譚春明,王 麟,趙 旺,吳開暢,溫為庚,陳 旭,于 剛,*

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心,海南三亞 572018;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510300;3.北京航空航天大學(xué)青島研究院,北航歌爾微電子研究院,山東青島 266041)

條件致病菌是指在正常情況下并不致病,但在某些特殊條件下(如環(huán)境因子發(fā)生改變或宿主免疫防御機(jī)制受到損害)便可以致病的一些細(xì)菌或真菌。例如給人類身體健康帶來危害的白色假絲酵母,常導(dǎo)致婦科疾病及傷口感染。嗜殺酵母(Killer yeast)是指在其生長繁殖過程中能夠向體外分泌蛋白或者糖蛋白毒素,對(duì)某些微生物產(chǎn)生致命性作用的一類酵母。嗜殺酵母所產(chǎn)的嗜殺因子(或嗜殺毒素)能夠抑制或殺死某些特定的微生物,而這種嗜殺因子對(duì)酵母本身卻沒有嗜殺作用。嗜殺酵母所分泌的嗜殺因子多為蛋白質(zhì)或糖蛋白,對(duì)動(dòng)物或人體是安全、無毒、無害的。居于這一獨(dú)特的生物學(xué)特性,嗜殺酵母常作為工業(yè)生產(chǎn)菌株而被廣泛運(yùn)用于發(fā)酵、食品、農(nóng)業(yè)、養(yǎng)殖、醫(yī)藥等領(lǐng)域[1-2]。嗜殺酵母在發(fā)酵當(dāng)中可以凈化發(fā)酵體系和環(huán)境,提高發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量,提高生物穩(wěn)定性[3-4];在食品工業(yè),可抑制野生酵母的污染[5];在養(yǎng)殖業(yè),一些海洋嗜殺酵母可以控制某些海洋酵母菌引起的海洋動(dòng)物疾病[6]。同時(shí),嗜殺酵母分泌的嗜殺因子可抵制病原酵母及其類酵母等微生物,可作為潛在的抗真菌藥物[7]。目前,國內(nèi)外許多種類的嗜殺酵母被發(fā)現(xiàn)和表征,并被指出具有巨大的應(yīng)用潛力,但大部分因性質(zhì)不穩(wěn)定、抗逆性差而無法進(jìn)行工業(yè)化利用[8]。

本研究室經(jīng)過實(shí)驗(yàn)得到4株能有效控制致病真菌CanidiaalbicansYTS-03且嗜殺活性強(qiáng)的海洋酵母,這些菌株在24 ℃下培養(yǎng)2～3 d其嗜殺因子產(chǎn)量達(dá)最大值,嗜殺作用的適合條件是溫度范圍0～40 ℃和pH范圍3.0～7.0,并且培養(yǎng)基中NaCl濃度對(duì)嗜殺活性影響明顯,鹽度具有增強(qiáng)活性的作用[9-11]。這些條件,使之具有作為工程菌的潛力,可以運(yùn)用于控制人類及動(dòng)植物中病原酵母菌的生長。然而,嗜殺酵母的抗逆性和抗菌能力直接關(guān)系到是否可作為工程酵母菌。為此對(duì)這4株海洋酵母進(jìn)行了耐鹽、耐酸堿、耐高溫等抗逆性及抗菌能力研究,以期篩選出適應(yīng)范圍廣、作用明顯且抗逆性強(qiáng)的嗜殺菌株,為該菌株的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜殺酵母菌株MetschnikowiasaccharicolaDD21-2(GenBank登入號(hào):KY849584)、WickerhamomycesanomalusPA1(GenBank登入號(hào):KY849582)、KluyveromycessiamensisSY3-1A(GenBank登入號(hào):KY928421)和CyberlindneramrakiiWM1(GenBank登入號(hào):KY849583) 均分離篩選于本實(shí)驗(yàn)室,菌株DD21-2分離自丹東的海泥,SY3-1A分離自三亞紅樹林沉積物,而WM1和PA1分離自渤海灣沉積物,用17.5%的甘油溶液保存于-80 ℃冰箱;人類條件致病菌CanidiaalbicansYTS-03 由山東省煙臺(tái)市煙臺(tái)山醫(yī)院婦科提供,分離自陰道內(nèi)分泌物樣品;YPD培養(yǎng)基和嗜殺活性檢測培養(yǎng)基 原料購買于北京索萊寶科技有限公司并按文獻(xiàn)[12]進(jìn)行配制;抗生素 均購買于Sigma公司;產(chǎn)嗜殺因子培養(yǎng)基 酵母粉(1.0%,w/v)、葡萄糖(2.0%,w/v)、蛋白胨(2.0%,w/v)、NaCl(2.0%,w/v)、甘油(15.0%,v/v),用50 mmol/L的檸檬酸-Na2HPO4緩沖溶液調(diào)節(jié)pH5.0,待成分溶解后于115 ℃ 滅菌 30 min;實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

SHP-250 型生化培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;福瑪QYC-211 型搖床 上海知楚儀器有限公司;PHS-3C型pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器有限公司;UV752 型紫外分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 嗜殺酵母菌的活化 挑取保存于-80 ℃冰箱的菌株接種于固體培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)2 d,再取生長好的單菌落接種于YPD液體培養(yǎng)基中,28 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

1.2.2 嗜殺酵母菌抗逆性的測定

1.2.2.1 生長溫度對(duì)嗜殺酵母生長的影響 將活化后的4種供試菌株分別接種50 μL于300 mLYPD液體培養(yǎng)基中,分別在4、12、20、24、28、37、45 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)2～3 d。測定酵母菌數(shù)量,每個(gè)處理均重復(fù)3次,對(duì)照組為接種后未經(jīng)培養(yǎng)的培養(yǎng)液。

1.2.2.2 pH對(duì)嗜殺酵母生長的影響 用50 mmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液分別調(diào)節(jié)YPD液體培養(yǎng)基pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0(NaOH調(diào)節(jié)),將活化后的4種供試菌株分別接種50 μL于300 mL培養(yǎng)基中,置于24 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d,測定酵母菌數(shù)量,每個(gè)處理均重復(fù)3次,對(duì)照組為接種后未經(jīng)培養(yǎng)的培養(yǎng)液。

1.2.2.3 鹽濃度對(duì)嗜殺酵母生長的影響 將活化后的4種供試菌株分別接種50 μL于300 mL含有不同NaCl濃度(0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%和10%)的YPD培養(yǎng)基中,置于24 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d,測定酵母菌數(shù)量,每個(gè)處理均重復(fù)3次,對(duì)照組為接種后未經(jīng)培養(yǎng)的培養(yǎng)液。

1.2.2.4 抗生素對(duì)嗜殺酵母生長的影響 選取放線菌酮、制霉菌素、氟康唑、酮康唑和伊曲康唑5種抗生素,每種抗生素5個(gè)濃度,分別為5、50、100、150和300 μg/mL。將配制好的各濃度抗生素溶液分別加入到高溫滅菌后的YPD培養(yǎng)基中,制成平板,然后將活化后的供試菌株進(jìn)行劃線接種[13]。陽性對(duì)照為培養(yǎng)基不含抗生素的YPD劃線平板,置于24 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察3～4 d,生長記為“+”,不生長記為“-”,每個(gè)處理均重復(fù)3次。

1.2.3 嗜殺酵母菌抗菌性檢測 為了進(jìn)一步驗(yàn)證其抗菌譜,選擇本實(shí)驗(yàn)室菌種資源庫保藏的白假絲酵母(Candidaalbicans)、二尖梅奇酵母(Metschnikowiabicuspidata)、熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)、解脂耶羅維亞酵母(Yarrowialipolytica)、新型假絲酵母(Candidanivariensis)(尿路感染有關(guān))、釀酒酵母(Sacchromycescerevisiae)、大隱求酵母(Cryptococcusmagnus)、阿薩絲孢酵母(Trichosporonasahii)、奧默柯達(dá)酵母(Kodamaeaohmeri)、膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)、光滑假絲酵母(Candidaglabrata)、近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)、金黃色隱球酵母(Cryptococcusaureus)、長孢洛德酵母(Lodderomyceselongisporus)和地霉屬(Geotrichumsp.)作為敏感菌株進(jìn)行檢測。將敏感菌株自斜面接種于YPD 液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)24 h(24 ℃,140 r/min),取2.0 mL菌液5000×g離心5 min,棄上清,菌體用無菌水洗滌3次并懸浮,敏感菌株的細(xì)胞量調(diào)節(jié)至107～108cells/mL。使用前搖勻菌懸液,用滅菌的棉簽沾上并涂布于嗜殺活性檢測培養(yǎng)基平板上,靜置5～10 min,然后用鑷子取無菌的濾紙片(直徑0.6 cm)在嗜殺酵母菌液中浸泡后放置于平板上,靜置2 min,取下濾紙片,將平板移至24 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d,用尺子分別量取抑菌圈和濾紙片上菌落的直徑并記錄[12]。

1.2.4 嗜殺因子嗜殺活性檢測 將4株供試菌接種50 μL于300 mL產(chǎn)嗜殺因子培養(yǎng)基當(dāng)中,24 ℃、140 r/min下培養(yǎng)3 d,用0.45 μm濾膜過濾獲得嗜殺因子清液。按1.2.3的方法制備病原菌YTS-03的菌懸液,使用前搖勻,用滅菌的棉簽沾上并涂布于嗜殺活性檢測培養(yǎng)基平板上,靜置5～10 min,然后按照實(shí)驗(yàn)要求將滅菌的牛津杯(Oxford-cups,6.0 mm×10.0 mm)放置于平板上,取250.0 μL的嗜殺因子清液加入到牛津杯中,將平板移至24 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d,用尺子量取抑菌圈的直徑并記錄[12,15]。

1.2.5 酵母數(shù)量的測定 采用比濁法,根據(jù)菌懸液的濃度在一定范圍內(nèi)與光密度成正比,可以用分光光度計(jì)測600 nm波長處的OD值,用OD值作為待測菌株菌液濃度指標(biāo),其菌液濃度由標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得[9,14]。取樣液按10倍梯度稀釋成不同濃度,測定其OD值并采用平板計(jì)數(shù)法獲取相對(duì)應(yīng)濃度的細(xì)胞數(shù)量,以菌液濃度為橫坐標(biāo)(X),不同濃度發(fā)酵液OD600 nm值為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為Y=0.6677X+0.0202,R2=0.9998。不同發(fā)酵水平的菌液濃度便可通過測定OD600 nm,由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到,ΔX=X培養(yǎng)后-X培養(yǎng)前。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Mean±SD表達(dá),統(tǒng)計(jì)分析利用SPSS 21.0進(jìn)行,方差分析(ANOVA)和Duncan法比較均值間的差異顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長溫度對(duì)嗜殺酵母菌生長的影響

據(jù)文獻(xiàn)[16-17]報(bào)道,大多數(shù)嗜殺酵母菌的最適生長溫度為20～28 ℃,并且多數(shù)海洋嗜殺酵母菌能夠在5 ℃時(shí)生長,只有極少部分菌株能夠在47 ℃下生長。從表1可以看出,溫度對(duì)這4株嗜殺酵母菌株均存在顯著影響(P<0.05),且菌株對(duì)溫度的適應(yīng)范圍較寬,都可以在12～37 ℃環(huán)境中生長,PA1菌株在4 ℃下仍有繁殖能力,但供試菌在45 ℃下培養(yǎng)都不能生長,表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐熱性和很寬的溫度適應(yīng)范圍。嗜殺酵母群落因所處的地理位置、土壤類型、水環(huán)境、污染程度和生物因素不同而呈現(xiàn)出多樣性[18-22]。許多研究結(jié)果表明,嗜殺酵母的生長和繁殖受諸多因素的影響,如培養(yǎng)基組成、溫度、pH及鹽度等。其中,溫度對(duì)嗜殺酵母生長繁殖的影響主要表現(xiàn)在酶活性、細(xì)胞膜流動(dòng)性及物質(zhì)的溶解度三方面[4,8]。

表1 不同溫度對(duì)嗜殺酵母菌株生長的影響Table 1 Effects of temperature on growth of the killer yeast

2.2 不同pH對(duì)嗜殺酵母菌生長的影響

嗜殺酵母菌在生長繁殖過程中對(duì)pH的適應(yīng)范圍較寬,但不同pH對(duì)所產(chǎn)嗜殺因子的活性及穩(wěn)定性會(huì)產(chǎn)生較大影響[4]。從表2結(jié)果可以看出,酸堿度對(duì)這4株嗜殺酵母菌株的生長影響顯著(P<0.05),生長繁殖的pH范圍為3～9,其中PA1和SY3-1A菌株在pH為9的環(huán)境下仍能正常繁殖,而DD21-2和WM1菌株的生長受到較大限制,當(dāng)pH增至10時(shí)這四株嗜殺酵母均不生長。表明,這4株嗜殺酵母同樣具有較強(qiáng)的耐酸堿性,在生長繁殖過程中能夠抵抗環(huán)境pH變化帶來的影響。環(huán)境pH對(duì)酵母菌的影響主要體現(xiàn)在酶活性、細(xì)胞膜的通透性、膜表面電荷和離子化程度。研究指出,嗜殺酵母菌生長繁殖的pH范圍為3～8,其分泌的嗜殺因子的活性在偏酸性環(huán)境下較為穩(wěn)定[8,23]。

表2 不同pH對(duì)嗜殺酵母菌株生長的影響Table 2 Effects of pH on growth of the killer yeast

2.3 不同鹽濃度對(duì)嗜殺酵母菌生長的影響

從表3可以看出,這4株供試菌株都具有較強(qiáng)的耐鹽特性,其中SY3-1A和PA1菌株分別能夠在8%和9%的鹽度下正常生長,DD21-2菌株可以在7%的鹽度下正常繁殖,而WM1菌株卻在4%的鹽度下生長受到較大限制。鹽度對(duì)各菌株的生長均有顯著影響(P<0.05)?？梢?嗜殺酵母菌株都能適應(yīng)高鹽度的生長環(huán)境但耐鹽能力有較大的差異,呈現(xiàn)明顯的多樣性。這可能是海尼和海灣沉積物長期被海水浸泡,從此生態(tài)環(huán)境中獲得的嗜殺酵母具有較強(qiáng)的抗鹽性。而鹽度對(duì)嗜殺酵母生長的影響主要是影響滲透壓和細(xì)胞膜的通透性,同時(shí)影響其所分泌的嗜殺因子的嗜殺活性。許多研究指出,有些酵母的嗜殺因子在無NaCl存在的情況下沒有嗜殺活性,如漢遜酵母Hansenulaanomala,并且該菌株在一定范圍內(nèi)嗜殺活性隨著NaCl濃度的增加而增加[24]。酵母菌株P(guān)ichiamembranifaciens所產(chǎn)生的嗜殺因子其活性與NaCl是否存在有關(guān),但嗜殺酵母的生長卻與NaCl是否存在無關(guān)[25]。嗜殺酵母對(duì)鹽度的耐受性存在差異性,耐鹽性嗜殺酵母常在發(fā)酵領(lǐng)域有較大的作用。

表3 不同鹽度對(duì)嗜殺酵母菌株生長的影響Table 3 Effects of salinity on growth of the killer yeast

2.4 嗜殺酵母菌對(duì)抗生素的抗性

對(duì)所獲得的4株潛在工程酵母菌株進(jìn)行耐藥性的測定,結(jié)果見表4,可以看出嗜殺酵母菌對(duì)抗菌素較為敏感。其中,PA1菌株對(duì)放線菌酮、氟康唑和酮康唑幾乎無抗性,對(duì)5 μg/mL制霉菌素和300 μg/mL的伊曲康唑仍有抗性;而DD21-2菌株除酮康唑外對(duì)其它4種抗菌素均有抗性,不過這種抗性只體現(xiàn)在較低濃度的抗菌素;SY3-1A菌株同樣對(duì)放線菌酮、酮康唑和氟康唑無抗性,僅對(duì)伊曲康唑和5 μg/mL制霉菌素有抗性;WM1菌株對(duì)5 μg/mL的制霉菌素和氟康唑有抗性,對(duì)伊曲康唑呈現(xiàn)出強(qiáng)抗性?？梢?這4株嗜殺酵母對(duì)抗生素敏感,容易被抗生素所抑制。

表4 抗生素對(duì)嗜殺酵母菌株生長的影響Table 4 Effects of antibiotics on growth of the killer yeast

2.5 嗜殺酵母菌抗菌譜的檢測

由表5可知,這4株供試菌均有較寬的殺菌譜,除對(duì)人類條件致病菌Candidaalbicans有強(qiáng)嗜殺活性外,還對(duì)梭子蟹“乳化病”病原菌Metschnikowiabicuspidata和人類條件致病菌Candidatropicalis有很強(qiáng)的嗜殺活性,其抑菌圈直徑和菌落直徑的比例大于2.5。另外,PA1和WM1菌株還能殺死解脂耶羅維亞酵母、金黃色隱球酵母和地霉屬,而且PA1對(duì)釀酒酵母和長孢洛德酵母也有抑制作用,WM1對(duì)光滑假絲酵母有抑制作用。DD21-2菌株和PA1菌株具有相似的殺菌譜,但能殺死近平滑假絲酵母卻對(duì)解脂耶羅維亞酵母和地霉屬無作用。而SY3-1A菌株除對(duì)白色假絲酵母、二尖梅奇酵母和熱帶假絲酵母有較強(qiáng)嗜殺活性外,還對(duì)長孢洛德酵母和膠紅酵母有嗜殺活性。這4株嗜殺酵母在殺菌譜方面表現(xiàn)出差異性和特異性。

表5 嗜殺酵母殺菌譜的檢測Table 5 The killing activity spectra of the killer yeast

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,嗜殺酵母菌株Komagataellaphaffii的嗜殺因子同樣有很寬的抗菌范圍,在釀造條件下能同時(shí)殺死Kloeckera和Hansenula菌屬,被認(rèn)為可作葡萄酒工業(yè)中潛在的抗真菌劑[26]。Wang等[27]也指出,嗜殺酵母菌株WilliopsissaturnusWC91-2和PichiaanomalaYF07b具有較寬的殺菌譜,都能夠作用于膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)等其它6種類型的酵母菌。然而,有些嗜殺酵母菌,只對(duì)某種特定的病原酵母起作用。例如,Buzdar等[28]所研究的KluyveromycessiamensisHN12-1菌株,只能殺死致病酵母MetschnikowiabicuspidataWCY,而對(duì)其他酵母菌株無嗜殺作用。不同的嗜殺酵母菌株表現(xiàn)出不同嗜殺系統(tǒng)和嗜殺特性,對(duì)特殊致病菌有嗜殺活性的酵母菌株,其產(chǎn)生的嗜殺因子能運(yùn)用于自然環(huán)境和醫(yī)藥領(lǐng)域[29-32]。

2.6 嗜殺因子的嗜殺活性

從圖1可以看出,嗜殺因子作用于敏感菌株YTS-03之后,檢測平板上的牛津杯周圍均產(chǎn)生了非常明顯的抑菌圈,說明這4株潛在工程酵母菌的嗜殺因子對(duì)C.albicansYTS-03具有較高的嗜殺活性。PA1、DD21-2、SY3-1A和WM1的菌液抑菌圈直徑分別達(dá)到23.0、14.1、22.3和21.5 mm。嗜殺酵母的嗜殺因子表現(xiàn)出不同的嗜殺活力,跟菌株的多樣性和特異性有關(guān),同種屬的菌株都具有不同的嗜殺能力,如郭風(fēng)君測得的海洋嗜殺酵母WickerhamomycesanomalusYF07b菌株抑菌圈直徑小于本研究中的PA1菌株[33]。

圖1 嗜殺酵母菌株嗜殺因子的抑菌照片F(xiàn)ig.1 Killer activity of the killer yeast strains

3 結(jié)論

從不同地區(qū)獲得的這4株嗜殺酵母菌株,無論是在耐高溫性、耐酸堿性,還是在耐鹽性方面,都表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性。對(duì)溫度和環(huán)境pH的適用范圍較寬,都可以在12～37 ℃及pH3～9的條件下生長繁殖,而且均能夠在高鹽度下正常生長,生長性能上具有一定的工程菌潛力。通過耐藥性實(shí)驗(yàn)表明,嗜殺酵母菌對(duì)抗菌素較為敏感,但對(duì)伊曲康唑和低濃度(5 μg/mL)的制霉菌素或低濃度(5 μg/mL)的氟康唑有抗性,并且不同嗜殺酵母菌株具有不同的抗藥性特征,對(duì)抗生素的敏感性存在差異。而在殺菌譜方面,這4株供試菌均能殺死白色假絲酵母、二尖梅奇酵母和熱帶假絲酵母,而且嗜殺活力很高,并表現(xiàn)出差異性和特異性。PA1和WM1菌株還能殺死解脂耶羅維亞酵母、金黃色隱球酵母和地霉屬;而且PA1對(duì)釀酒酵母和長孢洛德酵母也有抑制作用,WM1對(duì)光滑假絲酵母有抑制作用,DD21-2能殺死近平滑假絲酵母,SY3-1A對(duì)長孢洛德酵母和膠紅酵母有嗜殺活性。嗜殺因子活性的測定表明,這4株潛在工程酵母菌的嗜殺因子對(duì)C.albicansYTS-03具有較高的嗜殺活性,菌株P(guān)A1、DD21-2、SY3-1A和WM1的菌液抑菌圈直徑分別達(dá)到23.0、14.1、22.3和21.5 mm。從以上指標(biāo)可以看出,這4株嗜殺酵母具有作為工程酵母菌的潛力,使開發(fā)抗真菌生物制劑成為可能。

如果能大規(guī)模獲得這種嗜殺因子并作為抗真菌藥制劑來治療白色念珠菌引發(fā)的疾病,將會(huì)帶來巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。為解決當(dāng)前大多抗真菌類藥物價(jià)格昂貴、不安全和引起敏感菌抗藥性增強(qiáng)等問題提供新手段。這4種適應(yīng)范圍廣、作用明顯且抗逆性強(qiáng)的嗜殺菌株,也為進(jìn)一步采用生物技術(shù)改造菌株提供原材料。