李 晗,楊宗玲,畢永雪,張 蕊,徐玉巧,范方宇,*

(1.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,云南昆明 650224;2.西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,云南昆明 650224)

西番蓮(Passifloraedulis)是我國重要的熱帶水果之一,果皮含量約為50%。目前,西番蓮主要用于果汁和飲料生產(chǎn),果皮以丟棄為主,造成嚴(yán)重的資源浪費和環(huán)境污染[1]。而西番蓮果皮干燥后制成的粉碳水化合物含量較高,可作為膳食纖維或生物活性提取物的來源,用于食品、醫(yī)藥和化妝品行業(yè)[1]。西番蓮果皮粉(Passion Peel Flour,PPF)中可溶性膳食纖維(Soluble Dietary Fiber,SDF)含量約為35%[1]。西番蓮果皮膳食纖維(PSDF)是一種低熱量化合物,被認為是健康飲食的重要組成部分,可用于降低血清膽固醇和血糖含量,對胃腸道功能調(diào)節(jié)、輔助治療心血管疾病和糖尿病有促進作用[2]。此外,PSDF在食品工業(yè)中也可廣泛用于改善產(chǎn)品質(zhì)地或改善營養(yǎng)[3]。

目前,SDF的提取方法包括化學(xué)法、酶法、微生物發(fā)酵法和超聲波法等[4-5]?；瘜W(xué)法操作簡單、成本低,但酸堿和高熱處理易破壞SDF結(jié)構(gòu);酶法條件溫和,操作方便,所得SDF質(zhì)量較好,但提取條件嚴(yán)格,費用較高;發(fā)酵法制得的SDF純度較高,色澤、氣味、分散程度和持水力等均優(yōu)于化學(xué)法,但技術(shù)尚未成熟;超聲波法提取SDF,可提高得率,縮短時間[4-5]。超聲波通過液體介質(zhì)時,液體和溶解氣體的相互作用會產(chǎn)生聲空化現(xiàn)象,會影響碳水化合物聚合形態(tài)和結(jié)構(gòu)[6]。近年來,超聲波技術(shù)由于其環(huán)保性,已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)領(lǐng)域。Zhang等[6]、Bagherian等[7]、Chen等[8]在SDF的提取研究中均發(fā)現(xiàn),超聲處理可有效提高SDF得率,并縮短提取時間。

基于此,研究采用超聲波預(yù)處理輔助酶法提取PSDF,以料液比、酶解溫度、超聲功率、混合酶量四個因素進行單因素實驗,結(jié)合正交實驗優(yōu)化PSDF提取條件,并對其理化性質(zhì)進行分析。以期為PSDF的提取提供新的技術(shù)參考,為西番蓮的綜合利用開辟新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西番蓮 云南昆明;玉米油、豬油 重慶豐順冷凍副食品糧油有限公司;檸檬酸(分析純) 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;α-淀粉酶(10000 U/g) 邢臺萬達生物工程有限公司;木瓜蛋白酶(100000 U/g) 南寧龐博生物工程有限公司;95%乙醇 天津市致遠化學(xué)試劑有限公司;膽固醇(分析純) 上?；际郎噭┯邢薰?鄰苯二甲醛(分析純) 上海源葉生物科技有限公司;鹽酸、硫酸、冰醋酸(分析純) 云南楊林工業(yè)開發(fā)區(qū)汕滇藥業(yè)有限公司。

DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;UV-2600紫外可見分光光度計 島津儀器(蘇州)有限公司;SB25-12DTDS超聲波清洗器 寧波新藝超聲設(shè)備有限公司;CRT-400高速多功能粉碎機 永康市超然電器有限公司;DZKW-4電熱恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)儀器有限公司;IKA RV10立式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 南京榮華科學(xué)器材有限公司;5804R臺式冷凍離心機 德國艾本德股份公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 西番蓮果皮洗凈,60 ℃恒溫干燥箱內(nèi)干燥48 h。干燥果皮于超微粉碎機中粉碎,過60目篩,取篩下樣品,得PPF,4 ℃環(huán)境密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 粗PSDF提取工藝 稱取5 g PPF于燒杯中,加入適量0.2%檸檬酸溶液,40 ℃超聲提取30 min后取出,加入混合酶(α-淀粉酶∶木瓜蛋白酶=1∶1)酶解1 h,沸水浴滅酶10 min,冷卻后加入樣液體積的1/3的10%過氧化氫于45 ℃水浴脫色1 h,4000 r/min離心20 min,取上清液于50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至原體積的1/3,加入濃縮液4倍體積的預(yù)熱至60 ℃的95%乙醇,醇沉30 min,5000 r/min離心20 min,取沉淀50 ℃烘干,得到粗PSDF。得率以公式(1)計算。

PSDF得率(%)=(粗PSDF粉末質(zhì)量/PPF質(zhì)量)×100

式(1)

1.2.3 單因素實驗 固定條件為:料液比1∶20 g/mL、酶解溫度70 ℃、超聲功率300 W、混合酶量0.4%。分別研究料液比(1∶14、1∶17、1∶20、1∶23、1∶26 g/mL)、酶解溫度(50、60、70、80、90 ℃)、超聲功率(200、250、300、350、400 W)、混合酶量(0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%)對粗PSDF得率的影響。

1.2.4 正交試驗 在單因素實驗基礎(chǔ)上,以PSDF得率為評價指標(biāo),采用L9(34)正交試驗優(yōu)化提取工藝。正交試驗因素水平見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.5 理化性質(zhì)測定 對PPF和PSDF分別進行理化性質(zhì)測定。

1.2.5.1 溶脹性測定 參照陳良云等[9]的方法進行測定。稱取0.500 g樣品于10 mL量杯中,加入7 mL蒸餾水,振蕩均勻,室溫靜置24 h,觀察樣品的自由膨脹體積。溶脹性以公式(2)計算。

溶脹性(mL/g)=(樣品膨脹體積-干樣品體積)/干樣品質(zhì)量

式(2)

1.2.5.2 持水力測定 參照陳良云等[9]的方法進行測定。稱取0.500 g樣品于離心管中,加入7 mL蒸餾水,混勻,室溫靜置24 h,4000 r/min離心20 min,棄上清液,稱取剩余殘渣質(zhì)量。持水力以公式(3)計算。

持水力(g/g)=(離心后樣品質(zhì)量-離心前樣品質(zhì)量)/干樣品質(zhì)量

式(3)

1.2.5.3 堆積密度測定 參照Basanta等[10]的方法進行測定。稱取一定質(zhì)量的樣品于10 mL量杯中,記錄體積。堆積密度以公式(4)計算。

堆積密度(g/cm3)=樣品質(zhì)量/樣品體積

式(4)

1.2.5.4 脂肪結(jié)合力測定 參照陳良云等[9]的方法進行測定。分別取0.500 g樣品于10 mL離心管中,一個離心管加入10 g豬油(飽和脂肪酸結(jié)合力),另一個加入10 g玉米油(不飽和脂肪酸結(jié)合力),靜置1 h,4000 r/min離心20 min,棄上層油,稱重。脂肪結(jié)合力以公式(5)計算。

脂肪結(jié)合力(g/g)=(離心后樣品質(zhì)量-離心前樣品質(zhì)量)/干樣品質(zhì)量

式(5)

1.2.5.5 膽固醇吸附力測定 采用鄰苯二甲醛法進行測定,參照齊慧等[11]的方法。

a.膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:分別取0.3 mg/mL膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70 mL于比色管中,加入冰乙酸至0.8 mL,然后依次加入1 mg/mL鄰苯二甲醛0.4 mL及混合酸(濃硫酸∶冰乙酸=1∶1)8 mL,靜置15 min,于550 nm處測定各標(biāo)準(zhǔn)管吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo)(y),膽固醇含量(μg)為橫坐標(biāo)(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程:y=0.0093x-0.0116,R2=0.9993。

b.樣品處理:取鮮雞蛋蛋黃加入9倍體積蒸餾水,攪打成乳液。分別取0.500 g樣品于錐形瓶中,加入25 mL稀釋蛋黃液并攪勻,分別調(diào)節(jié)pH為2.0和7.0,于37 ℃,120 r/min搖床中振蕩4 h,5000 r/min離心30 min。取0.1 mL上清液,采用鄰苯二甲醛法測定樣品膽固醇含量。膽固醇吸附力以公式(6)計算。

膽固醇吸附力(mg/g)=(吸附前蛋黃乳液膽固醇量-吸附后上清液膽固醇量)/干樣品質(zhì)量

式(6)

1.2.6 紅外光譜測定 采用溴化鉀壓片法處理樣品。稱取適量樣品與KBr粉末混勻并充分研磨。取少量粉末均勻放入壓片機內(nèi),壓片5 min后取出放入紅外光譜儀中掃描,掃描范圍為4000～400 cm-1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗重復(fù)3次,實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 20軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析和顯著性檢驗,并用Origin 2017軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 料液比對PSDF得率的影響 圖1可見,料液比1∶14～1∶26 g/mL范圍內(nèi),PSDF得率隨料液比升高而增大,1∶26 g/mL時得率為11.18%(P<0.05)。這是因料液比過低時,溶液黏度大,不利于PSDF從樣品中溶出;隨料液比升高,增大了樣品中PSDF在溶劑中的溶出機會,得率增大[12]。料液比1∶23～1∶26 g/mL范圍的得率增加幅度明顯低于1∶17～1∶23 g/mL,表明此時得率雖然還處于增加狀態(tài),但增幅已有所下降。料液比過高,提取液體積過大,在后期進行濃縮時所需時間增加,操作中的能耗和工序加大,同時需消耗大量乙醇溶液,生產(chǎn)成本增加[12]。綜合考慮到提取效率減慢和生產(chǎn)成本增加,未選擇繼續(xù)擴大料液比。因此,選取1∶20、1∶23、1∶26 g/mL三個水平進行實驗較為適宜。

圖1 料液比對PSDF得率的影響Fig.1 Effects of solid/solvent ratio on PSDF yield注:字母相同表示差異不顯著(P>0.05),字母不同表示差異顯著(P<0.05)；圖2～圖4同。

2.1.2 酶解溫度對PSDF得率的影響 圖2可見,50～70 ℃時,PSDF得率隨溫度增加而增加,70 ℃時得率最高,為8.62%?？赡苁且驕囟壬呒涌炝怂肿舆\動速率,酶活力增加,促進了蛋白質(zhì)、淀粉等物質(zhì)酶解[5],從而增大PSDF得率。溫度高于70 ℃后,PSDF得率顯著下降(P<0.01),80 ℃時降低了14.15%。原因為溫度升高,果膠發(fā)生熱降解,果膠鏈降解成小分子寡聚糖和單糖;同時溫度過高會抑制酶活性,降低酶的水解能力,阻礙了PSDF的溶出[5]。因此,酶解溫度選取60、70、80 ℃三個水平較為適宜。

圖2 酶解溫度對PSDF得率的影響Fig.2 Effects of hydrolysis temperature on PSDF yield

2.1.3 超聲功率對PSDF得率的影響 圖3可見,超聲功率200～300 W時,PSDF得率呈上升趨勢,功率300 W時得率最高,為8.58%;當(dāng)功率大于300 W時,得率降低。與相同條件下未經(jīng)超聲處理的PSDF得率相比顯著提高了6.41%～19.49%(P<0.05),表明超聲預(yù)處理可有效提高PSDF得率。超聲處理可通過分子內(nèi)加熱和空化效應(yīng)產(chǎn)生大量空化氣泡,氣泡破裂產(chǎn)生能量促進西番蓮果皮組織細胞壁破裂和細胞物質(zhì)釋放,幫助溶劑進入組織細胞,增強細胞壁周圍邊界層的傳質(zhì)[5,13],促進PSDF的溶出。超聲功率300～400 W時得率顯著下降了10.96%(P<0.01)?？赡苁俏鞣徆そM織細胞在超聲波較強的機械剪切作用下,空化氣泡塌陷產(chǎn)生的熱效應(yīng)和剪應(yīng)力導(dǎo)致PSDF降解[5,13],降低了得率。因此,超聲功率選取250、300、350 W三個水平較為適宜。

圖3 超聲功率對PSDF得率的影響Fig.3 Effects of ultrasonic power on PSDF yield

2.1.4 混合酶量對PSDF得率的影響 圖4可見,PSDF得率隨混合酶量增加呈先增大后減小的趨勢。酶量0.2%～0.5%范圍內(nèi),PSDF得率呈增加趨勢;酶量0.5%時,PSDF得率最高,為9.9%。這是因為隨著混合酶量的增加,會有更多的酶活性位點催化原料中淀粉和蛋白質(zhì)等組分水解,從致密纖維結(jié)構(gòu)中釋放出PSDF[13],增大PSDF得率?；旌厦噶看笥?.5%時,PSDF得率下降了3.43%(P>0.05)?？赡苁且蛎噶窟^高,PSDF質(zhì)量濃度迅速增大,產(chǎn)物負反饋抑制效應(yīng)增加,抑制了酶解反應(yīng)的進行,造成水解度降低[14];同時,酶量過多也可能會破壞部分PSDF,降低PSDF得率。因此,混合酶量選取0.4%、0.5%、0.6%三個水平較為適宜。

圖4 混合酶量對PSDF得率的影響Fig.4 Effects of mixed enzyme content on PSDF yield

2.2 正交實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果,以料液比(A)、酶解溫度(B)、超聲功率(C)、混合酶量(D)進行正交實驗。正交試驗試果如表2所示。表2可見,影響PSDF得率由大到小的因素依次是A>D>B>C。PSDF提取最優(yōu)條件是A3B2C1D3,即料液比1∶26 g/mL、酶解溫度70 ℃、超聲功率250 W、混合酶量0.6%,此時得到PSDF得率為14.82%。由表2可知,正交實驗的PSDF得率整體大于單因素實驗,這是因為試因素實驗和正交實驗分別采用了不同批次的西番蓮,單因素實驗中,西番蓮為成熟后期,膳食纖維含量減少,因為成熟果皮中已有部分果膠水解為果膠酸,不被乙醇沉淀;正交實驗中,西番蓮為成熟初期,其膳食纖維含量較高。

表2 正交實驗結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental design and result

2.3 PPF與PSDF的理化性質(zhì)分析

溶脹性和持水力是評價PSDF功能的重要指標(biāo),取決于顆粒大小、形狀和疏水-親水相互作用,與其降膽固醇能力密切相關(guān)[15]。溶脹性和持水力較高,可促進腸道蠕動、增加糞便體積和水分,使大便松軟,易于有害物質(zhì)快速排出體外,減輕直腸壓力,預(yù)防便秘和結(jié)腸癌等[16]。表3可見,PSDF溶脹性與持水力分別為4.98 mL/g和4.93 g/g,與PPF相比差異極顯著(P<0.01),分別增加了52.29%、19.66%。這可能是因為超聲預(yù)處理破碎了果皮細胞壁,打開了纖維素分子間的部分氫鍵,親水基團暴露,水結(jié)合部位增加[17],提高了PSDF水合性質(zhì)。

表3 PPF與PSDF理化性質(zhì)Table 3 Physicochemical properties of PPF and PSDF

堆積密度反映PSDF的疏松程度,堆積密度小的PSDF,其結(jié)構(gòu)疏松,纖維空間和比表面積較大,具良好表面活性[10]。PSDF堆積密度為0.69 g/cm3,與PPF相比顯著下降了24.18%(P<0.05)。因此,提取的PSDF表面活性較好。

PSDF對脂肪和膽固醇的結(jié)合能力是評價其對脂溶性組分吸附能力的重要指標(biāo)[15]。表3可見,PSDF的飽和與不飽和脂肪結(jié)合力分別為1.55、1.29 g/g,相較于PPF分別增加了1.97%(P>0.05)、8.4%(P>0.05),表明PSDF脂溶性組分吸附能力有所提高?？赡苁浅曁幚砥茐牧薖SDF原有致密結(jié)構(gòu),使親水性基團和一些非極性基團更多地暴露出來[17],從而提高了PSDF脂肪結(jié)合力。

PPF和PSDF在模擬人體小腸環(huán)境(pH=7.0)的膽固醇吸附力均比胃環(huán)境(pH=2.0)高。這是因為酸性環(huán)境存在較多H+,使PPF、PSDF與膽固醇均帶有部分正電荷,從而產(chǎn)生排斥力,減弱了PPF、PSDF與膽固醇的結(jié)合力[11];而PPF和PSDF在中性環(huán)境可以更好地吸收多余的脂肪,減少脂肪與膽汁接觸,降低膽固醇含量[11]。表明反應(yīng)體系酸堿性對膽固醇吸附力有一定影響。PSDF膽固醇吸附力相較于PPF分別顯著增加了16.15%(pH=2.0,P<0.05)、10.47%(pH=7.0,P<0.05)。這是因為PSDF持水力更高(P<0.01),黏度更大,容易被腸道微生物發(fā)酵,產(chǎn)生短鏈脂肪酸,發(fā)揮生理調(diào)節(jié)功能,從而吸附膽固醇[2]。同時超聲輔助預(yù)處理引起部分不溶性大分子纖維斷裂,轉(zhuǎn)變?yōu)樾》肿涌扇苄越M分,微晶束減少,空間阻礙降低[18],提高了PSDF膽固醇吸附力。

2.4 PPF與PSDF的紅外光譜分析

圖5為PPF與PSDF中的紅外光譜譜圖。PPF與PSDF分別在3426.01、3435.67 cm-1處表現(xiàn)出較寬的拉伸強烈特征峰,與O-H的拉伸振動有關(guān),表明PPF與PSDF中-OH和結(jié)合水分子較多;但PSDF的光譜峰強度有所下降,可能是脫水所致[19-20];PSDF在3435.67 cm-1處的峰形較寬,表明PSDF分子間氫鍵相互作用較強[21]。PPF在2917.72 cm-1處的C-H拉伸振動強度略高于2938.34 cm-1處的PSDF,可能是PPF中木質(zhì)素、纖維素含量較多[21]。O-H和C-H的存在表明樣品存在典型的多糖結(jié)構(gòu)[20]。在1623.50、1628.01 cm-1處觀察到PPF和PSDF都出現(xiàn)了糖分子中羰基C=O的伸縮振動,說明其存在糖醛酸[20,22];但PSDF中峰的強度明顯小于PPF,表明PPF中醛基或羧基較多[20]。1400 cm-1左右的峰是C-H的振動,為碳水化合物中的-CH引起,是糖類的特征峰[21]。PSDF在1111.37 cm-1處吸收峰較強,可能是吡喃糖環(huán)的O-H變角振動吸收峰。此外,PPF和PSDF分別在1052.73、1019.88 cm-1處的強烈吸收帶是碳水化合物的特征,歸因于吡喃葡萄糖結(jié)構(gòu)中C-O-H的O-H的變角振動和C-O-C環(huán)內(nèi)醚中C-O的伸縮振動,也可能是伯醇的混合振動[20-21],是多糖的另一特征吸收峰。PSDF在619.18 cm-1處有一個較強吸收峰,可能存在游離的醇或酚[22]。綜上,PPF和PSDF均可能含有酚類、糖類、胺類、醇類化合物,因含量或結(jié)合程度不同,導(dǎo)致其吸收強度有差異。

圖5 PPF與PSDF的紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectra of PPF and PSDF注:a:PPF;b:PSDF。

3 結(jié)論

正交試驗結(jié)果可知,PSDF最佳提取條件為料液比1∶26 g/mL、酶解溫度70 ℃、超聲功率250 W、混合酶量0.6%,此時PSDF得率為14.82%。最佳工藝條件下提取的PSDF與PPF相比:PSDF溶脹性與持水力極顯著增加了52.29%、19.66%(P<0.01);堆積密度為0.69 g/cm3,下降了24.18%(P<0.05),表明其纖維空間和比表面積增大,表面活性較好;飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸結(jié)合力分別增加了1.97%、8.4%(P>0.05),PSDF脂溶性組分吸附能力有所提高;模擬胃環(huán)境(pH=2.0)和腸道環(huán)境(pH=7.0)下的膽固醇吸附能力分別增加了16.15%、10.47%(P<0.05)。傅立葉紅外光譜分析表明,PPF和PSDF均具有典型的多糖特征吸收峰。