覃衛(wèi)娟 黃衛(wèi)彤 葉致齡

【摘要】 目的：對南寧市1 001例聽力正常的孕期女性進(jìn)行耳聾基因檢測，了解本市常見耳聾基因突變類型和攜帶情況，為遺傳咨詢和優(yōu)生優(yōu)育提供數(shù)據(jù)。方法：在知情同意情況下，抽取孕婦外周血提取DNA，用微陣列芯片法檢測GJB2基因c.35delG、c.235delC、c.176dell6和c.299-300delAT位點，GJB3基因c.538C>T位點、SLC26A4基因c.2168A>G和c.IVS7-2A>G位點、線粒體12S rRNA m.1555A>G和m.1494C>T位點。并對GJB2進(jìn)行全基因組測序，以便發(fā)現(xiàn)更多與耳聾相關(guān)的突變位點。結(jié)果：1 001例孕期女性中微陣列芯片法共檢測出18例（1.80%）致病性耳聾基因突變位點，其中GJB2突變c.235delC位點6例（0.60%），c.299-300delAT位點2例（0.20%），c.176dell6和c.35delG位點未檢出突變;GJB3基因突變c.538C>T位點3例（0.30%）;SLC26A4基因突變c.2168A>G位點1例（0.10%），c.IVS7-2A>G位點5例（0.50%）;線粒體12S rRNA檢出m.1555A>G突變1例（0.10%）。GJB2全基因測序發(fā)現(xiàn)318例（31.77%）孕婦攜帶致病性基因突變，常見的致病突變位點：c.109G>A 295例（29.47%）、c.11G>A突變15例（1.50%）、c.-23+1G>A突變7例（0.70%）。結(jié)論：南寧市孕婦GJB2基因突變攜帶最高，其次GJB3、SLC26A4、線粒體12S rRNA，致病性突變位點有GJB2基因：c.109G>A、c.11G>A、c.-23+1G>A、c.235delC和c.299-300delAT;GJB3基因：c.538C>T;SLC26A4：c.2168A>G和c.IVS7-2A>G;線粒體12S rRNA m.1555A>G。因此，孕期女性進(jìn)行耳聾基因篩查，在預(yù)防遺傳性耳聾患兒出生中有重要價值。

【關(guān)鍵詞】 耳聾基因 孕婦 產(chǎn)前篩查

Analysis of the Screening Results of Deafness Genes in Pregnant Women in Nanning/QIN Weijuan， HUANG Weitong， YE Zhiling. //Medical Innovation of China， 2020， 17（04）： 0-080

[Abstract] Objective： The detection of deafness genes in 1001 pregnant women with normal hearing in Nanning City was conducted to understand the mutation types and carrying status of common deafness genes in this city， and provide data for genetic counseling and prenatal and postnatal care. Method： DNA was extracted from the peripheral blood of pregnant women with informed consent. Microarray chip was used to detect the c.35delG， c.235delC， c.176dell6 and c.299-300delAT loci of GJB2 gene， c.538C>T loci of GJB3 gene， c.2168A>G and c.IVS7-2A>G loci of SLC26A4 gene， m.1555A>G and m.1494C>T loci of mitochondrial 12S rRNA. The whole genome of GJB2 was sequenced in order to find more mutation sites associated with deafness. Result： A total of 18 cases （1.80%） of pathogenic deafness mutations were detected by Microarray chip in 1001 pregnant women， Among them， GJB2 gene mutations were found in 6（0.60%） cases at c.235delC site， 2 cases （0.20%） at c.299-300delAT site， and no mutations were found at c.176del6 and c.35delG site; gjb3 gene mutations were found in 3 cases （0.30%） at c.538c > T site; SLC26A4 gene mutations were found in 1 case （0.10%） at c.2168A > G site and 5 cases （0.50%） at c.IVS7-2A> G site; mitochondrial 12SRNA mutations were found in 1 case （0.10%） at m.1555a > G site. GJB2 whole-genome sequencing found that 318 pregnant women （31.77%） carry pathogenic gene mutations. The common pathogenic mutation sites are c.109G>A with 295 cases （29.47%）， c.11G>A with 15 cases （1.50%） and c.-23+1G>A with 7 cases （0.70%）. Conclusion： GJB2 gene mutation is the highest in Nanning pregnant women， followed by GJB3， SLC26A4 and mitochondrial 12S rRNA. Pathogenic mutation sites are GJB2 gene： c.109G>A，c.11G>A， c.-23+1G>A， c.235delC and c.299-300delAT; GJB3 gene： c.538C>T; SLC26A4 ：c.2168A>G and c.IVS7-2A>G; mitochondrial 12S rRNA m.1555A>G. Therefore， the screening of deafness gene in pregnant women is of great value in preventing the birth of hereditary deafness.

[Key words] Deafness gene Pregnant women Prenatal screening

First-authors address： Nanning Maternal and Child Health Hospital， Nanning 530011， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.04.019

目前國內(nèi)外研究已證實50%以上的耳聾人群是遺傳因素導(dǎo)致[1]，與耳聾相關(guān)的遺傳基因有GJB2、JGB6、GJB3、MYO7A、MYO15A、OTOF、SLC26A4等。我國常見的非綜合征型耳聾基因位點是GJB2的c.235delC，c.299-300delAT，c.176del16，c.35delG位點;SLC26A4的c.919-2A>G和c.2168A>G位點;線粒體12S rRNA的m.1555A>G和m.1494C>T位點;GJB3的c.538C>T位點[2]，近5年來國內(nèi)有報道采用基因芯片法對新生兒進(jìn)行GJB2、GJB3、SLC26A4、線粒體12S rRNA篩查，發(fā)現(xiàn)遺傳性耳聾基因攜帶率約為4.7%[3]，尤其是GJB2致病性突變最高，有顯著的種族區(qū)域差異。如果孕期女性進(jìn)行耳聾基因篩查，可以發(fā)現(xiàn)遺傳基因突變位點，可做預(yù)防和早期干預(yù)，能有效地降低耳聾患兒的發(fā)病率。本研究采用微陣列芯片對南寧市1 001例聽力正常的孕期女性進(jìn)行GJB2、GJB3、SLC26A4、線粒體12S rRNA基因9個位點檢測，并對GJB2進(jìn)行全基因測序，旨在了解南寧市孕期女性耳聾基因突變攜帶情況，擴(kuò)大GJB2基因突變位點檢測，以便發(fā)現(xiàn)更多的致病位點，為臨床提供更可靠的預(yù)防和診斷依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2017年6-12月來自南寧市婦幼保健院產(chǎn)前門診的孕期女性。納入標(biāo)準(zhǔn)：孕周7～20周，聽力正常的孕期女性。排除標(biāo)準(zhǔn)：直系親屬有聽力障礙者。本研究遵循醫(yī)學(xué)倫理學(xué)相關(guān)規(guī)定，取得了所有研究對象的知情同意，并得到南寧市婦幼保健院的倫理委員會許可批準(zhǔn)。

1.2 芯片法 采集孕期女性外周血2 mL，提取DNA，檢測濃度及純度。使用微陣列芯片法晶芯九項遺傳性耳聾基因檢測試劑盒（成都博奧生物有限公司）對1 001例孕婦進(jìn)行遺傳性耳聾基因檢測，檢測基因位點：GJB2（c.35delG、c.235delC、c.176dell6和c.299-300delAT），GJB3（c.538C>T），SLC26A4（c.2168A>G、c.IVS7-2A>G），線粒體12S rRNA（m.1555A>G、m.1494C>T）。按照試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增、雜交、洗片、芯片掃描及判讀。

1.3 測序法 使用全基因測序法檢測1 001例孕婦GJB2基因。（1）文庫構(gòu)建，PCR擴(kuò)增根據(jù)樣品量計算需配制的PCR擴(kuò)增體系，選取目的片段擴(kuò)增程序進(jìn)行擴(kuò)增;（2）文庫純化;（3）文庫質(zhì)檢：參照KAPA Library Quantification Kit Illumina? platforms TDS對文庫進(jìn)行定量;（4）測序：將文庫pooling，變性最終以1.8 pM的文庫上機(jī)測序。生物信息學(xué)分析：利用GATK工具判讀SNP和Indel位點;利用Snpeff工具注釋SNP，最后利用dbSNP、千人基因組數(shù)據(jù)庫、HGMD等數(shù)據(jù)庫、clinvar數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋和比較分析。

2 結(jié)果

2.1 芯片法和測序法基因突變情況 （1）1 001例孕期女性中使用基因芯片共檢測出18例（1.80%）耳聾基因突變，均為雜合子。其中GJB2突變c.235delC位點6例（0.60%）、c.299-300delAT位點2例（0.20%），c.176dell6和c.35delG位點未檢出突變;GJB3基因c.538C>T位點突變3例（0.30%）;SLC26A4基因突變c.2168A>G位點1例（0.10%）、c.IVS7-2A>G位點5例（0.50%）;線粒體12S rRNA檢出m.1555A>G突變1例（0.10%），m.1494C>T位點未檢出突變。（2）對GJB2進(jìn)行測序共發(fā)現(xiàn)607例（60.64%）孕期女性攜帶有突變，其中致病性突變318例（31.77%），318例攜帶GJB2致病性突變的孕婦中，c.109G>A位點突變295例，占致病性突變的92.77%。GJB2測序結(jié)果有32種基因型，其中致病性基因型18種，多態(tài)性和未分類基因型有14種。18種致病性基因型中純合子有21例（2.10%）均為c.109G>A突變;雜合子290例（28.97%），分別是：c.109G>A/wt 188例，c.109G>A/wt、c.217C>A/wt 8例，c.109G>A/wt、c.608T>C/wt 30例，c.109G>A/wt、c.79G>A/wt 5例，c.109G>A/wt、c.-121G>A/wt 1例，c.109G>A/wt、c.444C>T/wt 1例，c.109G>A/wt、c.79G>A/wt、c.341A>G/wt 36例，c.109G>A/wt、c.79G>A/wt、c.217C>A/wt 5例，c.11G>A/wt 8例，c.235delC/wt 4例，c.235delC/wt、c.79G>A/wt、c.341A>G/c.341A>G 2例，c.299-300delAT/wt 2例;c.109G>A/wt單雜合子是最常見的基因型共188例（18.78%）;復(fù)合雜合子7例（0.70%），測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)的復(fù)合雜合子7例（0.70%）是c.11G>A和c.-23+1G>A復(fù)合雜合突變，分別是c.11G>A/wt、c.-23+1G>A/wt、c.217C>A/wt基因型5例，c.11G>A/wt、c.-23+1G>A/wt、c.608T>C/wt基因型2例;測序同時還發(fā)現(xiàn)c.11G>A突變雜合子8例（0.79%），c.235delC突變雜合子6例（0.60%），c.299-300delAT突變雜合子2例，c.176dell6和c.35delG突變未檢出，與芯片法檢測結(jié)果一致。GJB2測序結(jié)果中最常見的多態(tài)性基因型是c.79G>A/wt、c.341A>G/wt共99例（9.89%）。見表1。