王樂旬，吳惠娟，張盛昔，韋曲星，胡因銘，郭姣

(廣東藥科大學(xué) 廣東省代謝病中西醫(yī)結(jié)合研究中心/廣東省代謝性疾病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗室，廣東 廣州510006)

炎癥是一種重要的病理過程，是機(jī)體組織對損傷因素作出的防御反應(yīng)。在炎癥反應(yīng)及相關(guān)疾病發(fā)生過程中，巨噬細(xì)胞作為主要的參與細(xì)胞發(fā)揮了重要的作用。在體外實(shí)驗中，常以LPS誘導(dǎo)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞作為炎癥細(xì)胞模型。LPS可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生多種炎性細(xì)胞因子和趨化因子[1]，均可引起和促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展。該細(xì)胞模型被廣泛用于研究天然產(chǎn)物、化合物或藥物對炎癥反應(yīng)的調(diào)控及機(jī)制[1-2]。

山楂酸(maslinic acid，MA)是一種五環(huán)三萜酸，為復(fù)方貞術(shù)膠囊(FTZ)的重要有效成分，來源于配伍單味藥女貞子中[3]。此外，其還天然存在于包括橄欖等在內(nèi)的多種植物中[4]。研究顯示，MA具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒和降血糖等多種藥理活性[3-4]。在調(diào)控炎癥方面，MA不僅抑制動物模型中炎癥細(xì)胞在炎癥組織中的浸潤，還可抑制細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)[5-7]。但MA在巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用及其具體機(jī)制仍未明確。

本研究以LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7作為體外炎癥細(xì)胞模型，觀察MA對炎癥狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)炎癥因子mRNA水平及其蛋白表達(dá)的影響，并探討其對AKT、ERK、STAT3和p65等炎癥相關(guān)信號通路蛋白的調(diào)控，明確MA對炎癥反應(yīng)的作用及其機(jī)制，為其在抗炎的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

MA購自Selleck公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)和脂多糖(LPS)為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；青/鏈霉素、胎牛血清、DMEM低糖培養(yǎng)基(葡萄糖濃度為1 g/L)、HRP標(biāo)記的羊抗兔和羊抗鼠IgG購自Thermo Fisher Scientific公司；NC膜購自Millipore公司；GAPDH一抗購自ProteinTech公司；p-STAT3、STAT3、p-p65、p65、p-AKT、AKT、p-ERK和ERK抗體購自Cell Signaling Technology公司；ECL發(fā)光液購自武漢聚能慧達(dá)生物科技有限公司；IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-12和CCL2的ELISA試劑盒購自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司；RNAiso-Plus試劑購自Takara公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒為TOYOBO公司產(chǎn)品；蛋白定量試劑盒是武漢博士德生物工程有限公司的產(chǎn)品；Western細(xì)胞裂解液和牛血清白蛋白(BSA)為上海碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞

小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞，購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，用含有100 U/mL的青霉素、0.1 mg/mL的鏈霉素和10%(φ)胎牛血清的DMEM于37 ℃，含5%(φ)CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 儀器

5810R離心機(jī)購自Eppendorf公司；NanoDrop 2000核酸濃度測定儀為Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；CLARIO star酶標(biāo)儀購自德國BMG LabTech公司；LightCycler 480熒光定量PCR儀為Roche公司產(chǎn)品；電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀購自Bio-Rad公司。

1.4 MTT檢測

取處于對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞種于96孔板中，每孔含有1×104個細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的MA(0、0.625 μmol/L、1.25 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L)，培養(yǎng)24 h后，每孔加MTT(PBS稀釋，5 mg/mL)20 μL，然后繼續(xù)培養(yǎng)4 h。去上清，加150 μL的DMSO，用移液器吹勻，酶標(biāo)儀570 nm波長檢測吸光度，根據(jù)吸光度進(jìn)行后續(xù)分析。

1.5 細(xì)胞處理

將對數(shù)期生長期的RAW264.7細(xì)胞種于6孔培養(yǎng)板中，每孔1×106個細(xì)胞，加入不同濃度的MA預(yù)處理12 h后，加入LPS(50 ng/mL)，設(shè)置對照組、LPS組、MA5組(5 μmol/L)、MA10組(10 μmol/L)、LPS+MA5組和LPS+MA10組，然后處理8 h或24 h，收集細(xì)胞提取mRNA、培養(yǎng)上清或細(xì)胞蛋白質(zhì)進(jìn)行后續(xù)檢測試驗。

1.6 mRNA提取和Q-PCR

mRNA的提取以及Q-PCR過程詳見參考文獻(xiàn)[9]。引物由上海英濰捷基公司合成，序列見表1。

表1 Q-PCR引物序列Table 1 Primer sequences for Q-PCR

1.7 Western blot

實(shí)驗過程參考文獻(xiàn)[9]。將不同處理的細(xì)胞利用預(yù)冷的PBS洗滌2次后，加入適量的細(xì)胞裂解液，吹打混勻，12 000 r/min、4 ℃、離心15 min；取上清，定量，加入適量上樣buffer后100 ℃，煮5 min，行SDS-PAGE電泳；轉(zhuǎn)膜，5%的BSA封閉，一抗過夜，二抗室溫孵育1 h后，暗房ECL曝光，晾干膠片，掃描分析。

1.8 ELISA

收取不同處理組培養(yǎng)24 h后的上清，按照試劑盒說明書檢測上清中細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α和CCL2的含量，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MA對細(xì)胞增殖的影響

首先利用不同濃度的MA處理RAW264.7細(xì)胞，利用MTT檢測細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示，在20 μmol/L濃度內(nèi)，對細(xì)胞的增殖沒有影響，40 μmol/L及以上濃度能夠顯著抑制細(xì)胞的增殖(P<0.01)(圖1)。據(jù)此，選擇5 μmol/L和10 μmol/L 2個不影響細(xì)胞增殖的濃度進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗。

2.2 MA對LPS誘導(dǎo)的炎癥因子mRNA水平的影響

利用LPS誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞模型驗證MA對炎癥的影響，結(jié)果如圖2顯示，和對照組相比，LPS處理能夠顯著增加RAW264.7細(xì)胞中IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α、CCL2和iNOS的mRNA水平(均P<0.01)。和LPS處理相比，MA聯(lián)合處理后，能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的IL-1β、IL-6、IL-12、CCL2和iNOS的mRNA水平的增加(均P<0.01或P<0.05)，且這種抑制具有劑量依賴性。而單獨(dú)利用MA處理細(xì)胞，沒有對上述炎癥因子的mRNA水平產(chǎn)生明顯的影響。

和對照組(0)比較：**P<0.01。

圖1 MA對細(xì)胞增殖的影響

Figure 1 Effect of MA on cell proliferation

2.3 MA對LPS誘導(dǎo)的炎癥因子蛋白水平的影響

通過ELISA方法檢測了培養(yǎng)上清中炎癥因子的水平，結(jié)果如圖3所示，和對照組相比，LPS處理能夠顯著刺激巨噬細(xì)胞中IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α和CCL2的分泌，使得培養(yǎng)上清中的含量顯著增加(均P<0.01)。和LPS處理組相比，LPS+MA5處理組中的IL-1β和IL-12蛋白水平顯著下降(均P<0.01)，LPS+MA10處理組中IL-1β、IL-6、IL-12和CCL2的蛋白水平顯著下降(均P<0.01)。

2.4 MA對炎癥相關(guān)信號通路的影響

結(jié)果如圖4所示，和對照組相比，LPS處理能夠顯著增加細(xì)胞中p65、STAT3、ERK和AKT的磷酸化水平(均P<0.01)。和LPS組相比，盡管LPS+MA5處理組中的p65、STAT3和AKT的磷酸化水平?jīng)]有顯著下降，但都具有下降的趨勢；而LPS+MA10處理組中的p65、STAT3和AKT的磷酸化水平顯著降低(均P<0.05)。而在LPS單獨(dú)處理或與MA連用處理中，。ERK的磷酸化沒有明顯的改變。

與對照組比較：##P<0.01； 與LPS組比較：*P<0.05，**P<0.01。

圖2 MA對炎癥因子mRNA水平的影響
Figure 2 Effect of MA on the mRNA levels of inflammatory factors

與對照組比較：##P<0.01； 與LPS組比較：**P<0.01。

圖3 MA對炎癥因子蛋白水平的影響
Figure 3 Effect of MA on the protein levels of inflammatory factors [ρ/(pg·mL-1)]

除了p65和STAT3的磷酸化受到抑制外，單獨(dú)MA處理對上述其余蛋白的磷酸化及所有蛋白的總蛋白沒有明顯影響。

3 討論

炎癥是一種基本的病理過程，在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演中重要角色。炎癥也是糖脂代謝性疾病的一個顯著特征，既可由糖脂代謝紊亂引起，也可促進(jìn)糖脂代謝病的發(fā)生和發(fā)展，使其成為糖脂代謝性疾病臨床和基礎(chǔ)研究的重要方向[10]。本研究探討了糖脂代謝性疾病治療復(fù)方中藥“復(fù)方貞術(shù)膠囊”中有效成分MA的抗炎作用。研究證實(shí)，MA能夠抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)，機(jī)制上是通過抑制p65、STAT3和AKT介導(dǎo)的信號通路實(shí)現(xiàn)的。

MA對細(xì)胞增殖的不同影響。動物水平上的研究顯示，8 mg/kg，16 mg/kg和32 mg/kg劑量的MA在皮下注射8 d后，并沒有對小鼠的體質(zhì)量、外周血中T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的增殖產(chǎn)生明顯的影響[11]。本研究在細(xì)胞水平上驗證了MA對細(xì)胞增殖的影響。和上述結(jié)果類似，在20 μmol/L濃度內(nèi)，MA對RAW246.7細(xì)胞的增殖沒有影響，而在40 μmol/L或以上，MA能夠顯著抑制細(xì)胞的增殖。所以，本研究選擇了5 μmol/L和10 μmol/L 2個對細(xì)胞增殖沒有影響的濃度研究其對炎癥反應(yīng)的影響。

和對照組比較：##P<0.01； 與LPS組比較：*P<0.05。

圖4 MA對炎癥信號通路相關(guān)蛋白水平的影響
Figure 4 Effect of MA on the protein levels of inflammatory signaling pathways

糖脂代謝病的核心病理機(jī)制之一是慢性炎癥反應(yīng)，其治療中藥復(fù)方貞術(shù)膠囊可能具有抑制炎癥的作用。在動物水平上，本課題組驗證復(fù)方貞術(shù)膠囊能夠顯著降低糖尿病模型鼠血液中炎癥因子IL-6、CCL2和IL-1β的水平(結(jié)果未發(fā)表)。這提示復(fù)方貞術(shù)膠囊中的某些成分具有抑制炎癥反應(yīng)的作用。有研究顯示，來源于橄欖的MA能夠抑制膠原蛋白抗體所致的關(guān)節(jié)炎模型鼠關(guān)節(jié)中炎癥相關(guān)因子IL-1β和TNF-α的mRNA水平[6]以及抑制由LPS和D-半乳糖胺聯(lián)合誘導(dǎo)的急性肝損傷模型鼠血液中TNFF-α和IL-6的水平[5]。在細(xì)胞水平上，MA能夠抑制LPS刺激的星形膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α和iNOS的mRNA和蛋白質(zhì)水平的升高[8]以及小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中TNF-α和IL-6的蛋白質(zhì)水平的增高[7]。和上述的研究結(jié)果類似，本研究證實(shí)在體外實(shí)驗中，MA能夠抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中IL-1β、IL-6、IL-12和CCL2的mRNA及蛋白質(zhì)水平的增加。這提示MA是復(fù)方貞術(shù)膠囊抑制炎癥作用的效應(yīng)分子之一。

在機(jī)制上，有研究顯示MA是通過抑制LPS誘導(dǎo)的p65的活化以及IκB-α的磷酸化來抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子的表達(dá)[6,8]。和上述研究結(jié)果類似，本研究證實(shí)，MA能夠抑制LPS誘導(dǎo)的p65活化(磷酸化水平增加)。此外，STAT3、ERK和AKT在炎癥反應(yīng)中也發(fā)揮著重要作用[9,12-13]。本研究也證實(shí)LPS可誘導(dǎo)ERK、STAT3和AKT的磷酸化水平增加，而MA能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的STAT3和AKT活化。這表明MA抑制炎癥反應(yīng)除了與NF-κB通路有關(guān)外，還與STAT3和AKT介導(dǎo)的通路有關(guān)。

綜上，MA具有抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥作用，其機(jī)制可能與抑制p65、STAT3和AKT的活化減少炎性因子表達(dá)有關(guān)。本研究將為后續(xù)MA及其組方藥“復(fù)方貞術(shù)膠囊”對炎性相關(guān)疾病的防治作用研究提供了理論依據(jù)和實(shí)驗基礎(chǔ)。