劉洪霞,舒丹陽,劉鵬展,崔 春,*

(1.完美(廣東)日用品有限公司,廣東中山 528400;2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510640)

沙棘(HippohaerhamnoidesL.)是一種天然的藥食同源性植物,我國是沙棘資源最豐富的國家,沙棘屬種植總面積達(dá)到92萬hm2。沙棘的根、莖、葉、花、果實(shí)中均含有豐富的營養(yǎng)和生物活性物質(zhì)。根據(jù)《中華人名共和國藥典》記載,沙棘“具有止咳祛痰、消食化滯、活血散瘀功能”,充分肯定了它的藥用價值。沙棘在民間還有“長壽果”的美譽(yù),特別是藏醫(yī)和蒙醫(yī)使用較多[1]。沙棘具有抗腫瘤[2]、抗光老化[3]、抗氧化[4]、排鉛[5]等多種活性。沙棘籽是沙棘果汁生產(chǎn)的副產(chǎn)物。沙棘籽經(jīng)過超臨界提取油脂后得到的沙棘籽粕中蛋白質(zhì)含量豐富,約為20%～25%,富含多種人體所需氨基酸,是一種優(yōu)質(zhì)的功能性蛋白資源[6]。研究表明,沙棘蛋白能夠改善血脂水平,調(diào)節(jié)腸道菌群[7];還能改善高血糖引起的細(xì)胞炎癥[8]。

糖尿病是全球性的公共健康問題,是一種常見的慢性代謝疾病,主要表現(xiàn)為糖代謝紊亂,其病因諸多,機(jī)制復(fù)雜,已經(jīng)成為繼心血管疾病、惡性腫瘤之后的第三大疾病[9]。近10年來糖尿病流行情況日益普遍,預(yù)計至2030年全球糖尿病患者將達(dá)到4.39億,其中2型糖尿病約占患病總?cè)藬?shù)的90%[10]。藥物降血糖會產(chǎn)生多種副作用,降低骨密度增加骨折的風(fēng)險[11],產(chǎn)生肝毒性[12],還可造成腸道功能紊亂[13]。所以研究人員更傾向于利用草本植物和通過功能性食品調(diào)節(jié)膳食結(jié)構(gòu)從而控制血糖。

沙棘多糖,沙棘果,沙棘葉提取物均有降血糖的功效[14-16],但對沙棘蛋白降血糖方面的相關(guān)研究較少。長期以來,飲食干預(yù)一直被認(rèn)為是控制血糖的有效措施[17],一些研究表明,用大豆蛋白等植物蛋白替代動物蛋白來改善糖尿病患者的血脂異常,對脂質(zhì)分布有有益的影響,并可減少糖尿病腎病的損傷[18]。本文通過動物實(shí)驗進(jìn)一步研究沙棘蛋白對2型糖尿病小鼠的降血糖作用及其機(jī)制,以期為利用沙棘蛋白開發(fā)保健品、藥品的研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

60只雄性SPF級db/db糖尿病模型小鼠(47±2) g,12只雄性SPF級m/m正常小鼠(24±2) g 購于常州卡文斯實(shí)驗動物有限公司;沙棘籽粕(蛋白含量20%～23%) 由完美康普高原特色植物研究中心提供;沙棘蛋白 由實(shí)驗室制備(其蛋白含量為80%);二甲雙胍 廣州白云上天心制藥股份有限公司;其他試劑 均為分析純。

血糖儀及試紙條、德國羅氏活力血糖儀 羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司;電子天平 莆田市衡科儀器有限公司;中草藥粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;高速冷凍離心機(jī) 長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司;恒溫振蕩器 江蘇金怡儀器科技有限公司;雷磁PHS-3EpH計 上海儀電科學(xué)儀器有限公司;自動定氮儀、HYP-308消化爐 上海纖檢儀器有限公司;L-8900日立全自動氨基酸分析儀 天美(中國)科學(xué)儀器有限公司;Waters高效液相色譜儀 美國Waters公司;冷凍干燥機(jī) 東莞布魯斯儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 沙棘蛋白制備工藝 經(jīng)超臨界提取油脂后的沙棘籽粕超微粉碎80目過篩,料液比1∶5,75%乙醇浸洗2次,去掉醇溶性雜質(zhì)。1∶9料水比,6 mol/L氫氧化鈉調(diào)pH11.0堿提取3 h,2 mol/L鹽酸調(diào)pH5.0酸沉0.5 h,去離子水水洗兩次酸沉蛋白,除去鹽分,冷凍干燥(-45 ℃、9 Pa、24 h)得沙棘蛋白,4 ℃保存?zhèn)溆肹6]。

1.2.2 沙棘蛋白含量的測定 總蛋白含量測定:采用凱氏定氮法[19],參照GB/T 5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》。

稱取0.25 g左右的凍干沙棘蛋白于消化管中,加入10 mL濃硫酸和10 g催化劑,高溫自動消化爐上450 ℃消化2 h至澄清透明,冷卻后用自動定氮儀測定蛋白含量。

1.2.3 沙棘蛋白分子量的測定方法 采用凝膠色譜法測定肽分子量分布。檢測條件:高效液相色譜(Waters 600),TSK gel G2000SWXL 凝膠色譜分析柱;檢測波長為 220 nm;檢測時間30 min;有機(jī)流動相(乙腈∶水=20∶80,加入0.1%的三氟乙酸),流速0.5 mL/min。將樣品用上述流動相稀釋,過0.22 μm濾膜,進(jìn)樣體積為20 μL,進(jìn)行分析。

標(biāo)準(zhǔn)肽樣品:抑肽酶(6500 Da),牛血清蛋白(68000 Da),gly-gly-tyr-arg(451 Da),雙甘氨肽(132 Da),細(xì)胞色素C(12500 Da),桿菌肽(450 Da)。將出峰時間與標(biāo)準(zhǔn)品相對分子質(zhì)量的對數(shù)值進(jìn)行線性擬合,得到擬合方程y=-3.2389x+26.438(R2=0.9967),其中y為出峰時間,x為標(biāo)準(zhǔn)品相對分子質(zhì)量的對數(shù)值。

1.2.4 沙棘蛋白氨基酸組成的測定 按GB/T 5009.124-2016《食品中氨基酸的測定》對凍干樣的水解氨基酸進(jìn)行測定,略作修改[20-21]。

水解氨基酸的測定:樣品用6 mol/L鹽酸于110 ℃下水解24 h,水解后定容至50 mL,針管吸取約1 mL,0.22 μm濾膜過濾后裝入1 mL進(jìn)樣瓶中由氨基酸自動分析儀進(jìn)行測定。

1.2.5 沙棘蛋白中金屬含量的測定 采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS),參照GB 5009.268-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中多元素的測定》[22]。

1.2.6 模型小鼠的分組及灌胃處理方案 將db/db模型組隨機(jī)分為5組,m/m為正常對照組(Normal controls,NC),對小鼠進(jìn)行耳號標(biāo)記。進(jìn)行灌胃實(shí)驗,灌胃時間為8周,給予普通飼料,飲用水為無菌純凈水,每次灌胃均為無菌純凈水0.5 mL。

第一組為m/m小鼠的正常對照組(NC);第二組為db/db小鼠2型糖尿病未治療對照組(DC),每日灌胃等量生理鹽水;第三組為db/db小鼠陽性對照組(PC),每日灌胃300 mg/kg鹽酸二甲雙胍懸浮液;第四組為db/db小鼠沙棘蛋白高劑量組(SSPH),第五組為db/db小鼠沙棘蛋白中劑量組(SSPM),第六組為db/db小鼠沙棘蛋白低劑量組(SSPL)，高中低劑量組每日灌胃沙棘蛋白分別為:200、100、50 mg/kg。

1.2.7 小鼠檢測指標(biāo)

1.2.7.1 小鼠精神狀態(tài)的觀察、一級體重和血糖的測定 觀察小鼠的精神活動,毛發(fā)和飲食飲水情況,記錄小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后的初始體重W-0,以及灌胃1、4、8 w體重變化。

測量小鼠初始隨機(jī)血糖W-0,以及灌胃1、4、8 w后禁食8 h的空腹血糖,小鼠尾靜脈取血,用血糖儀和血糖試紙測定。

1.2.7.2 口服糖耐量實(shí)驗 口服糖耐量實(shí)驗(oral glucose tolerance tests,OGTTs)于實(shí)驗8周后進(jìn)行。各組動物禁食12 h后尾靜脈取血測空腹血糖(FBG),之后給予相應(yīng)的受試物,20 min后給予2.5 g/kg葡萄糖溶液,測定各組0.5、1、2 h時的血糖值,根據(jù)如下公式計算血糖曲線下面積GAUC[23]。

GAUC0～0.5h=(0 h血糖+0.5 h血糖)×0.25

GAUC0.5～2 h=(0.5 h血糖+1 h血糖×3+2 h血糖×2)×0.25

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘蛋白肽分子量、氨基酸和金屬含量

2.1.1 沙棘蛋白和肽分子量分布和氨基酸含量 經(jīng)過堿溶酸沉處理得到的沙棘蛋白,其蛋白質(zhì)含量為80%。由沙棘蛋白的肽分子量可知,沙棘蛋白組分中>10 kDa組分占26.14%,5～10 kDa組分占40.91%,1～5 kDa組分占17.95%,<1 kDa組分占15.00%,結(jié)果見表1。與其他植物蛋白,如大豆蛋白、玉米蛋白等相比[24],沙棘蛋白的溶解性較差,沙棘蛋白分子量明顯較小。

表1 沙棘蛋白肽分子量分布Table 1 Molecular weight distribution of seabuckthorn seed protein peptide

圖1 沙棘蛋白肽分子量LC譜圖Fig.1 LC spectrum of the molecular weight of seabuckthorn seed protein peptide

由沙棘蛋白氨基酸分析結(jié)果可知,沙棘蛋白中氨基酸組成比較豐富,含有17種氨基酸,包括7種必需氨基酸(色氨酸被酸水解破壞,未測定),必需氨基酸(含胱氨酸和酪氨酸)總量為其氨基酸總量的21.16%。沙棘種仁蛋白中氨基酸總量為66.379%,與凱氏定氮結(jié)果接近。

表2 沙棘蛋白的氨基酸含量分析(g/100 g)Table 2 Content of amino acids in seabuckthorn seed protein(g/100 g)

其中,谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸含量較高,分別為22.30%、15.37%和11.25%。精氨酸是維持嬰幼兒生長發(fā)育必不可少的氨基酸。它也是精子蛋白的主要成分,有促進(jìn)精子生成,提供精子運(yùn)動能量的作用。此外,靜注精氨酸,能刺激垂體釋放生長激素,可用于垂體功能試驗[25],因此沙棘蛋白可用于研發(fā)富集精氨酸的肽。研究表明,精氨酸調(diào)控NO在體內(nèi)的合成,使得細(xì)胞具有足夠的抗氧化活性,同時富含精氨酸的膳食可以調(diào)節(jié)胰島細(xì)胞活性,增強(qiáng)GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)子活性從而調(diào)節(jié)血糖水平,降低由于高血糖引起的心血管疾病,這是沙棘蛋白降血糖活性的物質(zhì)基礎(chǔ)[26]。

2.1.2 沙棘蛋白金屬元素含量 由表3可知沙棘蛋白中鉛、砷、鎘、總汞、鉻等重金屬含量都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國家標(biāo)準(zhǔn)要求[27],堿提酸沉鈉含量較高。鋅是300多種酶保持活性的必需微量元素[28],且鋅元素與甲狀腺功能密切相關(guān)[29]。血液中硒、銅、鎂、鐵、鋅等多種元素失衡的狀態(tài)容易增加代謝綜合征的風(fēng)險[30],沙棘蛋白中銅、鎂、鐵、鈉、鋅、硒含量豐富,能夠補(bǔ)充人體所需微量元素,發(fā)揮預(yù)防代謝綜合征的作用。

表3 沙棘蛋白金屬元素含量Table 3 Contents of metal elements in seabuckthorn seed protein

2.2 沙棘蛋白改善二型糖尿病效果評價

2.2.1 小鼠一般狀態(tài)的觀察 正常組小鼠精神狀態(tài)活躍,飲食飲水正常,便尿量正常,體重穩(wěn)定增長。糖尿病未治療組(DC)飲食飲水明顯增多,尿量多,眼神呆滯,毛發(fā)粗糙,甚至出現(xiàn)掉毛現(xiàn)象。糖尿病小鼠經(jīng)二甲雙胍和沙棘蛋白治療后精神和飲食狀態(tài)有所改善,毛發(fā)順滑有光澤,墊料較為干燥。

2.2.2 沙棘蛋白對小鼠體重的影響 由圖2可知,NC組小鼠體重呈穩(wěn)定增長的狀態(tài),db/db各組的初始體重?zé)o顯著性差異(P>0.05)。實(shí)驗4周以后沙棘蛋白組體重及其增長速度都高于DC組,DC組較其他組出現(xiàn)了糖尿病多飲多食,體重增長緩慢的癥狀。實(shí)驗8周后,小鼠體重顯著低于PC和SSPH治療組(P<0.05)。沙棘蛋白處理組中SSPH對小鼠體重增長影響最大。糖尿病導(dǎo)致小鼠體重下降的影響與以往研究的結(jié)果一致[8],這一結(jié)果表明,沙棘蛋白可減輕糖尿病對小鼠造成的多飲多食多尿,體重增長緩慢的不良影響。

圖2 沙棘蛋白對糖尿病小鼠體重的影響Fig.2 The effect of seabuckthorn seed protein on the body weight of mice注:*表示與DC組相比有顯著性差異,P<0.05;#表示與PC組有顯著性差異,P<0.05;圖3同。

2.2.3 沙棘蛋白對小鼠血糖的影響 由實(shí)驗結(jié)果可知,NC組正常小鼠血糖值基本穩(wěn)定在一定范圍內(nèi),db/db糖尿病各組小鼠的初始隨機(jī)血糖無顯著性差異(P>0.05),灌胃一周后的空腹血糖也無顯著性差異(P>0.05)。實(shí)驗進(jìn)行四周后DC組血糖達(dá)到峰值28.06 mmol/L,相比于DC組,其他治療組血糖都顯著性下降(P<0.05),SSPL組降糖效果最優(yōu)。治療8周后,與模型對照DC組的高血糖水平相比,沙棘蛋白在一定程度上抑制了糖尿病小鼠血糖的上升。實(shí)驗數(shù)據(jù)顯示小鼠血糖值未隨著實(shí)驗時間對沙棘蛋白呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性,但是總體上與DC未治療組相比,血糖水平保持在較低水平。沙棘蛋白SSPM組和SSPL組降血糖效果優(yōu)于SSPH組,結(jié)果見圖3。

圖3 沙棘蛋白對二型糖尿病小鼠血糖的影響Fig.3 The effect of seabuckthorn seed protein on the glucose values of mice

2.2.4 沙棘蛋白對小鼠血糖曲線下面積GAUC的影響 OGTTs是一種葡萄糖負(fù)荷試驗,用于了解機(jī)體對葡萄糖的調(diào)節(jié)和耐受性[31]?？诜咸烟悄土吭囼炛械目崭寡?FBG)主要反映夜間基礎(chǔ)胰島素的作用,餐后血糖是飲食作用后的反應(yīng),兩者都需要綜合分析[32]。此外血糖曲線下面積是一種反應(yīng)血糖水平的指標(biāo),相較于單點(diǎn)的血糖值,血糖曲線下面積能更全面的分析血糖變化的時間和程度。由表4可知與FBG相比,血糖水平在0.5～1 h明顯升高到,在1 h達(dá)到峰值,根據(jù)GAUC計算,比重最大的是餐后1 h血糖。經(jīng)過2 h的調(diào)節(jié),血糖水平下降到穩(wěn)定狀態(tài)。SSPL組在不同時間段血糖均顯著低于DC組(P<0.05)。NC組、PC組、SSPL組與DC組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明,沙棘蛋白能明顯控制糖尿病小鼠的血糖,增強(qiáng)其調(diào)節(jié)血糖的能力,增強(qiáng)小鼠對血糖的耐受性。由表4可知,正常組NC的0～0.5 h血糖曲線下面積和0.5～2 h血糖曲線下面積顯著低于糖尿病組(P<0.05),糖尿病組DC的血糖曲線下面積顯著高于治療組(P<0.05),三個劑量組的沙棘蛋白的曲線下面積無顯著性差異(P>0.05),結(jié)果可知,沙棘蛋白可以提高糖尿病小鼠的葡萄糖敏感性,減少葡萄糖的吸收。

表4 血糖曲線下面積(GAUC)Table 4 Blood glucose area under curve(GAUC)

3 結(jié)論

含量80%的沙棘蛋白氨基酸總量為66.379%,精氨酸含量較高,約占15.37%。沙棘蛋白含有人體所需的銅、鎂、鐵、鈉、鋅、硒等多種金屬元素。實(shí)驗證明沙棘蛋白低劑量組(50 mg/kg)對糖尿病小鼠降血糖效果最明顯;通過血糖曲線下面積可知,沙棘蛋白可明顯提高糖尿病小鼠的葡萄糖敏感性,減少葡萄糖的吸收。沙棘蛋白能有效降低糖尿病小鼠的血糖和改善小鼠的精神狀態(tài),減輕糖尿病對小鼠的損傷。