徐軍軍,李治堃,黃飛龍,王夢(mèng)楠,陳星光,席慧婷,鄧丹雯,黃贛輝,*
(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047;2.南昌大學(xué)瑪麗女王學(xué)院,江西南昌 3300473.江西輝瑞制藥有限公司,江西南昌 330100)
虎奶菇,是一種子實(shí)體和菌核均可食用的珍稀食用兼要用真菌[1],主要分布在我國(guó)云南省、印度、印度尼西亞及馬來(lái)西亞等國(guó),含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖等活性成分[2-3],其生物活性值得廣泛關(guān)注。
近年來(lái)天然提取物的抑癌研究備受中外學(xué)者青睞,從天然產(chǎn)物中探索出安全有效的抗腫瘤成分成為研究熱點(diǎn)。研究表明,海帶[4]、魚腥草[5]、烏頭[6]、紅花[7]中的提取的多糖均具有一定的抑癌效果。菇類菌核多糖也具有多種生物活性,霍宗慶[8]等從白玉菇中提取多糖,并利用單因素和響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝,最優(yōu)參數(shù)為提取溫度80 ℃、提取時(shí)間4.2 h、料液比1∶35,在此條件下提取白玉菇多糖的得率為6.41%。賈毓寧等[9]對(duì)猴頭菇多糖提取條件進(jìn)行優(yōu)化,并發(fā)現(xiàn)其多糖具有良好的抗氧化性。Mei Zhan等[10]將虎奶菇菌核中6種非水溶性虎奶菇菌核多糖硫酸化之后得到S-TM8,具有明顯的抗病毒效果。陶永真等[11]從虎奶菇菌核中提取出一種水溶性葡聚糖,并制備其硫酸酯衍生物,證實(shí)該衍生物具有體內(nèi)抗肉瘤S-180活性及體外抗肝癌HepG2活性。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)虎奶菇的報(bào)道主要集中在栽培及品種改良等方面,其水溶性菌核多糖的提取工藝優(yōu)化很少有過(guò)報(bào)道。
本研究利用水提、醇沉法提取水溶性虎奶菇菌核多糖,經(jīng)Sevage除蛋白、透析、冷凍干燥獲得精多糖,并利用單因素和響應(yīng)面優(yōu)化其提取條件;以胃癌細(xì)胞SGC-7901為研究對(duì)象考察該多糖體外抗胃癌活性,通過(guò)WST-1細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒以及流式細(xì)胞術(shù)研究不同濃度的該多糖溶液對(duì)胃癌細(xì)胞增殖率和早期凋亡的影響,為后續(xù)探究虎奶菇抗胃癌活性提供理論依據(jù)。
虎奶菇菌核 江西省撫州市臨川金山食用菌專業(yè)合作社提供,用PBS溶解,配制儲(chǔ)存液濃度為1.25 mg/mL;葡萄糖系列標(biāo)準(zhǔn)品 中國(guó)科學(xué)計(jì)量所;RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基、青鏈霉素、胎牛血清和胰蛋白酶-EDTA消化液 北京索萊寶科技有限公司;WST-1和Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司;無(wú)水乙醇、硫酸 上海振興化工一廠;苯酚 北京索萊寶科技有限公司;人胃癌細(xì)胞株SGC-7901 武漢普諾賽生命科技有限公司提供,培養(yǎng)傳代于含10%胎牛血清、1%的雙抗(青霉素+鏈霉素)RPMI-1640 培養(yǎng)基中,置于 5% CO2、37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱,選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
高效液相色譜儀 Waters公司;722N型可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;FACS Calibur TM流式細(xì)胞儀 美國(guó)Becton Dickinson公司;Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司。
1.2.1 多糖的提取工藝 虎奶菇破碎至直徑為2 cm左右的顆粒,烘干過(guò)40目篩,于95%的乙醇溶液中浸泡12 h,除去虎奶菇菌核中的脂溶性雜質(zhì)。稱取一定質(zhì)量的虎奶菇粉末,按照一定的料液比與蒸餾水混合,90 ℃水浴中提取一定時(shí)間。收集合并濾液,用旋蒸儀在60 ℃進(jìn)行濃縮,至原體積的十分之一時(shí),以體積比(溶液∶95%乙醇溶液)=16∶3的比例沉淀多糖,4800 r/min離心15 min,得到粗多糖。
取適量粗多糖溶液用Sevage法進(jìn)行脫蛋白,4800 r/min離心15 min,重復(fù)上述操作一次,上清液分別在自來(lái)水中透析2 d,蒸餾水中透析1 d。濃縮透析液,冷凍干燥即得到虎奶菇純化多糖。
1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 分別研究料液比、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)虎奶菇菌核多糖得率的影響。主要包括以下步驟,稱取同一批次的虎奶菇20 g,分別設(shè)置不同的料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)在90 ℃水浴條件下提取2.5 h;料液比為1∶25 g/mL,在90 ℃水浴條件下提取不同時(shí)間(1、2、3、4、5 h);料液比為1∶25 g/mL在不同提取溫度(60、70、80、90、100 ℃)條件下提取4 h,按1.2.1提取工藝進(jìn)行操作,測(cè)定各組菌核粉末多糖得率。
1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇料液比(A)、提取溫度(B)、提取溫度(C)作為自變量,以虎奶菇菌核多糖得率(Y)作為響應(yīng)值,采用Box-Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)響應(yīng)曲面法對(duì)水溶性虎奶菇菌核多糖提取條件進(jìn)行優(yōu)化分析。
表1 響應(yīng)曲面因素水平編碼表Table 1 Factors and levels coding of response surface
1.2.4 虎奶菇純化多糖得率的測(cè)定
1.2.4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用苯酚-硫酸法[12-13]。準(zhǔn)確稱取100 mg葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品,用去離子水溶解,定容到100 mL,制備成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液,分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液,用去離子水定容到10.0 mL,加入1 mL 5%苯酚溶液,5 mL濃硫酸,振搖,靜置30 min在490 nm處測(cè)定各溶液的吸光度。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫軸,吸光度為縱軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=8.7146x+0.0143(R2=0.999),其中x為多糖濃度(以葡萄糖計(jì);mg/mL),y為所多糖的吸光度。
1.2.4.2 虎奶菇純化多糖的測(cè)定 稱1.0 g純化多糖溶于100 mL去離子水配制成多糖待測(cè)液,取0.5 mL多糖待測(cè)液,用去離子水定容至10 mL,加入1 mL 5%苯酚溶液,5 mL濃硫酸,振搖,靜置30 min在490 nm處測(cè)定其吸光度,并根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)液的純化多糖的濃度。
1.2.4.3 虎奶菇純化多糖得率的計(jì)算 根據(jù)公式計(jì)算虎奶菇純化多糖的得算公式如下:
式(1)
1.2.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人胃癌細(xì)胞株SGC-7901細(xì)胞接種到96孔板中,每孔加入100 μL(約6×103個(gè)細(xì)胞)的 RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1% 的雙抗)。待細(xì)胞貼壁后,棄掉原培養(yǎng)基,實(shí)驗(yàn)組中加入用RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋虎奶菇菌核儲(chǔ)備液而成的不同濃度虎奶菇菌核多糖溶液(終濃度分別為3.0、7.5、15、30、60、125、250、500 μg/mL),陰性對(duì)照組中加入等體積的PBS作為空白對(duì)照,每組設(shè)定6個(gè)復(fù)孔,置于恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h。然后向每孔加入10 μL WST-1溶液,繼續(xù)在恒溫箱中孵育1.5 h,孵育結(jié)束后將96孔板置于搖床上搖動(dòng)1 min以充分混合待檢體系,用酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)量吸光(OD)值[15]。按式(2)計(jì)算虎奶菇菌核多糖對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖率(θ):
式(2)
式中:OD1和OD2分別為陰性對(duì)照組和試驗(yàn)組的吸光值。
1.2.6 細(xì)胞凋亡影響試驗(yàn)-Annexin V-FITC/PI雙熒光染色法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人胃癌細(xì)胞株SGC-7901細(xì)胞接種到6孔板中,每孔加入1 mL(約6×105個(gè)細(xì)胞)的RPMI-1640完全培養(yǎng)基,過(guò)夜,待細(xì)胞貼壁后,棄掉原培養(yǎng)基,加入含有不同質(zhì)量濃度樣品的RPMI-1640完全培養(yǎng)基1 mL(分別為0、20、50和100 μg/mL),等體積的PBS作為陰性對(duì)照組,恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。到達(dá)孵育時(shí)間后用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2~3遍,每孔加入200 μL不含EDTA的胰蛋白酶消化液消化細(xì)胞,2 min后加入1 mL完全培養(yǎng)基終止消化,然后將細(xì)胞輕柔的吹打下來(lái),混勻后轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi),1500 r/min離心5 min,棄去上清液,加1 mL PBS重懸細(xì)胞,1000 r/min離心5 min除去殘留培養(yǎng)基,棄上清液后加入500 μL的結(jié)合液重懸細(xì)胞,加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL Propidium Iodide,混勻,室溫下避光反應(yīng)15 min,在1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)[14]。
根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件,設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用軟件SPSS 19.0進(jìn)行方差分析并用OriginPro 8.0進(jìn)行作圖。
2.1.1 料液比對(duì)多糖得率的影響 如圖1所示,料液比在1∶10~1∶25范圍內(nèi),水溶性虎奶菇菌核多糖得率隨料液比的增加而增大,料液比為1∶25時(shí)多糖得率達(dá)到2.15%,當(dāng)料液比增加到1∶30時(shí),得率沒有明顯的增加,這是因?yàn)楫?dāng)料液比過(guò)高,溶出性雜質(zhì)會(huì)增加,抑制多糖溶解,考慮到經(jīng)濟(jì)性原則[13],因此選擇最佳料液比為1∶25。
圖1 料液比對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Effect of ratio of material to liquid on yield of polysaccharide
2.1.2 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響 如圖2所示,隨著提取時(shí)間的增加多糖得率逐漸增加,當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到4 h時(shí)得率達(dá)到2.49%。繼續(xù)增加提取時(shí)間,多糖得率呈下降趨勢(shì),這可能是因?yàn)樘崛r(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其他可溶性雜質(zhì)溶出,導(dǎo)致溶液黏度增加,抑制多糖溶解[15-16],因此確定最佳提取時(shí)間為4 h。
圖2 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on yield of polysaccharide
2.1.3 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響 如圖3所示,在提取溫度在60~90 ℃時(shí),多糖得率隨提取溫度的升高明顯增加,在90 ℃使得到最大值,當(dāng)繼續(xù)增加提取溫度得率下降,這可能是因?yàn)楦邷靥崛l件使虎奶菇菌核多糖的結(jié)構(gòu)遭到破壞,導(dǎo)致多糖溶出受阻[16],因此選擇90 ℃為最佳提取溫。
圖3 提取溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on yield of polysaccharide
2.2.1 響應(yīng)面模型建立及顯著性檢驗(yàn) 響應(yīng)面的實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2,方差分析見表3。采用軟件Design-Expert 8.0.6進(jìn)行多元回歸擬合,得到多糖得率(Y)對(duì)各項(xiàng)因素的二次多項(xiàng)回歸方程為:Y=-19.98+0.43A+2.22B+0.24C-0.024AB+1.15×10-3AC-5.25×10-3BC-8.04×10-3A2-0.136 B2-1.335×10-3C2。由表3可知,模型F值為2634.73,P<0.0001,說(shuō)明模型具有顯著性;失擬項(xiàng)F為3.75,P>0.05,說(shuō)明失擬項(xiàng)差異不顯著,試驗(yàn)無(wú)失擬因素存在,相關(guān)系數(shù)R2=0.9993,表明該模型具有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,誤差較小,擬合度好,適用于虎奶菇菌核多糖提取工藝的優(yōu)化。其中,料液比、提取時(shí)間、提取溫度及其之間的交互作用對(duì)虎奶菇菌核多糖的提取均具有顯著影響。
表3 方差分析Table 3 Analysis of variance
表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Response surface experimental scheme and results
2.2.2 響應(yīng)面分析 圖4顯示了各因素及其交互作用對(duì)水溶性虎奶菇菌核多糖得率的影響,曲面圖反映多糖得率的大小。由圖可知,兩個(gè)因素的等高線均呈橢圓形,說(shuō)明兩個(gè)因素之間的交互作用顯著。圖4(a)表明當(dāng)時(shí)間在3.50~4.50 h之間,液料比在24~30 mL/g之間時(shí),多糖得率最大;圖4(b)表明當(dāng)溫度在90~100 ℃之間,液料比在26~28 mL/g時(shí),多糖得率最大;由圖4(c)得當(dāng)溫度在90~100 ℃樣品之間,時(shí)間在3.5~4.5 h時(shí),多糖得率達(dá)到最大。
圖4 兩因素交互作用對(duì)多糖得率的影響響應(yīng)面Fig.4 Response surface and contour map of the interaction on the extraction rate of polysaccharides
根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果,得到最佳提取工藝預(yù)測(cè)值:液料比為28.52 mL/g,時(shí)間為3.77 h,溫度為98.07 ℃時(shí),多糖得率達(dá)到2.62%±0.3%。根據(jù)實(shí)際操作性將最佳工藝更正為以液料比28.0 mL/g,時(shí)間3.5 h,溫度98 ℃對(duì)多糖得率的最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證,試驗(yàn)重復(fù)三次取平均值,得到多糖得率為2.59%±0.5%,與預(yù)測(cè)值接近,說(shuō)明本模型預(yù)測(cè)多糖得率可靠,具有可行性。
2.3.1 虎奶菇菌核多糖對(duì)胃癌細(xì)胞增殖率的影響 圖5顯示了胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖率隨培養(yǎng)基中多糖濃度的變化趨勢(shì),當(dāng)多糖濃度小于30 μg/mL時(shí),多糖對(duì)細(xì)胞增殖沒有抑制作用。相反,多糖作為碳源,促進(jìn)了細(xì)胞的增殖。當(dāng)多糖濃度達(dá)到15 μg/mL,細(xì)胞增殖開始受到抑制,當(dāng)濃度達(dá)到60 μg/mL及以上時(shí),細(xì)胞增殖率與多糖濃度呈顯著負(fù)相關(guān),虎奶菇菌核多糖濃度為500 mg/mL時(shí)對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901的抑制率達(dá)到了30.3%,說(shuō)明水溶性虎奶菇菌核多糖對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖具有一定的抑制作用。
圖5 藥物濃度對(duì)于細(xì)胞增殖率的影響Fig.5 Effect of drug concentration on cell proliferation注:*表示與空白對(duì)照具有顯著性差異(P<0.05)。
2.3.2 水溶性虎奶菇菌核多糖對(duì)胃癌細(xì)胞早期凋亡的影響 將胃癌細(xì)胞SGC-7901分別在多糖濃度為0、20、50和100 μg/mL的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h,Annexin V-FITC/PI雙熒光染色處理后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果如圖6所示,圖中的每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)特定染色狀態(tài)的細(xì)胞,其中右上象限的點(diǎn)表示Annexin+/PI+的壞死或晚期凋亡細(xì)胞,右下象限的點(diǎn)表示Annexin+/PI-的早期凋亡細(xì)胞。胃癌細(xì)胞SGC-7901經(jīng)不同濃度多糖作用24 h后,總細(xì)胞數(shù)中處于早期凋亡的細(xì)胞比例隨著培養(yǎng)液中多糖濃度的增加逐漸升高。這說(shuō)明水溶性虎奶菇菌核精多糖具有促進(jìn)胃癌細(xì)胞SGC-7901早期凋亡的作用,且其功效隨濃度的升高而增大。
圖6 不同濃度下Annexin V-FITC和PI染色后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡效果圖Fig.6 Flow cytometry after Annexin V-FITC and PI staining at different concentrations to detect early apoptosis effect注:a~d圖對(duì)應(yīng)的多糖濃度為分別為0,20,50,100 μg/mL。
本研究通過(guò)單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取未經(jīng)純化的水溶性虎奶菇菌核多糖,確定最佳工藝條件:料液比1∶28 g/mL,提取時(shí)間為3.5 h,提取溫度為98 ℃,在此條件下虎奶菇菌核多糖的得率為2.59%±0.5%。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明,水溶性虎奶菇菌核多糖的濃度對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖具有抑制效果,并且隨著多糖濃度的增加,抑制效果越明顯。當(dāng)多糖濃度為500 mg/mL時(shí),對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制率達(dá)到30.3%。
研究表明,白藜蘆醇、藤黃酸等通過(guò)誘導(dǎo)Bax、抑制BcL-2的基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞凋亡,從而達(dá)到抗癌效果[17-18];香菇多糖也是通過(guò)增強(qiáng)促凋亡因子Bax的表達(dá)、抑制抗凋亡因子BcL-2的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,從而抑制胃癌細(xì)胞BGC-823的增殖[19-20]。水溶性虎奶菇菌核多糖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)理是否也遵循這一機(jī)理,尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。