陳懷慶,廖興宏,趙 慧,楊俊棋,王文君,張 巖

(遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū)生物工程系,廣東珠海 519041)

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1)普遍存在于生物體中,是多功能含銅氧化酶[1],可以作為酪氨酸羥化酶、多巴氧化酶,是產(chǎn)生黑色素的決定性酶[2],也是引起蔬果褐變的關(guān)鍵酶[3]。其廣泛存在于動植物體內(nèi),其中土豆、蘑菇中含量尤為豐富[4],研究表明從土豆中提取酪氨酸酶,并用分光光度法測定其活性一直是簡便、可行的方式[5-6]。

研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)酪氨酸酶活性可以增加黑色素生成,是目前篩選白癜風(fēng)治療藥物一種方法。從天然植物中尋找酪氨酸酶激活劑是目前研究的熱點(diǎn)[7-9]。植物精油是植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物,主要由小分子化合物組成,氣味芳香易揮發(fā)。研究發(fā)現(xiàn)含有精油的天然藥物配方對白癜風(fēng)模型的動物具有治療效果[10-11]。因此,植物精油在激活酪氨酸酶,治療白癜風(fēng)等疾病方面具有應(yīng)用前景和開發(fā)潛力。但目前關(guān)于植物精油對酪氨酸酶研究多側(cè)重在抑制作用[12-13],涉及精油類型較多如花香類、香草類、柑橘類、辛香類和土香類[14-15],多用于美白護(hù)膚。而植物精油對酪氨酸酶的激活作用的研究較少,只有佛手柑類精油[16]、茶油[17]等簡單幾種。而關(guān)于百里香、茶樹、依蘭精油在抑菌和祛痘方面研究較多[18-19]，對酪氨酸酶活性的研究未見報(bào)道。

目前針對植物精油對酪氨酸酶的激活作用研究較為缺乏的現(xiàn)狀。本課題將研究植物精油對酪氨酸酶的活性影響,尋找天然酪氨酸酶激活劑,為白癜風(fēng)的治療奠定基礎(chǔ)。研究內(nèi)容主要有:優(yōu)化土豆中酪氨酸酶提取工藝與反應(yīng)條件;采用多巴速率氧化法評價(jià)植物精油對酪氨酸酶的活性影響;通過酶動力學(xué)實(shí)驗(yàn)研究植物精油的激活機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮土豆 貴州省甕安縣;L-多巴 上海麥克林生化有限責(zé)任公司;補(bǔ)骨脂素 陜西飛宇生物技術(shù)有限公司;橘子、尤加利、杜松、冬青、桂皮、羅勒、薄荷、歐白芷、茶樹、百里香、桂花、百合、綠化白千層、依蘭、佛手柑植物精油 卡根生物科技有限公司;氫氧化鈉 天津市大茂化學(xué)試劑廠;磷酸氫二鉀 汕頭市光華化學(xué)試劑有限公司;磷酸二氫鉀 天津市大茂化學(xué)試劑廠;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide DMSO) 天津市大茂化學(xué)試劑廠;其余試劑 均為分析純。

UV6200紫外分光光度計(jì) 日本島津公司;JP-1500B粉碎機(jī) 永康市久品工貿(mào)有限公司;Centrifuge 5424R高速冷凍離心機(jī) 德國艾本德公司;KQ-300DE超聲儀 昆明市超聲儀器有限公司;DLSB-10L/20旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;SHHW21.600AⅡ三用電熱恒溫水箱水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 土豆中酪氨酸粗酶的提取條件的確定 取新鮮土豆去皮切成1 cm×1 cm×1 cm塊狀,放置于封口袋中,-20 ℃冷凍,備用[20]。取冷凍土豆10 g,粉碎機(jī)粉碎過60目篩后按照料液比1∶10 (W/V)加入磷酸鹽緩沖液(50 mmoL/L,pH6.8),4 ℃冷凍離心機(jī)4000 r/min離心10 min,上清液即為粗酶。

1.2.1.1 磷酸鹽緩沖液pH的確定 固定料液比為1∶10 (W/V),測定各磷酸鹽緩沖液pH5.8、6.3、6.8、7.3、7.8下酪氨酸酶活力。

1.2.1.2 料液比的確定 磷酸鹽緩沖液pH由1.2.1確定,測定各冷凍土豆與緩沖液的料液比(W/V):1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12下酪氨酸酶活力。

1.2.2 酪氨酸粗酶的反應(yīng)條件的確定 將3.5 mmoL/L的L-多巴1.0 mL、磷酸緩沖液(50 mmoL/L,pH6.8)2.0 mL于試管中35 ℃恒溫預(yù)熱5 min,后加入1.0 mL粗酶混勻,反應(yīng)一段時間后,用紫外分光光度計(jì)測定475 nm處的吸光度[21-22]。每個樣品做三組,每組測三次,取均值。每分鐘多巴色素在475 nm波長吸光度增加0.001為一個酶活力單位,即1 U·min-1。

1.2.2.1 反應(yīng)時間的確定 反應(yīng)溫度35 ℃,底物L(fēng)-多巴/粗酶加入量5∶5,測定反應(yīng)時間:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19 min 下酶活力的變化。

1.3.2 反應(yīng)溫度的確定 反應(yīng)時間由1.3.1確定,底物L(fēng)-多巴/粗酶加入量5∶5,測定各反應(yīng)溫度:25、30、35、40、45 ℃下酶活力的變化。

1.2.2.3 底物L(fēng)-多巴/粗酶加入量的確定 反應(yīng)時間由1.2.2.1確定,反應(yīng)溫度由1.2.2.2確定,測定各底物L(fēng)-多巴/粗酶加入量:1∶5、2∶5、3∶5、4∶5、5∶5、6∶5、7∶5下酶活力的變化。

1.2.3 天然植物精油對酪氨酸酶活性影響

1.2.3.1 最優(yōu)天然植物精油的篩選 采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法,稍作修改[23]。按表1分別加入橘子、尤加利、杜松、冬青、桂皮、羅勒、薄荷、歐白芷、茶樹、百里香、桂花、百合、綠化白千層、依蘭、佛手柑植物精油(C=0.4 mg/mL)、L-多巴溶液(3.5 mmoL/L)、PBS(50 mmoL/L,pH6.8)及DMSO后混勻,35 ℃恒溫預(yù)熱5 min,加入按1.2.1條件下提取酪氨酸粗酶,于35 ℃水浴反應(yīng)15 min,于475 nm處測定吸光度。每個樣品做三組,每組測三次,取均值,計(jì)算激活率。

表1 反應(yīng)液的組成(mL)Table 1 Composition of the reaction solution(mL)

式中:A、B、C、D表示實(shí)驗(yàn)中四只試管的吸光度值。

1.2.3.2 三種植物精油對酪氨酸酶的激活作用 將篩選出來的百里香、茶樹、依蘭精油與陽性對照補(bǔ)骨脂素分別配制成濃度為0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg/mL的溶液,按表1分別加入植物精油或補(bǔ)骨脂素、L-多巴溶液(3.5 mmoL/L)、PBS(50 mmoL/L,pH6.8)及DMSO后混勻,35 ℃恒溫預(yù)熱5 min,加入按1.2.1.2條件下提取酪氨酸粗酶,于35 ℃水浴反應(yīng)15 min,于475 nm處測定吸光度。每個樣品做三組,每組測三次,取均值,計(jì)算各濃度下激活率(同1.2.3.1)。

1.2.4 酶動力學(xué)實(shí)驗(yàn) 固定酪氨酸酶的添加量,選擇不同濃度(0、1.5、3.0 mg/mL)植物精油,進(jìn)行動力學(xué)實(shí)驗(yàn)[24]。 按表2分別加入3.5 mmoL/L L-多巴溶液、PBS(50 mmoL/L,pH6.8)并與不同濃度植物精油(0、1.5、3.0 mg/mL)混勻后,35 ℃預(yù)熱5 min,再加酪氨酸酶在35 ℃反應(yīng)15 min,于475 nm處測定吸光度,通過Lineweaver-Burk圖測定激活類型,以上測試均有兩個以上的單獨(dú)試驗(yàn)并各重復(fù)3次。

表2 酶的動力學(xué)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)液組成(mL)Table 2 The reaction liquid composition of enzyme kinetics experiment(mL)

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 土豆中酪氨酸粗酶的提取條件的確定

2.1.1 磷酸鹽緩沖液pH的確定 如圖1所示,酪氨酸酶活性先減少后增加再減少,酪氨酸酶在pH為6.8時酪氨酸酶活性最高,隨著pH的繼續(xù)增高,酶活性大幅度降低,在pH為7.8時酶活性幾乎喪失。pH是影響酶活性較為常見的因素,研究表明植物蛋白酶最適pH為3～10,大多數(shù)植物酶的最適pH在7左右偏酸性[25],實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示磷酸緩沖液在pH為6.8最為合適。

圖1 pH對酪氨酸酶活性的影響Fig.1 Effect of pH on the activity of tyrosinase注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),圖2～圖5同。

2.1.2 料液比的確定 如圖2所示,冷凍土豆與緩沖液的料液比對酶活性影響為隨著料液比的增加,酶活力呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,當(dāng)料液比在1∶10時,酶活力達(dá)到最大值,繼續(xù)改變料液比酶活力仍會出現(xiàn)增大的現(xiàn)象,但考慮實(shí)際情況,料液比在1∶10最合適。

圖2 料液比對酪氨酸酶活性的影響Fig.2 Effect of material to liquid ratio of tyrosinase activity

2.2 酪氨酸粗酶的反應(yīng)條件的確定

2.2.1 反應(yīng)時間的確定 如圖3所示,酪氨酸酶最適反應(yīng)時間13 min,在此之前酶活力不斷增加,之后酶活力趨于穩(wěn)定。因?yàn)楫?dāng)反應(yīng)13 min左右以后,L-多巴底物與酪氨酸酶幾乎反應(yīng)完全,不再隨時間的增加繼續(xù)反應(yīng),與文獻(xiàn)報(bào)道反應(yīng)時間一致[15,26]。

圖3 反應(yīng)時間對酪氨酸酶活性的影響Fig.3 Effect of reaction time on the activity of tyrosinase

2.2.2 反應(yīng)溫度的確定 如圖4所示,在25～45 ℃反應(yīng)條件對酶活力影響較小,但當(dāng)溫度低于35 ℃隨溫度的增加酶活力增大,高于35 ℃以后不斷減小,酪氨酸酶最適反應(yīng)溫度為35 ℃,且超過45 ℃酶可能會失活[27],因此酪氨酸酶最適反應(yīng)溫度為35 ℃。

圖4 反應(yīng)溫度對酪氨酸酶活性的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on the activity of tyrosinase

2.2.3 底物L(fēng)-多巴/粗酶加入量的確定 如圖5所示,隨著底物L(fēng)-多巴加入量/粗酶加入量比例的增大,酪氨酸酶活性逐漸上升,當(dāng)比例為5∶5時,所測酪氨酸酶活力最大即酪氨酸酶活力峰值,當(dāng)比例繼續(xù)增大時,酶活性開始下降,從節(jié)約成本和高效的角度考慮底物L(fēng)-多巴加入量/粗酶加入量5∶5最合適。

圖5 底物L(fēng)-多巴/粗酶加入量對酪氨酸酶活性的影響Fig.5 Effect of substrate L-dopa/amount of crude enzyme tyrosinase activity

綜上可知,土豆中酪氨酸酶的提取條件為磷酸鹽緩沖液pH6.8、冷凍土豆與緩沖液的料液比1∶10 (g/mL)、反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度35 ℃、反應(yīng)時間13 min、底物L(fēng)-多巴加入量/粗酶加入量5∶5。

2.3 15種植物精油對酪氨酸酶活性影響

2.3.1 最優(yōu)天然植物精油的篩選 篩選了15種天然植物精油(C=0.4 mg/mL)對酪氨酸酶活性的影響,結(jié)果如表3所示。結(jié)果顯示,植物精油可影響酪氨酸酶的活性,編號1～7各精油有抑制作用,編號8～15各精油有激活作用,百里香、茶樹、依蘭精油對酪氨酸酶有顯著的激活作用(P<0.05),因此將對其激活機(jī)理進(jìn)一步研究。

表3 15種天然植物精油對酪氨酸酶活性的影響Table 3 Effect of fifteen natural plant essential oils on tyrosinase activity

2.3.2 三種植物精油對酪氨酸酶的激活作用 由圖6可知,百里香、茶樹、依蘭精油對酪氨酸酶有明顯的激活作用,且呈濃度依賴關(guān)系。表4可知,三種精油的IC50值分別為0.488、0.429、0.480 mg/mL,略低于陽性對照補(bǔ)骨脂素(IC50=0.328 mg/mL)。

表4 植物精油對酪氨酸酶的激活作用Table 4 Activation of tyrosinase by plant essential oils

圖6 三種植物精油對酪氨酸酶的激活作用Fig.6 Activation of tyrosinase by three plant essential oils

2.4 百里香、茶樹、依蘭精油對酪氨酸酶的動力學(xué)分析

為了進(jìn)一步研究百里香、茶樹、依蘭精油對酪氨酸酶的激活機(jī)制,測試了三種不同濃度精油的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線。補(bǔ)骨脂素是一種常見的酪氨酸酶激活劑,為本實(shí)驗(yàn)陽性對照。如圖7所示,隨著百里香精油的濃度不斷增大,Km(米氏常數(shù))不變,Vmax(最大反應(yīng)速度)逐漸減小,根據(jù)Saboury[28]對于激活類型的判斷,百里香精油為非競爭型激活,表明底物L(fēng)-多巴和激活劑與酶同時結(jié)合,兩者沒有競爭作用[12]。

圖7 百里香精油對酪氨酸酶激活作用的動力學(xué)雙倒數(shù)曲線Fig.7 Lineweaver-Burk of tyrosinase activation by thyme oil

如圖8、圖9所示,茶樹、依蘭精油的三條直線相交于第二項(xiàng)限,隨著精油濃度增加,Km逐漸減小,Vmax不斷變小,可判斷這兩種精油為混合型激活,即競爭性激活與非競爭激活同時存在,表明底物L(fēng)-多巴和激活劑與酶同時結(jié)合,激活劑與底物L(fēng)-多巴競爭酶的結(jié)合位點(diǎn)[29]。

圖8 茶樹精油對酪氨酸酶激活作用的動力學(xué)雙倒數(shù)曲線Fig.8 Lineweaver-Burk of tyrosinase activation by tea tree oil

圖9 依蘭精油對酪氨酸酶激活作用的動力學(xué)雙倒數(shù)曲線Fig.9 Lineweaver-Burk of tyrosinase activation by ylang-ylang oil

如圖10所示,補(bǔ)骨脂素相交于第三項(xiàng)限,隨著補(bǔ)骨脂素濃度增加,Km逐漸減小,Vmax不斷變小,可判斷其為混合型激活。相比于陽性對照,三種植物精油對酪氨酸激活略弱,但植物精油含有疏水性化合物,對皮膚具有更高的親和力[30],這對于化妝品或食品工業(yè)可能是重要的,但是還需要深入的研究這三種植物精油的組成成分。

圖10 補(bǔ)骨脂素對酪氨酸酶激活作用的動力學(xué)雙倒數(shù)曲線Fig.10 Lineweaver-Burk of tyrosinase activation by psoralen

3 結(jié)論

從新鮮土豆中提取酪氨酸酶,以L-多巴為底物進(jìn)行單因素分析,確定了酪氨酸酶最適提取條件為磷酸鹽緩沖液pH6.8、冷凍土豆與緩沖液的料液比1∶10 (g/mL)。酪氨酸粗酶的反應(yīng)條件單因素優(yōu)化中確定了最適反應(yīng)溫度35 ℃、反應(yīng)時間13 min、底物L(fēng)-多巴加入量/粗酶加入量5∶5。

篩選了15種植物精油對酪氨酸酶活性影響,發(fā)現(xiàn)百里香、茶樹、依蘭精油對酪氨酸酶有顯著的激活作用,IC50值分別為0.488、0.429、0.480 mg/mL,接近陽性對照補(bǔ)骨脂素0.328 mg/mL。動力學(xué)實(shí)驗(yàn)證明百里香精油為非競爭型激活作用,茶樹、依蘭精油為混合型激活作用。

本實(shí)驗(yàn)證明百里香、茶樹、依蘭精油對酪氨酸酶有較好的激活作用,為新型安全的酪氨酸酶激活劑的開發(fā)利用打下基礎(chǔ),也為植物精油的進(jìn)一步利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。后期將在以下幾個方面進(jìn)一步研究:植物精油是由小分子組成的混合物,化學(xué)成分較為復(fù)雜,哪些成分對精油的激活作用起關(guān)鍵作用,及各成分之間是否有協(xié)同或是拮抗作用,需要進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)只是對精油激活酪氨酸酶的活性及動力學(xué)方面做了研究,若用于治療疾病,還需要進(jìn)行細(xì)胞及動物實(shí)驗(yàn)等藥理方面的研究,進(jìn)一步考察植物精油的有效性和安全性。