孫華林,田奎蓉,洪 業(yè),吳夢(mèng)丹,陳軼霞,劉俊林

(西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730030)

高血壓是以動(dòng)脈血壓超過(guò)臨界血壓值并持續(xù)升高為主要特征的綜合病癥,同時(shí)伴有肝、心、腎等多個(gè)組織器官結(jié)構(gòu)、功能改變,影響局部微循環(huán),導(dǎo)致代謝失衡的慢性疾病[1]。經(jīng)大量臨床病征和生理學(xué)研究,高血壓發(fā)病機(jī)制受復(fù)雜的通路調(diào)節(jié),并且受一系列外環(huán)境影響[2-4],尤以自由基代謝失衡、血液脂質(zhì)代謝紊亂和水鹽調(diào)節(jié)異常等因素為主要表現(xiàn)[5-8]。同時(shí)長(zhǎng)期高血壓會(huì)過(guò)度激活“腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)”(RAAS)而引起心臟組織肥大導(dǎo)致心臟衰竭,因此,調(diào)整機(jī)體的RAAS水平、改善機(jī)體血脂代謝紊亂與調(diào)節(jié)水鹽代謝異常是治療高血壓的關(guān)鍵[9]。

芹菜(ApiumgraveolensL.)屬傘形花科蔬菜,植株中含有豐富的黃酮類化合物,以芹菜素含量最高,芹菜素(apigenin)又稱芹黃素,是天然存在的一種黃酮類化合物,其獨(dú)特的生理學(xué)效應(yīng)和生物學(xué)特性來(lái)源于黃酮結(jié)構(gòu)所含的三個(gè)-OH與C2=C2基團(tuán)[10]。其具有降壓安神、降血脂、保護(hù)心血管和增強(qiáng)免疫力等功效[11-12],何芳等[13]研究發(fā)現(xiàn)芹菜素能降低高脂高鹽所致高血壓大鼠血壓并有保護(hù)心臟的作用,可能與芹菜素能夠有效降低高脂高鹽所致高血壓大鼠AngII水平、降低血脂、改善抗氧化酶活性、抑制氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

本研究主要探討芹菜不同部位提取物與芹菜素作用于高鹽高血壓大鼠模型,分析比較芹菜各部位提取物與芹菜素對(duì)改善高鹽所致大鼠高血壓與血脂代謝紊亂的效果與其機(jī)制進(jìn)行探究,并分析二者對(duì)高血壓的作用關(guān)系,以期為篩選芹菜藥食同源食用最佳部位及其作為天然產(chǎn)物作用于臨床研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:200～250 g Wister大鼠90只雌雄各半 購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(甘)2015-0001)實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)和處死均遵照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例和福利倫理指南執(zhí)行;蘭州本地毛芹(Apiumgraveolens) 全株經(jīng)西北民族大學(xué)劉俊林副教授鑒定為毛芹;TG試劑盒、HDL-C試劑盒、LDL-C試劑盒、CHOL試劑盒 均購(gòu)自南京建成生物有限公司;碘[125Ⅰ]血管緊張素Ⅰ放射免疫分析藥盒、碘[125Ⅰ]血管緊張素Ⅱ放射免疫分析藥盒碘[125Ⅰ]、醛固酮放射免疫分析藥盒、碘[125Ⅰ]腎素活性放射免疫分析藥盒 均購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究有限公司;芹菜素(95%) 購(gòu)自上海純優(yōu)生物科技有限公司;給藥對(duì)照藥物“卡托普利” 常州制藥廠有限公司;乙腈(色譜級(jí)) 南京化學(xué)試劑股份有限公司;其余藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Beckman Coulter AU680全自動(dòng)生化分析儀、Beckmanγ計(jì)數(shù)器 美國(guó)Beckman公司;XH6020全自動(dòng)放射免疫計(jì)數(shù)儀 中國(guó)同輻股份有限公司;N-1100D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海安亭科學(xué)儀器廠;UV-1800紫外分光光度計(jì)、HPLC-SPD 15C高效液相色譜儀、UV CBM-20A數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 日本島津公司;Biotek多功能酶標(biāo)儀 北京諾亞威儀器儀表有限公司;FD-1C-50真空冷凍干燥儀 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;3K30超速低溫離心機(jī) Sigma公司;SL-N精密電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司;KW-I恒溫干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;Nikoncoolpix 4500數(shù)碼照相機(jī) 日本尼康公司;ML-1.8-4可調(diào)式電熱板 北京科偉永興儀器有限公司;LEICA-DM500光學(xué)顯微鏡 德國(guó)萊卡公司;MICROM HMS70自動(dòng)染色儀 德國(guó)MICROM公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 芹菜各部位提取物的制備 將毛芹洗凈后分離根、莖、葉切碎置于80 ℃恒溫干燥箱中干燥至恒重,充分研磨粉碎,70 ℃、70%乙醇浸提2 h,60目篩過(guò)濾后收集濾液,重復(fù)三次,合并樣液[10],轉(zhuǎn)入真空冷凍干燥器(-60 ℃),干燥至恒重,分別得到芹菜根提取物、芹菜莖提取物與芹菜葉提取物。

1.2.2 芹菜素含量的測(cè)定 采用HPLC法進(jìn)行測(cè)定:色譜柱:WondaSilC18(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈-水(35∶65,V/V);流速1.0 mL/min;柱溫30 ℃;UV檢測(cè),檢測(cè)波長(zhǎng):270 nm[14]。以縱坐標(biāo)y為吸收峰,橫坐標(biāo)x為濃度建立回歸方程:y=539223x-356988;R2=0.996。

1.2.3 大鼠高血壓模型的建立及治療過(guò)程 對(duì)實(shí)驗(yàn)組和模型組飼喂高鹽大鼠飼料和飲用0.6%氯化鈉液,持續(xù)6周[15],待其動(dòng)脈血壓超過(guò)150 mmHg并保持穩(wěn)定時(shí)確立模型建立。模型建立后取72只建模成功大鼠均分為6組,每組12只。取1.2.1中提取所得芹菜葉、莖、根物質(zhì)按3.0 g/kg·BW(芹菜素含量分別為27.34、21.77、17.67 mg/g)對(duì)芹菜根組、芹菜葉組、芹菜莖組進(jìn)行給藥。芹菜素組給予0.11 g/kg·BW芹菜素,給藥對(duì)照組給予卡托普利(0.042 mg/kg·BW),以健康大鼠作為正常組,模型組與空白組給予等量正常飲用水,持續(xù)治療4周。

1.2.4 大鼠體重變化 治療期間每周對(duì)各組大鼠進(jìn)行稱重,觀察大鼠體質(zhì)量改變情況。

1.2.5 大鼠“RAAS系統(tǒng)”含量變化測(cè)定 治療結(jié)束后,皮下注射戊巴比妥麻醉固定,頸側(cè)動(dòng)脈采血,2500 r/min,4 ℃離心10 min后吸取血清,按照各試劑盒要求添加抗凝劑與碘標(biāo)記物測(cè)定血清中血管緊張素Ⅰ(AngⅠ)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、醛固酮(ALD)的含量以及腎素活性(PRA)。

1.2.6 大鼠血漿中TG、HDL-C、LDL-C、CHOL的含量測(cè)定 采用頸側(cè)動(dòng)脈采血方法分別取各組大鼠靜脈血,按照TG、HDL-C、LDL-C、CHOL試劑盒流程,進(jìn)行含量測(cè)定,各試劑盒測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)方程相關(guān)系數(shù)r均≥0.995。

1.2.7 大鼠心臟系數(shù)(CWI)和心肌增值系數(shù)(MPI)的測(cè)定 給藥治療4周后,稱量各組大鼠體質(zhì)量,頸椎脫臼處死后快速摘除心臟并稱重,沿二尖瓣剝離左心室稱重,計(jì)算CWI和MPI[16]。

1.2.8 大鼠心臟組織切片觀察 取各組大鼠左心室組織4%甲醛浸泡完全,進(jìn)行石蠟組織切片及HE染色等操作[17],觀察各組大鼠心臟病變情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品及芹菜各部位提取物HPLC圖譜

根據(jù)GB/T 19427-2003[14]方法測(cè)定所得:芹菜各部位提取物中存在多個(gè)吸收峰,如圖1所示,除了在3.425 min處有芹菜素明顯特征吸收峰以外,4.207、6.0142、6.554 min處還存在三個(gè)較高吸收峰,考慮是芹菜(葉、莖、根)各部位提取物存在多種黃酮類物質(zhì),三個(gè)峰總面積分別占芹菜各部位總提取物的26.420%、76.799%、21.694%,可見(jiàn)蘭州毛芹中非芹菜素特征黃酮物質(zhì)含量非常豐富,其潛在研究?jī)r(jià)值較高。

圖1 95%芹菜素及芹菜各部位提取物HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of 95% apigenin and extracts from different parts of celery注:A:芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品 B:芹菜各部位提取物(a:芹菜葉提取物;b:芹菜莖提取物;c:芹菜根提取物)。

2.2 芹菜不同部位提取物對(duì)大鼠動(dòng)脈血壓變化的影響

如表1所示,第0周時(shí)模型組、實(shí)驗(yàn)組(芹菜根組、芹菜莖組、芹菜葉組)與給藥對(duì)照組大鼠動(dòng)脈血壓均高于正常組大鼠血壓,且均超過(guò)150 mmHg,即說(shuō)明模型建立成功。經(jīng)治療后第4周時(shí),芹菜葉組、芹菜素組與給藥對(duì)照組大鼠動(dòng)脈血壓與模型組相比有極顯著降低(P<0.01);芹菜莖組大鼠動(dòng)脈血壓與模型組相比顯著降低(P<0.05);芹菜根組大鼠血壓治療前后改變并不顯著(P>0.05);模型組大鼠動(dòng)脈血壓隨時(shí)間延長(zhǎng)呈增加趨勢(shì),正常組大鼠動(dòng)脈血壓并未增高。芹菜各部位提取物對(duì)高鹽所致大鼠高血壓均有一定的降壓作用,以芹菜葉組提取物與芹菜素降壓作用效果最為明顯;芹菜葉提取物組與芹菜素組兩組降壓效果相近,可能與芹菜葉中含有大量芹菜素有關(guān)。

表1 大鼠動(dòng)脈血壓變化Table 1 Changes in arterial blood pressure in rats

2.3 大鼠體質(zhì)量變化

如圖2所示,模型組大鼠體質(zhì)量隨治療時(shí)間增加而呈現(xiàn)降低趨勢(shì),實(shí)驗(yàn)組大鼠體重有小幅波動(dòng),但隨治療時(shí)間延長(zhǎng)均呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)。

圖2 大鼠體質(zhì)量變化Fig.2 Changes in rat body mass

2.4 芹菜不同部位提取物對(duì)大鼠“RAAS系統(tǒng)”含量變化影響

如表2所示,模型組血漿中AngⅠ含量與正常組相比有極顯著降低(P<0.01),AngⅡ含量與正常組相比有極顯著性增高(P<0.01);芹菜根組血清中AngⅠ含量與正常組相比具有顯著性降低(P<0.05);芹菜根組、芹菜莖組、芹菜葉組、芹菜素組大鼠血漿中AngⅠ含量與模型組相比有極顯著增高(P<0.01),芹菜根組與芹菜莖組血漿中AngⅡ含量與正常組相比具有極顯著性增高(P<0.01);芹菜莖組、芹菜葉組、芹菜素組大鼠血漿中AngⅡ含量與模型組相比有極顯著降低(P<0.01),芹菜根組大鼠血漿中AngⅡ含量與模型組相比有顯著降低(P<0.05),并且芹菜葉組與芹菜素組降低最為明顯。AngⅡ能使全身小動(dòng)脈收縮而升高血壓,具有很強(qiáng)收縮血管的能力[18]?？梢?jiàn),芹菜各部位提取物能有效降低血液中AngⅡ的含量,從而達(dá)到減弱血管收縮,降低血壓。

表2 大鼠血漿中AngⅠ、AngⅡ含量Table 2 Contents of AngI and AngII in rat plasma

如表3所示,模型組血漿中PRA與正常組相比具有極顯著性增高(P<0.01);芹菜根組和芹菜莖組血漿中PRA與正常組相比具有顯著性增高(P<0.05);各組ALD與模型組相比均無(wú)較大改變,不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,芹菜葉組、芹菜素組、給藥對(duì)照組與正常組大鼠血漿中PRA與模型組相比有顯著降低(P<0.01),芹菜根組與芹菜莖組大鼠血漿PRA與模型組相比有顯著降低(P<0.05)。隋海霞等[19]研究發(fā)現(xiàn)芹菜素作用下能降低大鼠血漿中ALD,本實(shí)驗(yàn)中芹菜各部位提取物作用下能降低大鼠血漿中ALD的含量與PAR活性,從而減弱血管收縮,降低血壓,而芹菜各部位提取物作用效果有所差異,可能與各部位提取物中所含芹菜素含量不同有關(guān)。

表3 大鼠血漿中ALD含量與 PRA Table 3 ALD content and PRA activity in rat plasma

2.5 芹菜不同部位提取物對(duì)大鼠血漿中TG、HDL-C、LDL-C、CHOL的含量變化影響

如表4所示,模型組大鼠血漿中HDL-C、LDL-C 與TG含量與正常組相比具有極顯著性差異(P<0.01);芹菜素組大鼠血漿中HDL-C含量與模型組相比有極顯著增高(P<0.01),芹菜葉組與給藥對(duì)照組大鼠血漿中HDL-C含量與模型組相比顯著增高(P<0.05);芹菜莖組、芹菜素組、給藥對(duì)照組與正常組大鼠血漿中LDL-C含量與模型組相比有極顯著降低(P<0.01),芹菜根組、芹菜葉組大鼠血漿中LDL-C含量與模型組相比顯著降低(P<0.05);芹菜根組和芹菜莖組大鼠血漿中TG含量與正常組相比有極顯著性增高(P<0.01);芹菜素組、給藥對(duì)照組大鼠血漿中TG含量與模型組有顯著性降低(P<0.01),芹菜葉組大鼠血漿中TG含量與模型組相比顯著降低(P<0.05)。芹菜各部位提取物作用下,能升高大鼠血漿中HDL-C含量,降低血清中LDL-C與TG含量,有效改善高鹽大鼠高血壓脂代謝紊亂情況[20]。

表4 大鼠血漿中TG、HDL-C、LDL-C的含量Table 4 Contents of HDL-C,LDL-C,and TG in rat plasma

如圖3所示,模型組與芹菜根組血漿中CHOL含量與正常組相比有極顯著性降低(P<0.01);芹菜莖組與芹菜葉組血清中CHOL含量與正常組相比有顯著性降低(P<0.05);芹菜素組、給藥對(duì)照組血清中CHOL含量與模型組相比有極顯著性增高(P<0.01);芹菜根組、芹菜莖組、芹菜葉組、芹菜素組大鼠血漿中CHOL較模型組均有增高但與模型組相比并無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

圖3 血漿中CHOL含量Fig.3 CHOL content in plasma

2.6 芹菜不同部位提取物對(duì)大鼠心臟系數(shù)(CWI)和心肌增值系數(shù)(MPI)的影響

如表5所示,與正常組相比,模型組CWI與MPI均有所升高,但無(wú)顯著性差異。與模型組相比,各組CWI與MPI均無(wú)顯著性差異,其中,芹菜莖組、芹菜葉組、芹菜素組CWI與模型組相比均有所降低,并且芹菜莖組、芹菜葉組、芹菜素組CWI降低程度基本一致,芹菜根組、芹菜葉組、芹菜素組MPI與模型組相比較低,芹菜素組降低最為明顯。芹菜素作用下能有效降低大鼠CWI與 MPI[21],在芹菜各部位提取物作用下,表現(xiàn)出能降低大鼠CWI與MPI,減弱因血壓升高而導(dǎo)致的心臟肥大和心肌增生,具有保護(hù)心臟的作用。各提取物作用能力各異可能與芹菜各部位所含芹菜素含量與黃酮類物質(zhì)種類有所相關(guān)。

表5 大鼠心臟系數(shù)(CWI)和心肌增值系數(shù)(MPI)Table 5 Rat heart coefficient(CWI)and myocardial value-added coefficient(MPI)

2.7 大鼠心臟切片觀察

圖4a與圖4g相比:心肌細(xì)胞水腫心肌纖維間隙增寬,部分心肌纖維斷裂并伴有紅細(xì)胞浸潤(rùn),心肌細(xì)胞核有發(fā)生核溶解、核碎裂情況,心肌周圍有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。芹菜根提取物作用下對(duì)高鹽高血壓大鼠心臟病變情況改善效果并不顯著,但能減少心肌纖維內(nèi)出血與心肌纖維斷裂情況;圖4b與圖4g相比:心肌細(xì)胞水腫,心肌纖維間隙有所增寬,心肌纖維斷裂情況不明顯,仍有部分紅細(xì)胞充斥于心肌纖維內(nèi)部,心肌細(xì)胞核有部分溶解、碎裂。芹菜莖提取物作用下能有效減少高鹽高血壓大鼠心肌纖維斷裂和心肌纖維內(nèi)出血情況,同時(shí)減少心肌細(xì)胞壞死情況;圖4c與圖4e相比:心肌細(xì)胞水腫消退,心肌纖維無(wú)斷裂情況,纖維內(nèi)部無(wú)紅細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象,細(xì)胞核完整,有輕微炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。芹菜葉提取物作用下能有效改善高鹽高血壓大鼠心肌病變情況,除心肌纖維間有輕微炎性細(xì)胞浸潤(rùn)外,病變情況基本消失;圖4d與圖4e相比:心肌細(xì)胞水腫消退,心肌纖維完整,心肌細(xì)胞無(wú)變性壞死現(xiàn)象,纖維內(nèi)部無(wú)紅細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象,細(xì)胞核完整;芹菜素作用下,高鹽高血壓大鼠心肌基本無(wú)病變情況出現(xiàn);圖4e與圖4g相比:心肌細(xì)胞水腫,心肌纖維致密,心肌纖維內(nèi)有大量出血形成血腫,心肌纖維斷裂嚴(yán)重,心肌中充滿炎性細(xì)胞,心肌細(xì)胞變性壞死嚴(yán)重。高鹽高血壓大鼠心肌病變嚴(yán)重,同時(shí)有大量心肌增生與大量出血,與血壓不斷升高和血脂代謝紊亂有關(guān);圖4f與圖4e相比:心肌細(xì)胞水腫消退,心肌纖維有輕微斷裂情況,伴隨輕微炎性細(xì)胞浸潤(rùn),無(wú)出血現(xiàn)象;圖4g心肌細(xì)胞正常,心肌纖維完整,無(wú)出血現(xiàn)象和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

圖4 大鼠心臟切片結(jié)果Fig.4 Rat heart section results注:a～g圖分別為芹菜根治療組、芹菜莖治療組、芹菜葉組大鼠、芹菜素組、模型組、給藥對(duì)照組、正常組大鼠心臟左心室切片(200×)。

3 討論與結(jié)論

高鹽性高血壓是指在長(zhǎng)期攝入高鹽高脂類物質(zhì)后引發(fā)機(jī)體脂質(zhì)和水鹽代謝紊亂,引起“腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)”(RAAS)過(guò)度激活,AngⅠ向AngⅡ快速轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致血漿AngII水平顯著升高[22-23],引起血管持續(xù)收縮造成血壓升高;同時(shí)引起血漿中HDL-C降低,TG、LDL-C、CHOL水平升高,血壓持續(xù)上升造成心肌過(guò)度拉伸、心臟負(fù)荷過(guò)重引起導(dǎo)致心肌肥大,并可導(dǎo)致心衰,心肌纖維過(guò)度拉伸甚至斷裂,心肌內(nèi)伴隨持續(xù)出血和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的情況[22-25],最終高血壓合并高血脂,造成機(jī)體器官負(fù)擔(dān)過(guò)重引發(fā)諸多并發(fā)癥如糖尿病、腎病等的一種疾病[26]。因此抑制“RAAS系統(tǒng)”過(guò)度激活,降低血漿AngⅡ水平,改善因血脂代謝紊亂所致心臟組織器官病變、壞死是治療高血壓的關(guān)鍵因素。

本研究采用高鹽飼料飲水飼喂大鼠進(jìn)行高鹽性高血壓大鼠造模,考察了芹菜不同部位提取物對(duì)高鹽高血壓大鼠降壓效果并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探究,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:芹菜不同部位提取物與芹菜素能有效降低腎素活性(PRA),降低血漿中AngⅡ含量,對(duì)“RAAS系統(tǒng)”過(guò)度激活具有明顯的抑制作用,能夠達(dá)到降低動(dòng)脈血壓的效果;芹菜不同提取物作用下與模型組相比能夠改善大鼠血脂代謝異常的情況,有效升高血漿HDL-C水平,降低LDL-C、TG與CHOL,表現(xiàn)出能降低CWI與MPI減輕大鼠因心臟腫脹而造成的大鼠心負(fù)擔(dān)過(guò)重,減輕心肌細(xì)胞水腫,減少心肌纖維斷裂,維持心肌細(xì)胞細(xì)胞核完整的能力。結(jié)合檢測(cè)結(jié)果與組織切片觀察綜合分析可見(jiàn)芹菜葉、莖提取物對(duì)大鼠高血壓具有良好的治療作用。同時(shí),改善血脂異常情況有助于降低高血壓,能緩解由于高血壓引起的心臟等組織器官過(guò)負(fù)情況,對(duì)局部循環(huán)具有調(diào)節(jié)作用。芹菜食療藥用價(jià)值顯著,蘭州毛芹各部位提取物種中非芹菜素特征圖譜黃酮物質(zhì)含量頗豐,相關(guān)生物活性機(jī)制具有較高潛在研究?jī)r(jià)值,其特征類物質(zhì)對(duì)降脂降壓通路機(jī)制有待進(jìn)一步研究。