duì)小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)周期的影響。給藥0、7、14、21、28、35 d時(shí)對(duì)每組拍照并記錄毛發(fā)生長(zhǎng)情況評(píng)分結(jié)果。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：未生長(zhǎng)，脫毛區(qū)皮膚呈粉色；1分：脫毛區(qū)皮膚呈灰色(小于20%的增長(zhǎng))；2分：脫毛區(qū)皮膚呈黑色(大于20%小于40%)；3分：脫毛區(qū)皮膚呈黑色并有少許毛發(fā)生長(zhǎng)(大于40%小于60%的生長(zhǎng))；4分：脫毛區(qū)皮膚呈黑色并有部分毛發(fā)生長(zhǎng)(60%～80%的生長(zhǎng))；5分：脫毛區(qū)毛發(fā)基本完全生長(zhǎng)(80%～100%的生長(zhǎng))[8]。

2.2.3 毛發(fā)質(zhì)量的測(cè)定 取血后小鼠脫頸處死，用電動(dòng)刮毛刀刮取每只小鼠背部脫毛區(qū)3×4 cm2面積的毛，用分析天平稱重，求其平均值。

2.2.4 組織學(xué)觀察 刮取毛后，在脫毛部位平行于脊椎處取材，將皮膚修剪成1 cm寬的長(zhǎng)條狀，置4%(φ)多聚甲醛中固定24～36 h后，沖去多聚甲醛，梯度酒精脫水，石蠟包埋，修塊，切片，最后經(jīng)HE染色后，置于光學(xué)顯微鏡下觀察對(duì)比毛囊數(shù)量和形態(tài)差異。

2.2.5 血清及皮膚組織中激素含量的測(cè)定 小鼠過(guò)夜禁食，眼球取血，靜置后離心(3 500 r/min，15 min)，收集上層血清；去除小鼠背部毛后，取背部皮膚，稱重并加入冷卻的生理鹽水(1∶10，W/V)進(jìn)行勻質(zhì)，在相同條件下離心勻漿液，取上清。按相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書，用ELISA法測(cè)定血清和皮膚勻漿中睪酮(Testosterone，T) 、二氫睪酮(Dihydrotestosterone，DHT) 以及雌二醇( Estradiol，E2)濃度。

2.3 女貞子醇提物對(duì)Ⅱ型5α-還原酶的抑制作用

采用體外微量酶反應(yīng)體系測(cè)定其對(duì)Ⅱ型5α-還原酶的抑制活性。非那雄胺為特異性Ⅱ型5α-還原酶抑制劑[9]，臨床常用于口服治療雄激素依賴性疾病，本實(shí)驗(yàn)采用其作為陽(yáng)性對(duì)照。

取雄性SD大鼠3只，禁食不禁水12 h后脫頸處死，取出腹側(cè)前列腺及附睪并稱質(zhì)量，將組織在冰臺(tái)上剪碎，用預(yù)冷的勻漿液(20 mmol/L磷酸緩沖液，pH 5.5，1 mmol/L DTT，1 mmol/L PMSF)在玻璃勻漿器中制成1∶5勻漿液(g/mL)，離心后合并上清液得Ⅱ型5α-還原酶。以睪酮為底物，加入Ⅱ型5α-還原酶粗酶和還原型輔酶Ⅱ(NADPH)組成酶反應(yīng)體系，體系組成見表1，37 ℃孵育1 h后加入2.5 mL二氯甲烷后終止反應(yīng)，混勻，離心15 min(5 000 r/min)，取有機(jī)層旋干后，加入甲醇溶解定容至1 mL，用0.22 μm 濾膜過(guò)濾，采用高效液相色譜法檢測(cè)睪酮消耗量。試驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)平行樣品。

色譜條件：色譜柱(COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ柱(4.6 mm×250 mm，5 μm))；柱溫為30 ℃；流動(dòng)相為甲醇-水(70/30，V/V)；流速1 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL；檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)242 nm。

通過(guò)色譜測(cè)定反應(yīng)液中睪酮的含量，抑制活性的強(qiáng)弱用抑制率表示，公式如下：

轉(zhuǎn)化率(%)=受試藥物組睪酮濃度的變化值/空白對(duì)照組睪酮濃度的變化值×100%

抑制率(%)=(空白對(duì)照組睪酮濃度的變化值-受試藥物組睪酮濃度的變化值)/空白對(duì)照組睪酮濃度的變化值×100%

表1 Ⅱ型5α-還原酶的抑制活性研究反應(yīng)體系

注：-表示該項(xiàng)未添加。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 女貞子醇提物對(duì)雄激素性脫發(fā)模型小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)的影響

3.1.1 毛發(fā)生長(zhǎng)情況 各組小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)情況及毛發(fā)質(zhì)量見表2，毛發(fā)生長(zhǎng)情況評(píng)分見圖1。

與空白組相比，模型組小鼠的皮膚變色時(shí)間及長(zhǎng)毛時(shí)間均明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，第35天時(shí)毛發(fā)質(zhì)量明顯減少(P<0.05)。結(jié)果表明皮下注射丙酸睪酮對(duì)C57BL/6小鼠的毛發(fā)生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。與模型組相比，米諾地爾組和女貞子醇提物各組的皮膚變色時(shí)間，長(zhǎng)毛時(shí)間及毛發(fā)質(zhì)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明米諾地爾和女貞子醇提物均在一定程度上能緩解丙酸睪酮對(duì)C57BL/6小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)的抑制作用。

表2 各組小鼠的毛發(fā)生長(zhǎng)情況

組別皮膚變色時(shí)間/d皮膚長(zhǎng)毛時(shí)間/d毛發(fā)質(zhì)量/mg空白組8.5±1.9 13.5±2.2 79.92±7.41 模型組19±2.3*23±2.9*13.97±5.84*米諾地爾組10±0.8#15.6±0.9#51.68±2.12#女貞子低劑量組12.4±2.4#17.0±1.4#32.20±5.48#中劑量組13.2±2.5#16.8±2.3#44.38±3.68#高劑量組15.8±3.3#19.8±3.1#33.76±6.35#

與空白組比較：*P<0.05； 與模型組比較：#P<0.05。

圖1 毛發(fā)生長(zhǎng)情況評(píng)分
Figure 1 Hair growth score

3.1.2 組織學(xué)觀察 皮膚橫切面用于測(cè)定毛囊數(shù)(圖2A-F)。在40倍光學(xué)顯微鏡下觀察6個(gè)不同區(qū)域的毛囊數(shù)量，選定區(qū)域內(nèi)空白組小鼠的平均毛囊數(shù)為182±5，模型組的為74±9。與空白組相比，模型組毛囊數(shù)量明顯降低(P<0.05)，米諾地爾組和女貞子醇提物各組的毛囊數(shù)分別為162±22、126±18、154±21和145±22，與模型組相比有顯著增加(P<0.05)。

從皮膚縱切面獲得的毛囊形態(tài)如圖3A-F所示，空白組小鼠的毛囊數(shù)量多且形態(tài)完整，此時(shí)毛囊已進(jìn)入休止期，黑色素形成停止(圖3A)；模型組毛囊形態(tài)較短且稀疏，毛囊下端退化，毛乳頭變細(xì)，內(nèi)毛根鞘部分消失，毛發(fā)呈桿狀末端(圖3B)；米諾地爾組(圖3C)和女貞子醇提物(圖3D-F)各組毛囊數(shù)量較多，毛囊長(zhǎng)而大，黑色素形成明顯，由此可知，米諾地爾和女貞子醇提物均能夠改善丙酸睪酮引起的毛囊微型化，維持毛囊正常形態(tài)。

A.空白組； B.模型組； C.米諾地爾組； D.女貞子低劑量組； E.女貞子中劑量組； F.女貞子高劑量組。

圖2 女貞子醇提物對(duì)毛囊數(shù)量的影響(HE染色，40×)

Figure 2 Effect of ethanol extract of Ligustri Lucidi Fructus on hair follicle count (HE staining,40×)

3.1.3 血清及皮膚組織中激素含量 結(jié)果見圖4A-H。與空白組比較，模型組小鼠血液和皮膚組織中T和DHT含量均顯著升高(P<0.05)，E2含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，T/E2比值顯著增大(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該雄激素源性脫發(fā)模型小鼠血液和皮膚組織中T和DHT含量升高，性激素平衡狀態(tài)改變，模型建立成功。與模型組比較，女貞子醇提物低劑量組血清中T含量顯著降低(P<0.05)，E2和DHT含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，T/E2比值顯著降低(P<0.05)；皮膚組織中的T和DHT含量均顯著降低(P<0.05)，E2含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，T/E2比值顯著降低(P<0.05)；中劑量組與高劑量組血清和皮膚組織中T、DHT含量均顯著性降低(P<0.05)，E2含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，T/E2比值顯著降低(P<0.05)；米諾地爾組的各項(xiàng)激素含量與模型組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.2 女貞子醇提物對(duì)Ⅱ型5α-還原酶的抑制作用

配制質(zhì)量濃度為1.69、3.38、6.76、13.52、27.04、54.08、108.15 μg/mL的睪酮溶液進(jìn)行液相色譜分析，以濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，制作睪酮標(biāo)準(zhǔn)曲線。睪酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=69 584X-37 693，R2=0.999 9，表明睪酮在1.69～108.15 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系，可以用于含量測(cè)定。睪酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖見圖5。

樣品對(duì)Ⅱ型5α-還原酶的抑制活性見表3。與空白對(duì)照組相比，女貞子醇提物3個(gè)劑量組的睪酮轉(zhuǎn)化率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，當(dāng)體外劑量大于1 mg/mL時(shí)，可極顯著降低睪酮轉(zhuǎn)化率(P<0.01)，抑制率可達(dá)(81.49±4.03)%，具有明顯抑制Ⅱ型5α-還原酶活性。

A.空白組； B.模型組； C.米諾地爾組； D.女貞子低劑量組； E.女貞子中劑量組； F.女貞子高劑量組。

圖3 女貞子醇提物對(duì)毛囊狀態(tài)的影響(HE染色，40×)

Figure 3 Effect of ethanol extract of Ligustri Lucidi Fructus on morphology of hair follicle (HE staining,40×)

1.空白組； 2.模型組； 3.米諾地爾組； 4.女貞子低劑量組； 5.女貞子中劑量組； 6.女貞子高劑量組。與空白組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05。

圖4 女貞子醇提物對(duì)血清和皮膚中激素水平的影響

Figure 4 Effect of ethanol extract of Ligustri Lucidi Fructus on androgen levels in serum and skin(n=10)

圖5 睪酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖

Figure 5 HPLC chromatogram of testosterone standard solution

表3 女貞子醇提物對(duì)Ⅱ型5α-還原酶的抑制活性

組別劑量/ (mg·mL-1)轉(zhuǎn)化率/%抑制率/%空白組-29.82±1.62-陽(yáng)性對(duì)照組1 μmol/L 4.83±1.71**84.00±3.89女貞子低劑量組0.5 16.29±0.71*38.93±2.67中劑量組1 5.35±1.73**81.49±4.03高劑量組2 5.14±1.56**80.72±3.13

與空白組比較：*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

C57BL/6小鼠動(dòng)物模型常用于研究毛發(fā)生長(zhǎng)周期及評(píng)估促毛發(fā)生長(zhǎng)活性，通過(guò)對(duì)毛發(fā)生長(zhǎng)周期和皮膚組織切片的觀察，女貞子醇提物各劑量組小鼠毛發(fā)質(zhì)量、毛囊數(shù)量顯著增加(P<0.05),證實(shí)了女貞子醇提物對(duì)雄激素性脫發(fā)模型小鼠具有明顯的促毛發(fā)生長(zhǎng)作用。雄激素性脫發(fā)與多種因素有關(guān)，其中雄激素及Ⅱ型5α-還原酶在毛發(fā)生長(zhǎng)中起主要的調(diào)節(jié)作用[10]，此外頭發(fā)毛囊外根鞘中的P450芳香酶將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素E2，也會(huì)抑制毛發(fā)的生長(zhǎng)[11]。通對(duì)血清和皮膚組織中各激素水平的檢測(cè)，結(jié)果表明女貞子醇提物能明顯降低血清和皮膚組織中雄激素水平(P<0.05)，尤其是皮膚組織中的DHT水平，有效改善雄激素引起的毛發(fā)減少和生長(zhǎng)緩慢的現(xiàn)象；而米諾地爾對(duì)睪酮引起的雄激素水平升高沒(méi)有顯著影響，與文獻(xiàn)報(bào)道[12]一致，其主要育發(fā)作用機(jī)制包括擴(kuò)張頭皮血管，改善微循環(huán)和促進(jìn)毛乳頭細(xì)胞中的VEGF和FGF-7的分泌等。各實(shí)驗(yàn)組小鼠血清和皮膚組織中E2含量不具有顯著性差異，當(dāng)女貞子醇提物生藥濃度為1 mg/mL時(shí)，對(duì)Ⅱ型5α-還原酶的抑制率可達(dá)(81.49±4.03)%。由此可見，在丙酸睪酮誘導(dǎo)產(chǎn)生雄激素性脫發(fā)模型小鼠的過(guò)程中，Ⅱ型5α-還原酶的活性增高起到至關(guān)重要的影響，而P450芳香酶無(wú)明顯的影響作用。

有研究表明女貞子可使小鼠觸須毛囊毛乳頭分泌VEGF和HGF增加從而促進(jìn)毛囊生長(zhǎng)[14]，結(jié)合本研究結(jié)果，女貞子在促毛發(fā)生長(zhǎng)過(guò)程中不僅影響重要的細(xì)胞因子，還可以降低雄激素水平，從而起到促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)，維持毛囊形態(tài)的作用，在治療雄激素性脫發(fā)中具有一定的優(yōu)勢(shì)，其對(duì)頭皮微循環(huán)的影響仍在進(jìn)一步研究中。本研究為女貞子醇提物在預(yù)防和治療雄激素性脫發(fā)藥物的進(jìn)一步研發(fā)提供了重要的參考價(jià)值。