黑智亮,常 虹,趙美惠,卿雨蝶,王佳媚,賀 敏,王靜鳳,夏光華,*

(1.海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,海南?？?570228;2.海南省食品檢驗檢測中心,海南?？?570228;3.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003)

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少、骨密度降低、骨組織微結(jié)構(gòu)破壞而導(dǎo)致骨脆性和骨折危險性增高為特征的全身性骨骼疾病[1]。全世界患病人數(shù)超過2億,其發(fā)病率排在多發(fā)病的第七位,已嚴(yán)重影響老年人的健康,尤其是絕經(jīng)后的婦女[2-3]。目前,藥物治療是骨質(zhì)疏松癥的主要治療方法,雖具有良好的療效,但長期服用具有較強的毒副作用[4-5]。因此,尋找安全有效防治骨質(zhì)疏松癥的功能因子具有重要意義。

成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成小于破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收引起骨代謝失衡是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松本質(zhì)原因[6]。成骨細(xì)胞在維持骨代謝平衡中起著至關(guān)重要的作用。它不僅可以通過增殖、分化、礦化完成骨形成[7],還可以分泌骨保護素和核因子κB受體活化因子配體調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的的分化成熟,影響骨吸收作用[8-9]。以成骨細(xì)胞為靶點,開發(fā)抗骨質(zhì)疏松功能因子具有重要的研究意義。

魚卵作為魚類加工的副產(chǎn)物,包含了胚胎發(fā)育所必需的全部營養(yǎng)物質(zhì),富含多不飽和脂肪酸、DHA/EPA-磷脂、卵磷脂、糖蛋白等多種功效成分[10-11],除少量優(yōu)質(zhì)魚卵被用來加工成魚子醬或經(jīng)初加工食用外,大部分與其他副產(chǎn)物一起用于生產(chǎn)魚粉等低附加值產(chǎn)品,并沒有得到高值化利用[12]。唾液酸糖蛋白廣泛存在于魚卵、雞蛋等卵細(xì)胞的皮質(zhì)小泡中,不同來源的唾液酸糖蛋白具有類似結(jié)構(gòu)特征,糖和蛋白的連接主要以O(shè)-或N-連接為主,唾液酸(Neu5Ac)連接在糖的末端。前期研究發(fā)現(xiàn)魚卵糖蛋白具有促成骨細(xì)胞增值作用[13],其促進骨形成作用的功能因子有待于進一步深入研究。

本試驗從14種水產(chǎn)動物卵中篩選出具有促前成骨MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性的鯽魚卵唾液酸糖蛋白(Sialoglycoprotein ofCarassiusauratuseggs,Ca-SGP),采用單因素和響應(yīng)面試驗優(yōu)化其提取工藝,研究其對MC3T3-E1細(xì)胞增殖、分化和礦化的影響,探明其促骨形成作用,為魚卵高值化利用和尋找安全、有效的抗骨質(zhì)疏松功能因子提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

成熟鮮活的雌性鯽魚(Carassiusauratus)、狹鱈(Gadusmorhua)、多春(Mallotusvillosus)、大黃花魚(Larimichthyscrocea)、黑鯛(Sparusmacrocephlus)、鯰魚(Silurusasotus)、扇貝(Placopectenmagellanicus)、鯉魚(Cyprinuscarpio)、鯡魚(Clupeapallasi)、黑鱈(Anoplopomafimbria)、武昌魚(Megalobramaamblycephala)、小黃花魚(Larimichthyspolyactis)、魷魚(Loligochinensis)和貽貝(Mytilidae) 購于青島大連路水產(chǎn)品市場。在4 ℃條件下取出魚卵,剔除卵包膜等雜質(zhì),魚卵于-80 ℃保存?zhèn)溆?脫脂雞蛋粉 安徽亳州市紅日蛋制品有限責(zé)任公司;前成骨細(xì)胞MC3T3-E1 美國Type Culture Collection公司,以含10%(v/v)FBS的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)基中含1×105U/L青霉素,1×105μg/L硫酸鏈霉素。細(xì)胞培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中,并以0.25%的胰酶消化傳代,平均每2～3 d傳代一次,取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗;胎牛血清和α-MEM培養(yǎng)基 Gibco公司;胰蛋白酶、四甲基偶氮唑鹽(MTT)和Neu5Ac Sigma公司;鄰苯二胺鹽酸鹽(OPD-HCl) BBI公司;堿性磷酸酶檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所;小鼠骨鈣素和I型膠原蛋白ELISA檢測試劑盒 R&D公司;其余試劑 均為國產(chǎn)分析純。

GL-20M型高速冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司;ALPHA1-4LO型凍干機 德國Christ公司;Mode1680型酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司;Aglient1200高效液相色譜儀 美國Aglient公司;BJ5060UV型CO2培養(yǎng)箱 美國Heraeus公司;DL-CJ-1N型超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司產(chǎn)品;BS224S型精密電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 水產(chǎn)動物卵和雞蛋水溶性糖蛋白的制備 取出魚卵于4 ℃下解凍,高速均質(zhì)破碎魚卵,冷凍干燥后得到全魚卵粉。全魚卵粉加入95%乙醇(1∶15,w∶v)于常溫下攪拌脫脂12 h,期間每3 h更換一次乙醇。脫脂后過濾除去乙醇,濾渣在冷風(fēng)干燥機中于30 ℃風(fēng)干后得到脫脂魚卵粉。將脫脂魚卵粉按照1∶30 (w∶v)的比例加入超純水,于4 ℃條件下攪拌提取12 h,提取液于8000 r/min條件下離心10 min。上清液旋蒸濃縮后,凍干,得到魚卵水溶性糖蛋白[13]。

脫脂雞蛋粉按照1∶30 (w∶v)的比例加入超純水,于4 ℃條件下攪拌提取12 h,提取液于8000 r/min條件下離心10 min。上清液旋蒸濃縮后,凍干,得到雞蛋水溶性糖蛋白[13]。

1.2.2Ca-SGP的制備 冷凍魚卵于4 ℃下解凍后,準(zhǔn)確稱取50 g,采用高速均質(zhì)機均質(zhì)破碎,加入一定體積適當(dāng)濃度的NaCl溶液,再次均質(zhì)后提取一定時間,提取液于12000 r/min條件下離心15 min,取中層清液加入等體積的90%苯酚溶液,攪拌2 h后,于5000 r/min條件下離心15 min,變性脂肪層位于表層,變性蛋白沉淀于底部,中層清夜為唾液酸糖蛋白層。中層清液用截留分子量為10 kDa的透析袋流水透析3 d,蒸餾水透析1 d,透析液于5000 r/min條件下離心10 min,上清液凍干得到唾液酸糖蛋白。

1.2.3 DAD-HPLC法測定唾液酸(Neu5Ac)含量 稱取5 mg待測樣品,加入0.5 mol/L NaHSO4溶液1 mL,于80 ℃下水解30 min,冷卻,分別取0.5 mL標(biāo)品和樣品溶液,加入1 mL 20 mg/mL OPD-HCl溶液,于80 ℃下衍生40 min,冷卻后,衍生液用0.45 μm濾膜過濾,4 ℃下保存,進行液相分析[14]。

1.2.4 對MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響 以α-MEM培養(yǎng)基將對數(shù)期MC3T3-E1細(xì)胞濃度調(diào)整為1.5×104個/mL,按照每孔100 μL接種至96孔板中,培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基,并加入受試物。各水產(chǎn)動物卵水溶性糖蛋白濃度為0和400 μg/mL,每孔加入200 μL,培養(yǎng)72 h后測定。在測定前4 h加入MTT溶液(終濃度0.5 mg/mL),培養(yǎng)4 h后吸棄培養(yǎng)液,并在每孔加入200 μL酸化異丙醇,充分吹打,使藍(lán)色結(jié)晶完全溶解,將96孔板置于酶標(biāo)儀中測定570 nm處吸光值,MC3T3-E1細(xì)胞增殖率按照下列公式計算[13]:

細(xì)胞增殖率(%)=(樣品吸光值/空白吸光值)×100

1.2.5 響應(yīng)面設(shè)計試驗

1.2.5.1 單因素實驗 為了提高Ca-SGP的得率,本實驗對Ca-SGP的提取工藝進行優(yōu)化,在料液比為1∶3 (w/v),提取時間為2 h的條件下,考察不同NaCl濃度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mol/L)對Ca-SGP得率的影響。在提取時間為2 h,NaCl濃度為0.3 mol/L的條件下,研究不同料液比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6 w/v)對Ca-SGP得率的影響。在NaCl濃度為0.3 mol/L,料液比為1∶3 (w/v)的條件下,研究不同提取時間(1、2、3、4、5、6 h)對Ca-SGP得率的影響.鯽魚卵中的唾液酸主要存在于Ca-SGP中,本實驗通過測定提取液中Neu5Ac的得率間接反映Ca-SGP的得率。

Neu5Ac得率(mg/100 g)=Neu5Ac含量(mg)/魚卵濕重(g)×100

1.2.5.2 響應(yīng)面試驗 在單因素實驗基礎(chǔ)上,利用Design Expert 8.0.4軟件按照Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計原理,選取NaCl濃度、料液比和提取時間3個因素,以Neu5Ac得率為響應(yīng)值,采用3因素3水平的響應(yīng)面分析方法,因素水平編碼如表1所示[15]。

表1 因素水平編碼表Table 1 Coding of factors and levels

1.2.6Ca-SGP對MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響 按1.2.4方法測定濃度為0、25、50、100 μg/mLCa-SGP溶液對MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響。

1.2.7Ca-SGP對MC3T3-E1細(xì)胞分化的影響 將濃度為2×104個/mL的對數(shù)期MC3T3-E1細(xì)胞接種于24孔板中,每孔接種1 mL,培養(yǎng)24 h后,待每孔細(xì)胞長滿至90%時,吸棄培養(yǎng)液,加入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液(含10 m mol/Lβ-GP和50 μg/mL VC),記為分化第0 d,分別加入0、25、50、100 μg/mLCa-SGP,每2 d換液一次,取第7 d細(xì)胞培養(yǎng)上清液用ELISA試劑盒測定COLⅠ的含量,取14 d細(xì)胞培養(yǎng)上清液采用ELISA試劑盒測定OPN和OCN的含量[13]。

1.2.8Ca-SGP對MC3T3-E1細(xì)胞礦化的影響 細(xì)胞分化至21 d后,吸棄培養(yǎng)基,以無菌D-Hanks緩沖液清洗細(xì)胞,然后加入70%乙醇溶液固定細(xì)胞15 min,以D-Hands緩沖液清洗后,用0.5% Tris-HCl(pH8.3)茜素紅染色液染色15 min,將24孔板置于解剖鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)并拍照,加入100 mmol/L的氯化十六烷基吡啶溶解細(xì)胞中的茜素紅,于570 nm處測定吸光度值,半定量檢測細(xì)胞礦化程度[13]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 具有MC3T3-E1細(xì)胞增殖作用的魚卵唾液酸糖蛋白的篩選

本實驗從不同水產(chǎn)動物卵和雞蛋中提取水溶性糖蛋白,分別測定了它們的Neu5Ac含量和對前成骨細(xì)胞MC3T3-E1的增殖作用。結(jié)果如圖1所示,鯽魚卵水溶性蛋白Neu5Ac含量最高,為5.76%,魷魚和貽貝卵水溶性蛋白不含Neu5Ac。各水產(chǎn)動物卵水溶性糖蛋白濃度為400 μg/mL,細(xì)胞培養(yǎng)72 h時,鯽魚卵水溶性蛋白對MC3T3-E1的增殖率最高,為145.71%,魷魚和貽貝卵水溶性蛋白增殖率最低,分別為105.33%和106.39%。

圖1 不同水產(chǎn)動物魚卵水溶性糖蛋白的Neu5Ac含量和對MC3T3-E1細(xì)胞增殖率影響Fig.1 Neu5Ac content of water-soluble glycoprotein from different aquatic animal eggs and its effect on the proliferation of MC3T3-E1

對各水產(chǎn)動物卵水溶性糖蛋白Neu5Ac含量和增殖率進行相關(guān)性分析,結(jié)果如圖2所示,Neu5Ac含量與增殖率呈現(xiàn)正相關(guān)性,相關(guān)性系數(shù)為0.919。提示水產(chǎn)動物卵水溶性糖蛋白對MC3T3-E1細(xì)胞增殖作用與水溶性糖蛋白中的唾液酸糖蛋白有關(guān)。研究表明,雞蛋中脫脂卵黃水溶性蛋白調(diào)節(jié)骨代謝功能的功效成分是唾液酸糖蛋白[16]。因此,本論文以鯽魚卵為原料制備具有促骨形成作用的Ca-SGP。

圖2 不同水產(chǎn)動物魚卵水溶性糖蛋白的Neu5Ac含量和MC3T3-E1細(xì)胞增殖率的相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis between Neu5Ac content and the proliferation of MC3T3-E1 of water-soluble glycoprotein from different aquatic animaleggs

2.2 Ca-SGP提取工藝優(yōu)化

為了提高Ca-SGP的得率,本實驗選取NaCl濃度、液料比和提取時間三個因素,以Neu5Ac得率為響應(yīng)值,對Ca-SGP的提取工藝進行單因素和響應(yīng)面優(yōu)化。

2.2.1 單因素試驗結(jié)果

2.2.1.1 氯化鈉濃度對Neu5Ac得率的影響 結(jié)果如圖3所示,Neu5Ac得率隨著NaCl濃度的增加呈上升趨勢,當(dāng)NaCl濃度為0.3 mol/L時,Neu5Ac得率最大,為556.29 mg/100 g(以濕基計),而后隨著NaCl濃度的升高,Neu5Ac得率變化不明顯。這可能與提取液離子強度對唾液酸糖蛋白溶解度影響有關(guān),一定鹽離子濃度可以增加糖蛋白表面的電荷,增強糖蛋白與水分子間的相互作用,提高蛋白質(zhì)在水中的溶解能力。

圖3 氯化鈉濃度對Neu5Ac得率的影響Fig.3 Effect of NaCl concentration on the yield of Neu5Ac

2.2.1.2 料液比對Neu5Ac得率的影響 結(jié)果如圖4所示,Neu5Ac得率隨著料液比的增大而增加,當(dāng)料液比(w/v)為1∶3時,Neu5Ac得率最大,隨后料液比的增大,Neu5Ac得率增大不明顯。唾液酸糖蛋白具有一定的溶解度,當(dāng)料液比達(dá)到一定比例后,唾液酸糖蛋白的溶解度不會隨溶液體積的增加而增大,從而使其得率趨于穩(wěn)定。為了提高提取效率,選取料液比(w/v)為1∶3為最適比例。

圖4 不同液料比對Neu5Ac得率的影響Fig.4 Effect of different materiel ratio on the yield of Neu5Ac

2.2.1.3 提取時間對Neu5Ac得率的影響 考察不同提取時間對唾液酸得率的影響。由圖5可知,隨著提取時間的增加,Neu5Ac得率隨之增大,在提取時間4 h時,Neu5Ac的得率達(dá)到最大值。

圖5 不同提取時間對Neu5Ac得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the yield of Neu5Ac

2.2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,采用Box-Benhnken實驗設(shè)計,選取NaCl濃度(X1)、提取時間(X2)和料液比(X3)為自變量,Neu5Ac得率為響應(yīng)值,進行三因素三水平的響應(yīng)面試驗。響應(yīng)面試驗設(shè)計方案和結(jié)果見表2。采用Design Expert 8.05軟件對表2數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合,得到Neu5Ac得率對試驗因素的二次多項回歸方程:

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Experimental design and results

表3 響應(yīng)面回歸模型ANOVA分析結(jié)果Table 3 ANOVA for response surface quadratic model analysis of variance table

圖6 各因素對Neu5Ac得率的響應(yīng)面分析Fig.6 RSM analysis for interactive effects of factors

2.3 Ca-SGP對前成骨MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響

成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成小于破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的本質(zhì)原因[18-19]。骨形成是成骨細(xì)胞經(jīng)過增殖后,形成多層細(xì)胞,進入分化階段,分泌COL I、OCN、OPN等蛋白質(zhì)形成骨基質(zhì),鈣磷等離子沉積在骨基質(zhì)中完成礦化階段[20-21]。

如圖7所示,Ca-SGP明顯促進MC3T3-E1細(xì)胞增殖,并具有劑量依賴性。當(dāng)濃度為100 μg/mL時,增殖率為135.56%。

圖7 Ca-SGP對前成骨MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響Fig.7 Effect of Ca-SGP on MC3T3-E1 cell proliferation

2.4 Ca-SGP對前成骨MC3T3-E1細(xì)胞分化的影響

COL I是骨組織中含量最豐富的蛋白質(zhì),由成骨細(xì)胞合成并分泌到細(xì)胞外形成基質(zhì)膠原,為鈣磷沉積提供骨架,是成骨細(xì)胞分化的早期標(biāo)志物和骨形成的關(guān)鍵條件[22-23]。如圖8A所示,Ca-SGP顯著提高COL I的含量(P<0.05),并具有劑量依賴性。當(dāng)濃度為100 μg/mL時,COL I的含量為32.23 ng/mL,說明Ca-SGP促進MC3T3-E1合成分泌COL I,為骨形成提供條件。

圖8 Ca-SGP對MC3T3-E1細(xì)胞分化的影響Fig.8 Effect of Ca-SGP on MC3T3-E1 cell differentiation注:*表示差異顯著P<0.05,*表示差異極顯著P<0.01;圖9同。

成骨細(xì)胞分泌的OPN通過其結(jié)構(gòu)中的天冬氨酸區(qū)域與羥基磷灰石結(jié)合,形成礦化結(jié)節(jié),為礦化提供重要基礎(chǔ)[25]。如圖8B所示,Ca-SGP顯著提高OPN,濃度為100 μg/mL時,OCN的含量為261.46 ng/mL,說明Ca-SGP促進MC3T3-E1合成分泌OPN,促進骨礦化。

OCN是成骨細(xì)胞特異合成和分泌的一種非膠原蛋白,對骨組織的礦化具有重要作用,是成骨細(xì)胞分化后期的標(biāo)志物[24]。如圖8C所示,Ca-SGP顯著提高OCN的含量(P<0.05),濃度為100 μg/mL時,OCN的含量為85.89 ng/mL,說明Ca-SGP促進MC3T3-E1合成分泌OCN,促進骨礦化。

2.5 Ca-SGP對前成骨MC3T3-E1細(xì)胞礦化的影響

成骨細(xì)胞增殖分化后進入礦化階段,其礦化能力是骨形成能力的直接體現(xiàn)[26]。如圖9所示,Ca-SGP處理后,MC3T3-E1細(xì)胞礦化能力顯著提高(P<0.05),濃度為100 μg/mL時,與未處理組相比礦化能力顯著增加了141.67%,表明Ca-SGP具有顯著促進骨形成的作用。

圖9 Ca-SGP對MC3T3-E1細(xì)胞礦化的影響Fig.9 Effect of Ca-SGP on MC3T3-E1 cell mineralization注:A為實驗圖，B為數(shù)據(jù)圖。

3 結(jié)論

14種水產(chǎn)動物卵中,鯽魚卵唾液酸含量最高,且對MC3T3-E1細(xì)胞增殖率最高。以鯽魚卵為原料制備Ca-SGP,通過單因素和響應(yīng)面試驗優(yōu)化得到Ca-SGP的最優(yōu)提取工藝為:NaCl濃度為0.38 mol/L、提取時間為4.2 h、液料比為1∶3.88 w/v。Ca-SGP顯著促進MC3T3-E1細(xì)胞增殖、分化和礦化,具有促骨形成作用。