趙 瀅,劉利娥,韓 萍,何志東,趙宵帝

(鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室,河南鄭州 450001)

多糖是構(gòu)成生命活動(dòng)和維持生物功能的四大基本物質(zhì)之一[1],具有抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力、降血糖等生物學(xué)作用[2-5]。蔓菁(BrassicarapaL.)又名蕪菁、恰瑪古,是十字花科蕓薹屬兩年生具有藥食兩用價(jià)值的草本植物[6],其肉質(zhì)塊根中多糖含量豐富,是天然植物多糖的理想來源[7-8]。

目前蔓菁多糖的提取工藝主要為水浴提取[9-10],此方法耗時(shí)、耗能、提取產(chǎn)物活性低[11],所以需要對現(xiàn)有方法進(jìn)行優(yōu)化。新型超聲輔助提取法通過超聲波機(jī)械振動(dòng)產(chǎn)生空化作用促進(jìn)有效物質(zhì)與溶劑充分混合,提高傳質(zhì)速率,減少多糖的降解[12]。響應(yīng)面法可通過建立數(shù)學(xué)模型準(zhǔn)確找出提取工藝中各影響因素的最佳組合方式,并對多糖得率的最優(yōu)值進(jìn)行預(yù)測[13]。蔡嘯鏑等[14]使用超聲輔助法提取新疆恰瑪古多糖,與普通水浴提取法相比[15],提取時(shí)間縮短了1.41 h,液料比減少了44.33%,省時(shí)節(jié)能。但此研究并未把超聲溫度這一重要影響因素納入到優(yōu)化條件當(dāng)中,所以超聲輔助提取蔓菁多糖工藝還需進(jìn)一步深入研究。

因此,本文利用響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)建立多元回歸方程,以擬合超聲輔助提取過程中各因素與多糖得率之間的相關(guān)關(guān)系,得到最佳提取條件,多糖含量的測定采用改進(jìn)的苯酚硫酸法,并對所提取蔓菁多糖的抗氧化性進(jìn)行研究,旨在為蔓菁多糖進(jìn)一步開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蔓菁 購于新鄉(xiāng)市鳳泉區(qū),由鄭州大學(xué)潘成學(xué)副教授鑒定為蔓菁?jí)K根;正己烷、無水乙醇 分析純,天津市永大化學(xué)試劑有限公司;硫酸亞鐵 天津市化學(xué)試劑供銷公司;無水葡萄糖(分析標(biāo)準(zhǔn)品,≥98%) 北京索萊寶科技有限公司;30%過氧化氫洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司;水楊酸 分析純,天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司;抗壞血酸 分析純,天津市永大化學(xué)試劑有限公司。

KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;L420型臺(tái)式低速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;LGJ-18B型冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司;UV-1601紫外分光光度計(jì) 日本島津公司;Spectra Max M2e型多功能微孔板讀數(shù)儀 上海美谷分子儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蔓菁多糖的提取與精制 將蔓菁?jí)K根洗凈、去皮、切成1 mm薄片、50 ℃烘干、粉碎后過60目篩,于正己烷中回流脫脂,濾渣在通風(fēng)櫥中干燥過夜。稱取適量脫脂后的蔓菁粉末,按一定液料比加入蒸餾水,在一定超聲功率、一定溫度下提取一定時(shí)間,且提取2次,合并濾液后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/3,用Sevage法脫蛋白[16],所得上清液每100 mL加入2 g活性炭脫色,60 ℃水浴30 min后抽濾,濾液中加入95%乙醇至醇濃度達(dá)80%,4 ℃靜置過夜后離心,沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚反復(fù)清洗,真空冷凍干燥后即得蔓菁多糖。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

1.2.2.1 液料比對蔓菁多糖得率的影響 稱取5份蔓菁粉末各0.5 g,按液料比20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1 mL/g加入蒸餾水,置于60 ℃水浴中超聲輔助提取50 min,功率為210 W,考察液料比對蔓菁多糖得率的影響。

1.2.2.2 提取溫度對蔓菁多糖得率的影響 稱取5份蔓菁粉末各0.5 g,按液料比40∶1加入蒸餾水,分別置于40、50、60、70、80 ℃水浴中超聲輔助提取50 min,功率為210 W,考察提取溫度對蔓菁多糖得率的影響。

1.2.2.3 提取時(shí)間對蔓菁多糖得率的影響 稱取5份蔓菁粉末各0.5 g,按液料比40∶1加入蒸餾水,置于60 ℃水浴中分別超聲輔助提取10、30、50、70、90 min,功率為210 W,考察提取時(shí)間對蔓菁多糖得率的影響。

1.2.2.4 超聲功率對蔓菁多糖得率的影響 稱取5份蔓菁粉末各0.5 g,按液料比40∶1加入蒸餾水,置于60 ℃水浴中超聲輔助提取50 min,功率分別為150、180、210、240、270 W,考察超聲功率對蔓菁多糖得率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,以液料比、提取溫度、提取時(shí)間、超聲功率為試驗(yàn)因素,以蔓菁多糖得率為響應(yīng)值,運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Behnken中心組合法則進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),以確定蔓菁多糖的最佳提取條件,試驗(yàn)4因素3水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.4 蔓菁多糖得率的測定

1.2.4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(0.1 mg/L)0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0 mL至25 mL具塞試管中,蒸餾水定容至2.0 mL,分別加入1 mL 5%苯酚溶液和5 mL濃硫酸,混合均勻后靜置10 min,沸水浴加熱15 min,冷卻至室溫,以2.0 mL蒸餾水為空白,于490 nm處測吸光度,以葡萄糖濃度(x)為橫坐標(biāo),吸光度(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=15.5698x-0.0184,R2=0.9988。

1.2.4.2 換算因子的測定 參照吳擁軍等[17]試驗(yàn)方法,并稍作修改。準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的蔓菁多糖10 mg,加水定容至100 mL,吸取1 mL,用蒸餾水定容至2 mL,按照1.2.4.1中的步驟顯色并測其吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的回歸方程計(jì)算多糖溶液中葡萄糖的濃度,計(jì)算換算因子f=m/(c×d×v),式中m為多糖質(zhì)量(mg),c為多糖溶液中葡萄糖濃度(mg/mL),d為多糖溶液的稀釋倍數(shù),v為體積(mL)。計(jì)算得到f=1.4281。

1.2.4.3 樣品中蔓菁多糖得率測定 精密稱取蔓菁粉末0.5 g,按一定液料比、提取溫度、提取時(shí)間、功率超聲提取兩次,抽濾、合并濾液,定容于100 mL容量瓶中,取1 mL置于50 mL容量瓶中定容,取2 mL濾液置于具塞試管中,按照“1.2.4.1”中的步驟顯色并測其吸光度,由標(biāo)準(zhǔn)曲線和換算因子計(jì)算多糖得率。

多糖得率(%)=(c×d×v×f)/m

式中,c為待測溶液中葡萄糖濃度,mg/mL;d為稀釋倍數(shù);v為待測溶液體積,mL;f為換算因子;m為蔓菁粉末質(zhì)量,mg。

1.2.5 蔓菁多糖對·OH清除力測定 參照Yu等[18]方法。吸取100 μL 2.00 mg/L的蔓菁多糖溶液于96孔板中,進(jìn)行2倍梯度稀釋,配成濃度為2.00、1.00、0.50、0.25、0.13 mg/L的溶液。每孔依次加入50 μL 8.98 mmol/L的硫酸亞鐵溶液、50 μL 8.93 mmol/L的水楊酸乙醇溶液、50 μL 9.00 mmol/L的過氧化氫溶液,置37 ℃恒溫箱中30 min。相同濃度冷凍干燥后的蔓菁多糖樣品做3組平行試驗(yàn),在波長510 nm處測吸光度Ai,用等量去離子水分別替換過氧化氫溶液和樣品多糖溶液,測定Aj和Ac。以抗壞血酸作為陽性對照,濃度等梯度稀釋為6.00、3.00、1.50、0.75、0.38、0.19、0.09 mg/mL?！H清除率由以下公式計(jì)算獲得,IC50值表示·OH清除率達(dá)50%時(shí)所需的樣品質(zhì)量濃度,常用IC50值的大小表示樣品抗氧化性的高低。

式中:Ai為樣品組吸光度;Aj為去離子水代替過氧化氫溶液測得對照組的吸光度;Ac為空白組吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)平行測定三次,所得結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用Microsoft Excel 2016軟件、Origin軟件和Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及繪圖制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 液料比對蔓菁多糖得率的影響 由圖1可知,當(dāng)液料比從20∶1 (mL/g)增至40∶1 (mL/g),蔓菁多糖得率逐漸升高,其原因可能是液料比較低時(shí)溶液的粘稠度大,超聲波對細(xì)胞的空化作用較弱,加之細(xì)胞內(nèi)外溶質(zhì)的濃度差較小,不利于多糖溶出,隨著蒸餾水量的增加,溶液粘稠度降低,細(xì)胞內(nèi)外多糖的濃度差增大,有利于多糖向溶劑中擴(kuò)散[19-20]。當(dāng)液料比增至為40∶1 (mL/g)時(shí),多糖得率達(dá)到最大值為64.87%,之后隨著液料比繼續(xù)增加,超聲波所產(chǎn)生的能量大多被溶劑吸收,并且雜質(zhì)溶出較多,多糖得率反而下降[20]。因此,液料比為40∶1 (mL/g)最合適。

圖1 液料比對多糖得率的影響Fig.1 Effect of liquid-to-solid ratio on yield of polysaccharides

2.1.2 提取溫度對蔓菁多糖得率的影響由圖2可知,隨著溫度從40 ℃升高到60 ℃,多糖得率顯著提高,60 ℃達(dá)到最大值65.19%,一方面可能是因?yàn)樵谶m當(dāng)范圍內(nèi)升高溫度可降低溶液的粘稠度,增加多糖在溶液中的溶解度和擴(kuò)散性,從而提高了多糖得率。另一方面,適當(dāng)升溫可增加超聲所產(chǎn)生的空化作用,加大細(xì)胞損傷,促使細(xì)胞內(nèi)多糖向外界溶出,從而使多糖得率升高[21]。當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃時(shí)繼續(xù)升溫,高溫不僅會(huì)造成多糖的分解還會(huì)使溶液中的大量水分蒸發(fā),從而使多糖得率降低[22]。因此,適宜的提取溫度為60 ℃。

圖2 提取溫度對多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on yield of polysaccharides

2.1.3 提取時(shí)間對蔓菁多糖得率的影響 由圖3可知,隨著提取時(shí)間的增加,蔓菁多糖的得率逐漸升高,在50 min時(shí)達(dá)到最大值64.78%,繼續(xù)延長提取時(shí)間,多糖得率反而下降。這種現(xiàn)象可以解釋為,在提取的早期,超聲波產(chǎn)生的空化作用使蔓菁細(xì)胞逐漸破裂,增加了提取液與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的接觸面積,促進(jìn)了多糖的溶出,從而得率升高。但隨著提取時(shí)間的延長,提取液蒸發(fā)減少,蔓菁多糖溶出趨于飽和,并且會(huì)造成多糖的降解[23]。因此,從節(jié)約時(shí)間和提取效果的角度考慮,適宜的提取時(shí)間為50 min。

圖3 提取時(shí)間對多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on yield of polysaccharides

2.1.4 超聲功率對蔓菁多糖得率的影響由 圖4可知,超聲功率在150～270 W之間時(shí),蔓菁多糖的得率隨功率的增加先升高后降低。隨著功率的增大,超聲波對細(xì)胞的作用越強(qiáng),使細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的通透性增加,從而增加多糖傳質(zhì)速率,使多糖產(chǎn)量增加[21]。當(dāng)功率超過180 W,過大的超聲功率會(huì)破壞多糖結(jié)構(gòu),從而使得率降低[14]。因此,超聲功率為180 W較合適。

圖4 超聲功率對多糖得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on yield of polysaccharides

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果 以單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù),選取液料比(mL/g)、提取溫度(℃)、提取時(shí)間(min)和超聲功率(W)為自變量,蔓菁多糖得率為響應(yīng)值,通過Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面分析,所得試驗(yàn)組合和結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值Table 2 Design and response value of Box-Behnken experiment

2.2.2 模型的建立與統(tǒng)計(jì)分析 利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到蔓菁多糖得率Y(%)對編碼自變量液料比A(mL/g)、提取溫度B(℃)、提取時(shí)間C(min)和超聲功率D(W)的四元二次回歸方程:Y=65.39+0.4A-0.044B+0.21C-0.032D-0.18AB-0.05AC+0.42AD-0.42BC-0.065BD+0.015CD-0.6A2-0.48B2-0.48C2-0.74D2。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析 通過Design-Expert 8.0.6軟件繪制響應(yīng)面圖和等高線圖可以直觀反映研究因素及其交互作用對蔓菁多糖得率的影響,響應(yīng)面圖中曲線越彎曲說明研究因素對多糖得率影響越大,等高線呈橢圓形說明研究因素之間的交互作用顯著[24]。如圖5所示,液料比與提取溫度之間存在顯著交互作用,固定液料比,多糖得率隨溫度的升高先緩慢增加后有降低趨勢,在同一溫度下,多糖得率隨液料比的增加先升高后降低。圖6顯示,液料比與超聲功率之間的交互作用極顯著,在一定液料比下,多糖得率隨超聲功率的增加先升高后降低,對于同一超聲功率,多糖得率隨液料比的增加先升高后趨于平穩(wěn),由響應(yīng)面圖兩側(cè)彎曲程度可以看出液料比對多糖得率的影響大于超聲功率。由圖7可知,溫度與時(shí)間之間的交互作用極顯著,當(dāng)溫度固定時(shí),多糖得率隨時(shí)間增加先升高后降低,當(dāng)時(shí)間固定時(shí),多糖得率的變化趨勢隨溫度的升高也呈現(xiàn)出相同的變化。

圖5 液料比和提取溫度的交互作用對多糖得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots of the interaction effect between liquid-solid ratio and extraction temperature on yield of polysaccharides

圖6 液料比和超聲功率的交互作用對多糖得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots of the interaction effect between liquid-solid ratio and ultrasonic power on yield of polysaccharides

圖7 提取溫度和時(shí)間的交互作用對多糖得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots of the interaction effect between extraction temperature and time on yield of polysaccharides

2.2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過響應(yīng)面優(yōu)化分析結(jié)果顯示,超聲輔助提取蔓菁多糖的最佳提取工藝為液料比44.04∶1 (mL/g),提取溫度57.28 ℃,提取時(shí)間56.43 min,超聲功率183.27 W。根據(jù)儀器的實(shí)際操作范圍將此條件稍作修改,最佳提取參數(shù)設(shè)定為液料比44∶1 (mL/g),提取溫度57 ℃,提取時(shí)間56 min,超聲功率為180 W,在此條件下蔓菁多糖得率的預(yù)測值為65.51%,進(jìn)行三次平行試驗(yàn)得到實(shí)際值為65.43%,兩者的相對誤差為0.12%,說明該擬合模型具有可靠性。

2.3 對·OH的清除作用

通過Fenton體系產(chǎn)生·OH與水楊酸混合后的產(chǎn)物在510 nm處有特殊吸收。加入自由基清除劑后,·OH數(shù)量減少,與水楊酸的反應(yīng)產(chǎn)物減少,吸光度值降低[25]。因此,可以根據(jù)吸光度值降低的程度判斷蔓菁多糖對·OH的清除情況。如圖8所示,隨著蔓菁多糖的濃度增加,·OH的清除率隨之增加,說明蔓菁多糖對·OH的清除能力具有濃度依賴性,當(dāng)蔓菁多糖濃度為2 mg/mL時(shí),對·OH清除率達(dá)到最大為95.78%。蔓菁多糖對·OH清除率的回歸方程為y=23.212lnx+70.412,其R2=0.9078。根據(jù)回歸方程可知蔓菁多糖IC50=0.415 mg/mL,而抗壞血酸IC50=0.883 mg/mL,一般認(rèn)為IC50值小于10 mg/mL,該物質(zhì)具有較好的抗氧化性[26]?？梢娐级嗵菍τ凇H的清除能力大于抗壞血酸對·OH的清除能力,蔓菁多糖具有較強(qiáng)的抗氧化性。

圖8 蔓菁多糖對·OH的清除作用Fig.8 ·OH scavenging activity of polysaccharides from turnip

3 結(jié)論與討論

本研究采用超聲法輔助提取蔓菁中天然多糖成分,并對提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。得到最佳提取工藝:液料比44∶1 (mL/g),提取溫度57 ℃,提取時(shí)間56 min,超聲功率180 W。經(jīng)驗(yàn)證,蔓菁多糖得率的實(shí)際值為65.43%,與模型預(yù)測值偏差較小,說明此優(yōu)化工藝參數(shù)具有實(shí)際參考價(jià)值。王偉等用響應(yīng)面法優(yōu)化新疆蕪菁多糖的提取工藝,確定了提取工藝的最優(yōu)條件:液料比75∶1 (mL/g),提取溫度93 ℃,提取時(shí)間4.3 h,提取次數(shù)3次,多糖得率為23.72%[10]。對比可知,本研究采用超聲輔助提取法在很大程度上減少了液料比、降低了提取溫度、使提取時(shí)間縮短3.4 h、多糖得率大幅度提高。蔡嘯鏑等[14]用超聲輔助法提取恰瑪古多糖,對液料比、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率進(jìn)行優(yōu)化,多糖得率為6.86%。與該研究結(jié)果相差較大,原因可能有三個(gè)方面:一是提取工藝的優(yōu)化參數(shù)不同,有研究表明提取溫度對多糖得率的影響大于乙醇體積分?jǐn)?shù)[27],而本實(shí)驗(yàn)將提取溫度納入到提取工藝的優(yōu)化條件當(dāng)中,顯示提取溫度對多糖得率有重要影響;二是與測定方法有關(guān),本試驗(yàn)采用改進(jìn)的苯酚硫酸法測定溶液中蔓菁多糖的含量,以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品,用精制蔓菁多糖計(jì)算換算因子,減少了單純用葡萄糖濃度來推算蔓菁多糖含量所引起的系統(tǒng)誤差,此外,直接測定提取液中蔓菁多糖含量并計(jì)算多糖得率,比從提取液中通過脫蛋白、脫色素、冷凍干燥后計(jì)算多糖與蔓菁原材料的質(zhì)量之比的方式更為精確,減少了純化過程中造成的多糖損失;三是不同產(chǎn)地的蔓菁多糖含量差別較大[28]。

·OH是體內(nèi)活性最強(qiáng)、毒性最大、半衰期最短的強(qiáng)氧化劑,幾乎可以和體內(nèi)所有分子發(fā)生反應(yīng)[25],因此研究蔓菁多糖對·OH的清除作用對研究其抗氧化性具有指導(dǎo)意義。體外抗氧化試驗(yàn)表明,本研究所采用的新鄉(xiāng)蔓菁提取的多糖對·OH的清除能力較強(qiáng),IC50=0.415 mg/mL。數(shù)據(jù)結(jié)果優(yōu)于張謙筱等所研究的新疆蔓菁多糖對·OH的清除作用,IC50=0.7 mg/mL[29]。因此,新鄉(xiāng)蔓菁多糖具有較好的抗氧化活性,進(jìn)一步增加了其開發(fā)利用的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

綜上所述,本研究通過響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取蔓菁多糖工藝,所得最優(yōu)提取參數(shù)有效可行,有益于蔓菁多糖作為天然抗氧化劑在食品、藥品、化妝品、保健品等領(lǐng)域中的推廣應(yīng)用。