鞠璐寧,李銀塔,,*,馬湘君

(1.閩北職業(yè)技術(shù)學(xué)院,福建南平 353011;2.威海海洋職業(yè)學(xué)院,山東榮成 264300)

甜瓜蒂(CucumismeloL.)是葫蘆科黃瓜屬植物甜瓜的果梗,氣微,味苦,性寒,歸脾、胃經(jīng),具有涌吐痰食,除濕退黃等功效[1],主要含有葫蘆素系化合物,還有皂苷、氨基酸及甾醇。甜瓜蒂作為備受關(guān)注的傳統(tǒng)中藥材,自上世紀(jì)50年代甜瓜蒂中發(fā)現(xiàn)葫蘆素,為獲取更多葫蘆素的資源,已有90余種植物被研究,其中我國的黃瓜屬(如:黃瓜、甜瓜)、南瓜屬(如:南瓜、西葫蘆)、西瓜屬(如:藥西瓜)、苦瓜屬(如:苦瓜、木鱉子)、栝樓屬(如:栝樓)等被發(fā)現(xiàn)含葫蘆素類化合物[2]。葫蘆素B和E具有抗癌、保肝、催吐等生物特性,在醫(yī)藥方面具有廣闊的前景。

自葫蘆素類化合物被用于抗癌活性[3-7]研究以來,葫蘆素類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)[8]、含量測定[9-12]、藥理功能[13-15]及醫(yī)學(xué)應(yīng)用[16]均有廣泛報道。但由于易受熱轉(zhuǎn)化成其他物質(zhì)的特性,促使科研工作者開發(fā)葫蘆素的低溫提取技術(shù)。目前,國內(nèi)外有關(guān)葫蘆素的提取技術(shù)主要有溶劑回流提取法[17-19]、超聲波輔助提取法[20-22]、超臨界CO2(SFE-CO2)流體萃取法[23]、色譜提取法和樹脂分離法[24]等。但對葫蘆素的綠色制備研究,僅李悅等[23]研究了SFE-CO2流體萃取葫蘆素B的工藝,未進(jìn)行全面系統(tǒng)的研究甜瓜蒂中葫蘆素的SFE-CO2流體萃取工藝,且存在萃取時壓力大、時間長等缺點,無法準(zhǔn)確反映甜瓜蒂中葫蘆素類化合物的整體提取狀態(tài)。

本研究以萃取率為評價指標(biāo),對甜瓜蒂中葫蘆素類化合物的SFE-CO2流體萃取技術(shù)進(jìn)行研究,以單因素試驗為基礎(chǔ),采用正交試驗設(shè)計研究SFE-CO2流體萃取最佳工藝條件,采用高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)分析萃取物的主要成分,為葫蘆素的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甜瓜蒂 河北保定安國藥源商貿(mào)有限公司;葫蘆素(B、D、E、I)對照品 色譜歸一化法自制,含量均不低于98%;二氧化碳 純度99.9%,食品級,榮成市氧氣廠;甲醇 色譜純,山東禹王實業(yè)有限公司;乙腈 色譜純,美國Fisher Scientific公司;水為重蒸水;其余試劑 均為分析純。

HA121-70-01SFE-CO2流體萃取裝置 江蘇南通華安超臨界萃取有限公司;Agilent1260 infinit高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司;UV-2450型紫外-可見分光光度計 日本島津公司;GB1302電子精密天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;F1-130藥物粉碎機(jī) 中南制藥機(jī)械有限公司;Milli-QAcademic超純水系統(tǒng) 美國默克密理博。

1.2 實驗方法

1.2.1 SFE-CO2流體萃取葫蘆素工藝流程 SFE-CO2流體萃取葫蘆素設(shè)備流程如圖1所示,對應(yīng)葫蘆素提取工藝流程:干甜瓜蒂→除雜粉碎→過篩(60～200目)→裝料→萃取變量設(shè)置→SFE-CO2流體萃取→減壓分離→葫蘆素萃取物。

圖1 SFE-CO2流體萃取葫蘆素的設(shè)備流程圖Fig.1 Equipment flowsheet of supercritical carbon dioxide fluidextraction of cucurbitacin注:1：CO2鋼瓶;2：7過濾器;3,6,12,13,14,15：閥門;4:冷卻器;5:泵;8:加熱器;9:萃取釜;10:分離釜I;11:分離釜II;16:壓力表;17:溫度表;18:流量表。

稱取100 g干燥甜瓜蒂粉,按0.8裝料系數(shù)投入萃取釜中,參考樊紅秀[25]等的方法,以95%乙醇為攜帶劑,選取一定的攜帶劑用量、萃取溫度、萃取時間、萃取壓力、CO2流速和甜瓜蒂粉碎粒度進(jìn)行SFE-CO2流體萃取,減壓分離后得葫蘆素萃取物。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 攜帶劑用量對萃取率的影響 稱取100 g干燥甜瓜蒂粉,甜瓜蒂粒度為60～80目,在1.5 L萃取釜中,SFE-CO2萃取條件設(shè)置為:時間30 min、壓力25 MPa、溫度35 ℃和CO2流速20 kg·h-1,研究攜帶劑用量為50、100、150、200、300、400、500、600 mL時對葫蘆素萃取的影響。

1.2.2.2 萃取溫度對萃取率的影響 稱取100 g干燥甜瓜蒂粉,甜瓜蒂粉粒度為60～80目,以200 mL乙醇作攜帶劑,在1.5 L萃取釜中,SFE-CO2萃取條件設(shè)置為:時間30 min、壓力25 MPa和CO2流速20 kg·h-1,研究萃取溫度為20、25、30、35、40、45、50、60 ℃時對葫蘆素萃取率的影響。

1.2.2.3 萃取壓力對萃取率的影響 稱取100 g干燥甜瓜蒂粉,甜瓜蒂粉粒度為60～80目,以200 mL乙醇作攜帶劑,在1.5 L萃取釜中,SFE-CO2萃取條件設(shè)置為:時間30 min、溫度35 ℃和CO2流速20 kg·h-1,研究萃取壓力為5、10、15、20、25、30、35、40 MPa時對葫蘆素萃取率的影響。

1.2.2.4 萃取時間對萃取率的影響 稱取100 g干燥甜瓜蒂粉,甜瓜蒂粉粒度為60～80目,以200 mL乙醇作攜帶劑,在1.5 L萃取釜中,SFE-CO2萃取條件設(shè)置為:溫度35 ℃、壓力25 MPa和CO2流速20 kg·h-1,研究萃取時間為15、20、25、30、35、40、45、50 min對葫蘆素萃取率的影響。

1.2.2.5 CO2流速對萃取率的影響 稱取100 g干燥甜瓜蒂粉,甜瓜蒂粉粒度為60～80目,以200 mL乙醇作攜帶劑,在1.5 L萃取釜中,SFE-CO2萃取條件設(shè)置為:時間30 min、壓力25 MPa和溫度35 ℃,研究CO2流速為1、5、10、15、20、25、30、35 kg·h-1時對葫蘆素萃取率的影響。

1.2.2.6 原料粒度對萃取率的影響 稱取100 g干燥甜瓜蒂粉,以200 mL乙醇作攜帶劑,在1.5 L萃取釜中,SFE-CO2萃取條件設(shè)置為:溫度35 ℃、時間30 min、壓力25 MPa和CO2流速20 kg·h-1,研究甜瓜蒂粒度為20≤、20～40、40～60、60～80、80～100、100～120、120～160、160～200目時對葫蘆素萃取的影響。

1.2.3 正交試驗 為系統(tǒng)研究SFE-CO2流體萃取中各因素的影響,以單因素試驗為基礎(chǔ)設(shè)計正交試驗。根據(jù)所選正交試驗因素在葫蘆素萃取過程中,是否造成實驗結(jié)果誤差,確定其水平,因為攜帶劑用量、萃取時間、萃取壓力、萃取溫度四個因素變化不會造成葫蘆素萃取數(shù)據(jù)的失真,能有效反映試驗的真實情況,選取單因素最優(yōu)水平選在中間;而CO2流速和原料粒度兩因素,因兩因素自身的變化情況,對試驗工藝效果造成直接誤差,影響葫蘆素萃取率判斷的準(zhǔn)確性,所得數(shù)據(jù)無法真實反映葫蘆素萃取工藝的情況,因此,將CO2流速和原料粒度的單因素最優(yōu)水平選在兩邊,通過如上正交試驗因素的選擇設(shè)置,研究不同因素間的影響力。稱取75份樣品,每份100 g甜瓜蒂原料,置于1.5 L萃取釜中進(jìn)行萃取,得綠色并具有甜瓜香味的液體,經(jīng)脫色、干燥得白色葫蘆素提取物,以萃取率為考察指標(biāo),采用L25(56)正交試驗設(shè)計,因素水平如表1所示。

表1 SFE-CO2流體萃取葫蘆素正交試驗因素與水平表Table 1 Factors and levels table for orthogonal array experimental design of supercritical carbon dioxide fluid extraction of cucurbitacin

1.2.4 萃取物成分分析

1.2.4.1 色譜條件 色譜柱:Hypersil ODS2C18(200 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈(A)-水(B,含2.0%冰醋酸);檢測波長:234 nm;柱溫:25 ℃;流速:1.0 mL·min-1;進(jìn)樣量:20 μL。在如上色譜條件下,檢測萃取物中葫蘆素種類,理論板數(shù)按葫蘆素色譜峰計算應(yīng)不低于3000。

1.2.4.2 萃取物中葫蘆素含量測定 取葫蘆素(B、D、E、I)對照品,用紫外-可見分光光度計進(jìn)行全波長掃描(190～800 nm),得各葫蘆素標(biāo)準(zhǔn)品的最大吸收峰。各葫蘆素的標(biāo)準(zhǔn)品干燥至恒重,取一定量,用甲醇制備成葫蘆素母液,采用梯度稀釋法,選擇吸光度在0.2～0.8的值,以葫蘆素的濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程:葫蘆素B y=0.0362x+0.0093,R2=0.999;葫蘆素D y=0.0306x+0.0042,R2=0.997;葫蘆素E y=0.0401x+0.0052,R2=0.998;葫蘆素I y=0.0492x+0.0012,R2=0.997

將SFE-CO2流體萃取物溶于甲醇,去掉沉淀并取上清液,在各自最大吸收波長,用紫外-可見分光光度計測定吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算萃取物中葫蘆素的含量。

1.2.4.3 萃取率的計算 計算式為:

式中:y為葫蘆素萃取率,%;a為葫蘆素B,mg;b為葫蘆素D,mg;…為葫蘆素E、葫蘆素I等各類葫蘆素,mg;x為原料質(zhì)量,g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗3個平行樣,數(shù)據(jù)采用平均值,利用SPSS 16.0和正交設(shè)計助手IIV3.1進(jìn)行方差分析,并對組間進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 攜帶劑用量的影響 如圖2所示,隨攜帶劑用量的增加,超臨界流體溶解葫蘆素的能力大幅增強(qiáng),當(dāng)攜帶劑用量達(dá)到200 mL時,萃取率基本穩(wěn)定,之后增加攜帶劑用量,萃取率變化無顯著差異(P>0.05)。通常SFE-CO2流體萃取時僅需添加少量攜帶劑即可大幅提高萃取率,然而攜帶劑用量過高時,將延長萃取時間且增加成本,故選擇最佳攜帶劑用量為200 mL。

圖2 攜帶劑用量對葫蘆素萃取率的影響Fig.2 Effect of entrainer amount on the extraction yield of cucurbitacin注:不同小寫字母表示差異顯著,圖3～圖7同。

2.1.2 萃取溫度的影響 由圖3表明,超臨界流體萃取葫蘆素對溫度變化敏感,在35 ℃萃取率達(dá)到最高,40 ℃之后萃取率急速下降,這是由SFE-CO2流體理化性質(zhì)(如黏度)受溫度影響,SFE-CO2流體粘度和密度隨溫度升高而降低,導(dǎo)致超臨界流體與物料的親和度先増后降,從而產(chǎn)生葫蘆素溶解度先増后降。經(jīng)SPSS分析,萃取溫度為35 ℃時葫蘆素萃取率均顯著大于其余溫度(P<0.05),故選擇最佳萃取溫度為35 ℃。

圖3 萃取溫度對葫蘆素萃取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction yield of cucurbitacin

2.1.3 萃取壓力的影響 由圖4可知,在萃取壓力小于10 MPa時葫蘆素萃取率變化無明顯差異,隨萃取壓力增大,萃取率逐漸增加而后在25 MPa達(dá)最大值,之后急劇降低。這是由于萃取壓力可改變超臨界流體的傳質(zhì)特性、粘度和密度,從而引發(fā)萃取率的波動。壓力升高,SFE-CO2流體密度增加,同時減少相對傳質(zhì)阻力和距離,有利于萃取率的增加;然而壓力大于25 MPa后,SFE-CO2流體密度和黏度增加,導(dǎo)致葫蘆素擴(kuò)散系數(shù)減小和傳質(zhì)阻力增大,萃取能力下降。經(jīng)SPSS分析,萃取壓力為25 MPa時對應(yīng)的葫蘆素萃取率與其余壓力的萃取率差異顯著(P<0.05),故選擇最佳萃取壓力為25 MPa。

圖4 萃取壓力對葫蘆素萃取率的影響Fig.4 Effect of extraction pressure on the extraction yield of cucurbitacin

2.1.4 萃取時間的影響 如圖5所示,葫蘆素萃取率隨萃取時間延長而快速增加,在30 min之后明顯減緩并趨于平衡。結(jié)果表明,萃取30 min時葫蘆素萃取基本完全,隨萃取時間的增加,萃取的效價明顯較低。經(jīng)SPSS分析,萃取時間為30 min時對應(yīng)的葫蘆素萃取率與之后任意時間的萃取率無顯著差異(P>0.05)。考慮到萃取時間太長造成的設(shè)備損耗和萃取效率明顯降低,故選擇最佳萃取時間為30 min。

圖5 萃取時間對葫蘆素萃取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the extraction yield of cucurbitacin

2.1.5 CO2流速的影響 如圖6所示,葫蘆素萃取率隨SFE-CO2流速的升高而先增加后降低,且流速在20 kg·h-1時萃取率達(dá)最大值。CO2流速對葫蘆素萃取的影響是相對比較復(fù)雜的一個過程。這是由于CO2流速過大造成分離釜中CO2氣化排空與產(chǎn)物的不能徹底分離,而導(dǎo)致萃取率降低。SPSS分析,CO2流速為20 kg·h-1時對應(yīng)的葫蘆素萃取率最高,故選擇最佳萃取壓力為20 kg·h-1。

圖6 CO2流速對葫蘆素萃取率的影響Fig.6 Effect of CO2 flow rate on the extraction yield of cucurbitacin

從單因素我們不難發(fā)現(xiàn)隨流速逐漸增加,葫蘆素萃取率穩(wěn)步增加,變化穩(wěn)健,在20 kg·h-1時萃取率達(dá)到最大,之后急劇下降。在流速小于20 kg·h-1,萃取物料狀態(tài)變化輕微,有利于葫蘆素萃取,當(dāng)流速大于20 kg·h-1,由于流速大,萃取物料被壓實,或產(chǎn)生明顯溝流,導(dǎo)致物料與二氧化碳?xì)怏w接觸不充分,且粘性增加,均降低萃取率,另外由于流速大,萃取的葫蘆素等物質(zhì),不能在沉淀釜中徹底分離,影響萃取率,這些因素致使萃取率變化無法反應(yīng)真正的葫蘆素提取率,這些狀況產(chǎn)生的誤差,導(dǎo)致試驗結(jié)果缺乏可信度,因此,選擇CO2流速的各個水平值為1、5、10、15、20 kg·h-1,以便獲得穩(wěn)定的、可靠的萃取率數(shù)據(jù)。

2.1.6 原料粒度的影響 如圖7所示,隨著原料粒度的減小,葫蘆素萃取率呈現(xiàn)先揚(yáng)后抑的趨勢。當(dāng)粒度為60～80目時,萃取率達(dá)最大值。結(jié)果表明,超臨界流體與原料粒度直接相關(guān),根據(jù)物質(zhì)傳質(zhì)理論,甜瓜蒂粒度越小,其破損細(xì)胞比例越高,越利于超臨界流體向物料內(nèi)遷移,從而傳質(zhì)效果增強(qiáng)。但原料粒度過小將增加超臨界流體流動阻力,甚至導(dǎo)致溝流現(xiàn)象,反而不利于萃取。經(jīng)SPSS分析,原料粒度為60～80目時,葫蘆素萃取率最高,故選擇最佳原料粒度為60～80目。

圖7 粒度對葫蘆素萃取率的影響Fig.7 Effect of particle size on the extraction yield of cucurbitacin

從圖7我們不難發(fā)現(xiàn)原料粒徑大于60～80目,萃取率隨著粒徑的減小而快速增加,說明二氧化碳流體與原料接觸面積大小,嚴(yán)重影響葫蘆素萃取率,為了更好地反映葫蘆素的萃取規(guī)律,我們選擇原料粒徑小于60～80目,以便降低原料接觸面對萃取率造成的影響,能獲得真實的反映葫蘆素提取規(guī)律的實驗數(shù)據(jù),依次設(shè)置為60～80、80～100、100～120、120～160、160～200 kg·h-1。

2.2 正交實驗

取甜瓜蒂粉,按照 L25(56)正交試驗設(shè)計(表1)的條件,以萃取率為評價指標(biāo)對正交試驗的結(jié)果進(jìn)行分析,結(jié)果見表2和表3。

表2 正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Orthogonal design and results

表3 正交試驗方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test

由見表2中R值的大小可知,各影響因素對SFE-CO2流體萃取葫蘆素的影響主次順序為A>D>C>E>B>F,不難發(fā)現(xiàn),攜帶劑用量的影響最大,其次為萃取時間、萃取壓力、CO2流速、萃取溫度,而原料粒度的影響最小,優(yōu)水平組合為A4B2C3D4E5F1。由表3的方差分析可知,因素A和D對葫蘆素萃取率影響顯著,正交試驗結(jié)果與F比結(jié)果一致,故可確定,利用SFE-CO2流體萃取葫蘆素最佳工藝為:挾帶劑用量200 mL、萃取時間30 min、萃取壓力25 MPa、CO2流速20 kg·h-1、萃取溫度35 ℃、粒度60～80目。在此最佳工藝條件下,取同批次甜瓜蒂分成3份,每份100 g 進(jìn)行超臨界萃取,萃取率分別為1.448%、1.441%、1.439%,平均萃取率1.443%,結(jié)果表明此葫蘆素萃取工藝穩(wěn)定可行。

2.3 HPLC分析

如圖8所示,SFE-CO2流體萃取葫蘆素中共分離出4種葫蘆素成分,分別為葫蘆素B、D、E、I,含量依次為7.83、1.03、3.25、2.38 mg·g-1。其中葫蘆素B含量最為豐富,占總葫蘆素含量的54%以上。這與劉鈺瑩等[2]研究報道的結(jié)果一致。

圖8 甜瓜蒂SFE-CO2流體萃取物的HPLC色譜圖Fig.8 HPLC chromatogram of the extract with supercritical carbon dioxide from Cucumismelo L.

3 結(jié)論

以單因素試驗為基礎(chǔ),利用SPSS 16.0和正交設(shè)計助手IIV3.1軟件,選擇L25(56)正交試驗設(shè)計對SFE-CO2流體萃取葫蘆素工藝進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計。結(jié)果證明,攜帶劑用量、萃取時間對葫蘆素萃取率影響顯著,各影響因素對SFE-CO2流體萃取葫蘆素的影響主次順序為攜帶劑用量>萃取時間>萃取壓力>CO2流速>萃取溫度>原料粒度,利用正交試驗分析與方差分析獲得最優(yōu)工藝條件為:攜帶劑用量200 mL、萃取時間30 min、CO2流速20 kg·h-1、萃取壓力25 MPa、萃取溫度35 ℃、粒度60～80目,在此條件下葫蘆素的萃取率為1.443%。利用HPLC對SFE-CO2流體萃取的葫蘆素進(jìn)行成分分析,確定其主要類型為葫蘆素B、D、E和I,且葫蘆素B含量最高。

從試驗效果可以看出,SFE-CO2流體的最大優(yōu)點是在接近常溫的條件下分離葫蘆素,且成分不發(fā)生變化。再者SFE-CO2技術(shù)作為活性物質(zhì)綠色分離技術(shù),用于提取葫蘆素的工藝是可行的,其用于葫蘆素產(chǎn)品開發(fā)具有廣闊的前景。