謝鑫榮 朱春璐 袁子民 喬宇航 劉婉瀅 張嘉玉 張馨如 吳思語(yǔ)

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600

白芷藥用歷史悠久，具有解表散寒、祛風(fēng)止痛、宣通鼻竅等功效，其古代記載有酒浸、酒蒸、酒炒、醋制、鹽水炒等多種炮制方法，但現(xiàn)代很少應(yīng)用。酒燉白芷主要用于2015版《中國(guó)藥典》一部收載的成方制劑“都梁丸”中，制備方法為取白芷飲片，加入黃酒(每100 kg白芷加入黃酒20 kg)，經(jīng)悶潤(rùn)、隔水蒸制后干燥制得。酒燉白芷由于黃酒成分的引入及受熱炮制作用可使其化學(xué)成分及藥效作用與白芷存在差異，前期化學(xué)成分研究中發(fā)現(xiàn)酒燉白芷中含有與白芷基本相同的化學(xué)成分，只是含量有所差異[1-2]，但引入的黃酒的成分，由于技術(shù)限制尚需進(jìn)一步研究。目前，白芷在抗偏頭痛、治療鼻炎、抗癲癇等[3]藥理作用方面報(bào)道較多，但白芷經(jīng)黃酒炮制制成酒燉白芷后，是否對(duì)其藥效產(chǎn)生影響或具有增強(qiáng)藥效作用及都梁丸中為何采用酒燉白芷而不采用白芷入藥，還需結(jié)合藥效作用機(jī)制進(jìn)一步深入研究。因此，為增加酒燉白芷炮制品在抗偏頭痛、治療鼻炎、抗癲癇等疾病方面的應(yīng)用，筆者擬以黃酒與白芷中所含的主要化學(xué)成分作為酒燉白芷中可能含有的活性成分為篩選對(duì)象，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，著重探討酒燉白芷在抗偏頭痛、治療鼻炎、抗癲癇的藥效作用機(jī)制，并綜合分析活性成分靶點(diǎn)、相關(guān)生物信號(hào)通路與疾病的關(guān)聯(lián)性，為酒燉白芷炮制機(jī)理、藥效作用機(jī)制的深入研究及其在臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

ChembioDraw Ultra軟件(Version 13.0)、Cytoscape軟件(Version 3.6.1)、R軟件、UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.drugbank.ca)、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)、String數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org)、TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)、PharmMapper Serve數(shù)據(jù)庫(kù)(http://59.78.96.61/pharmmapper)。

2 方法

2.1 酒燉白芷活性成分的篩選 酒燉白芷為白芷經(jīng)輔料黃酒炮制制得，其所含主要的化學(xué)成分可能主要源于白芷與黃酒中的成分。通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲取白芷的化學(xué)成分，以類藥性(DL)≥0.18和口服生物利用度(OB)≥30%為篩選條件，選取DL≥0.18和OB≥30%的化學(xué)成分作為白芷的潛在藥效成分。由于酒燉白芷經(jīng)輔料黃酒炮制，經(jīng)對(duì)黃酒的活性成分進(jìn)行文獻(xiàn)的挖掘與整理，同時(shí)列為酒燉白芷的活性成分。

2.2 作用靶點(diǎn)的獲取 采用ChembioDraw Ultra軟件繪制活性成分三維結(jié)構(gòu)圖，以SYBYL2(*.mol2)格式保存，并通過(guò)PubChem和TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)驗(yàn)證，將活性成分的SYBYL2(*.mol2)格式文件上傳到PharmMapper Serve數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取靶點(diǎn)信息，再將該數(shù)據(jù)庫(kù)中Uniplot一欄上傳到UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中并將限定選為人，將靶點(diǎn)名稱校正為官方名稱。

2.3 疾病相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 在GeneCards、DrugBank和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入migraine(cephalagra、hemicrania、antimigraine)、rhinitis(nasitis)和epilepsia(epilepsy、hieronosus)搜索文獻(xiàn)已報(bào)道的與偏頭痛、鼻炎和癲癇相關(guān)的基因，去除重復(fù)的和假陽(yáng)性基因，與上述PharmMapper Serve數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)比分析，得到活性成分中的抗偏頭痛、鼻炎以及癲癇的潛在作用靶點(diǎn)。

2.4 通路富集與分析 將通用蛋白編號(hào)(Uniprot ID)導(dǎo)入R軟件中，對(duì)所有蛋白的編碼基因進(jìn)行GO注釋分析和KEGG通路分析，計(jì)算各通路P值并預(yù)測(cè)相關(guān)靶點(diǎn)蛋白參與表達(dá)的生物學(xué)通路(P<0.05)，采用Cytoscape軟件構(gòu)建酒燉白芷的靶點(diǎn)通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2.5 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將酒燉白芷的活性成分、作用靶點(diǎn)、相關(guān)疾病、通路導(dǎo)入Cytoscape軟件中，構(gòu)建活性成分-作用靶點(diǎn)、疾病-作用靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，以探究酒燉白芷在抗偏頭痛、鼻炎以及癲癇方面的藥效作用機(jī)制。

3 結(jié)果

3.1 酒燉白芷活性成分的篩選 從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得223個(gè)白芷化學(xué)成分，以DL≥0.18和OB≥30%為篩選條件，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，共獲取17個(gè)活性成分。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，結(jié)合黃酒中化學(xué)成分的性質(zhì)，選取含量高、無(wú)揮發(fā)性、耐熱性的10個(gè)成分作為黃酒的主要活性成分，將篩選出的白芷中的17個(gè)成分與黃酒中的10個(gè)成分，即共27個(gè)成分為酒燉白芷主要活性成分，結(jié)果見(jiàn)表1。

3.2 靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 將表1中27個(gè)活性成分在PharmMapper Serve數(shù)據(jù)庫(kù)中返回的潛在作用靶點(diǎn)按匹配度(Fit)降序排列，各取前25個(gè)靶點(diǎn)，除去重復(fù)項(xiàng)后得到144個(gè)基因靶點(diǎn)，通過(guò)GeneCards、DrugBank和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)與相關(guān)基因進(jìn)行對(duì)比，篩選與抗偏頭痛、鼻炎和癲癇相關(guān)聯(lián)的可能潛在作用靶點(diǎn)，分別為60個(gè)、51個(gè)、17個(gè)，表2列舉Degree值排名前10的靶點(diǎn)蛋白。

表1 酒燉白芷的活性成分

表2 酒燉白芷活性成分潛在靶點(diǎn)

續(xù)表2

表2 酒燉白芷活性成分潛在靶點(diǎn)

3.3 活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建和分析 構(gòu)建的酒燉白芷活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(圖1)，圖中共有171個(gè)節(jié)點(diǎn)，678條線，紅色菱形節(jié)點(diǎn)代表酒燉白芷的活性成分(外圍是白芷的活性成分，內(nèi)環(huán)是黃酒的活性成分)，綠色圓形節(jié)點(diǎn)代表作用靶點(diǎn)，灰色細(xì)線代表活性成分與作用靶點(diǎn)間相互關(guān)聯(lián)。表明酒燉白芷的藥效作用具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。

3.4 通路富集與分析 采用R軟件對(duì)酒燉白芷靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行KEGG通路富集，共富集134條，其中P值<0.05的有117條，部分通路信息(見(jiàn)圖2)。表明酒燉白芷主要通過(guò)環(huán)磷酸腺苷、環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷-依賴性蛋白激酶、T細(xì)胞受體、Ras、MAPK、雌激素、PI3K/Akt、VEGF和Mtore等9條信號(hào)通路發(fā)揮抗偏頭痛、鼻炎、癲癇的藥效作用；GO注釋分析表明在生物過(guò)程中這些靶點(diǎn)主要涉及蛋白質(zhì)磷酸化、肽基酪氨酸磷酸化、肽基酪氨酸修飾；在分子功能中主要涉及蛋白酪氨酸激酶活性、激酶調(diào)節(jié)活性、RAS鳥(niǎo)苷酸交換因子活性、鳥(niǎo)苷酸交換因子活性等方面；在細(xì)胞組成中主要涉及膜質(zhì)側(cè)、膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等方面，GO注釋分析信息見(jiàn)圖3。圖4為靶點(diǎn)-通路-疾病圖，其中紅點(diǎn)為疾病，藍(lán)點(diǎn)為通路，黃點(diǎn)為靶點(diǎn)。

4 討論

研究結(jié)果表明，酒燉白芷主要通過(guò)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷-依賴性蛋白激酶(cGMP-PKG)、MAPK信號(hào)通路發(fā)揮抗偏頭痛藥效作用。同時(shí)在調(diào)控MAPK信號(hào)通路發(fā)揮抗偏頭痛中，酒燉白芷共富集22個(gè)靶點(diǎn)，而生白芷為15個(gè)；酒燉白芷主要通過(guò)調(diào)控環(huán)腺苷-磷酸、T細(xì)胞受體和Ras信號(hào)通路發(fā)揮抗偏頭痛作用，與生白芷相比，酒燉白芷在各個(gè)通路富集靶點(diǎn)多，并比生白芷多了雌激素、cGMP-PKG兩條信號(hào)通路。有研究表明NO被認(rèn)為是引起原發(fā)性偏頭痛的觸發(fā)物，可舒張平滑肌，擴(kuò)張腦內(nèi)血管，進(jìn)而增加痛覺(jué)的傳導(dǎo)，導(dǎo)致中樞敏化[4]。腦血管神經(jīng)末梢內(nèi)含有NOS，在NOS催化下，L-精氨酸產(chǎn)生NO，通過(guò)與G蛋白偶聯(lián)的膜受體結(jié)合激活可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，從而使細(xì)胞內(nèi)鳥(niǎo)苷酸(cGMP)水平升高。NO并可誘導(dǎo)三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞合成和分泌CGRP，CGRP是目前最強(qiáng)血管擴(kuò)張藥物，對(duì)腦、心血管最為明顯。CGRP通過(guò)平行的信號(hào)通路，增加腺苷酸環(huán)化酶和環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的產(chǎn)生[5]。對(duì)抗CGRP和NO信號(hào)的化合物、CGRP拮抗劑和NO合成酶抑制劑均可減輕偏頭痛。另外，MAPK是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，MAPK家族主要包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 (ERK) 、c-Jun氨基末端激酶 (JNK) 和p38絲裂原活化蛋白激酶 (p38MAPK)，分別介導(dǎo)3條并行的MAPK信號(hào)通路[6]。TNF-α和IL-6等炎性因子可通過(guò)上調(diào)p-ERK1/2、p-p38及p-JNK的表達(dá)，激活MAPK通路，進(jìn)而在細(xì)胞的增殖、凋亡、炎癥及免疫等多方面發(fā)揮關(guān)鍵的作用[7-9]。因此，推測(cè)酒燉白芷可能通過(guò)調(diào)控cAMP信號(hào)通路和cGMP-PKG信號(hào)通路，降低CGRP和NO的產(chǎn)生和分泌，并通過(guò)阻斷MAPK通路，減少炎癥因子的釋放，發(fā)揮抗偏頭痛的作用。

研究發(fā)現(xiàn)酒燉白芷抗鼻炎的作用可能與PI3K/Akt、VEGF通路有關(guān)，PI3K/Akt通路是VEGF誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞存活和遷移的重要信號(hào)分子，ERK通路也涉及細(xì)胞存活和遷移的調(diào)節(jié)[10]，P13K、Akt和ERK1/2的磷酸化水平與VEGR的產(chǎn)生具有一致的趨勢(shì)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和MMP-9在促進(jìn)鼻黏膜組織腫脹與腺體分泌亢進(jìn)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。VEGF可能是MMP-9高表達(dá)的誘導(dǎo)因素[11]，可促進(jìn)血管增生及通透性，參與鼻腔黏膜腫脹及腺體分泌亢進(jìn)過(guò)程。酒燉白芷可能通過(guò)抑制PI3K/Akt通路和ERK通路，可以顯著降低VEGF的產(chǎn)生，下調(diào)MMP-9的表達(dá)發(fā)揮抗鼻炎的作用。另外，酒燉白芷還可能通過(guò)調(diào)控P13K/AKt和ERK1/2信號(hào)通路發(fā)揮抗癲癇作用。在癲癇發(fā)生過(guò)程中，短期內(nèi)即可促使信號(hào)通路被激活表達(dá)p-ERK1/2，通過(guò)調(diào)節(jié)ERK1/2信號(hào)通路，可對(duì)癲癇發(fā)作產(chǎn)生拮抗作用[12]；其中PI3K/AKt信號(hào)通路是調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞各項(xiàng)活動(dòng)的重要通路之一，廣泛參與神經(jīng)元細(xì)胞的生存、分化、凋亡等過(guò)程，當(dāng)P13K/AKt通路被抑制時(shí)，可以有效抑制海馬神經(jīng)元凋亡[13]。mTOR為P13K/AKt途徑的下游絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，mTOR抑制劑可以有效預(yù)防癲癇發(fā)作[14]。在調(diào)控P13K/AKt信號(hào)通路發(fā)揮抗鼻炎和癲癇作用中，酒燉白芷共富集29個(gè)靶點(diǎn)，而生白芷為22個(gè)，且比白芷多1個(gè)治療鼻炎的VEGF信號(hào)通路。酒燉白芷在mTOR信號(hào)通路共富集10個(gè)靶點(diǎn)，而生白芷為7個(gè)。

在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)分析中發(fā)現(xiàn)，酒燉白芷中ESR1、IL-2和NOS3等與偏頭痛相關(guān)的靶點(diǎn)度值、EGFR和MAPK8等與鼻炎相關(guān)的靶點(diǎn)度值、GSTP1、GSTA1和GSTM1等與癲癇相關(guān)的靶點(diǎn)度值，均高于生白芷中相關(guān)靶點(diǎn)度值。

綜上所述，白芷酒燉后與偏頭痛、鼻炎和癲癇相關(guān)的靶點(diǎn)、通路均多于白芷，且靶點(diǎn)度值增大，可能主要與黃酒成分的引入及水合氧化前胡素含量增加[2,15,16]等因素有關(guān)，其藥效作用機(jī)制體現(xiàn)了中藥多成分-多靶點(diǎn)-多通路的特點(diǎn)，為酒燉白芷“酒制升提”或“引藥上行”的炮制機(jī)制的深入研究提供了新思路。但其對(duì)藥效作用的改變或藥效作用的增強(qiáng)還需進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。