車逸心 劉雯嫻 徐瑞欣 王 琦 楊冬梅 余 淼 尹 勝*

（1 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 北京工商大學(xué) 北京 100048 2 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心 北京工商大學(xué) 北京 100048 3 北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院 北京 100048 4 中南大學(xué)資源加工與生物工程學(xué)院 長(zhǎng)沙 410083）

甜米酒是我國(guó)傳統(tǒng)的健康酒飲，通常以糯米為原料，通過(guò)根霉和酵母等微生物發(fā)酵制成[1]。在我國(guó)民間，甜米酒種類豐富，其釀造原料、發(fā)酵菌株、釀造工藝等因地區(qū)不同而存在諸多差異，導(dǎo)致其風(fēng)味和感官品質(zhì)有顯著不同。如湖北孝感米酒米散湯清，顏色玉白[2]；而福建紅曲米酒香味獨(dú)特，顏色鮮紅透亮[3]。

甜米酒發(fā)酵過(guò)程中存在著不同種類微生物之間復(fù)雜的相互作用，其中以霉菌、酵母菌和乳酸菌為主[4-6]。微生物的種類和組合比例是米酒風(fēng)格形成的關(guān)鍵。酵母菌是酒釀造的靈魂[7]，是醇類和酯類等物質(zhì)的主要貢獻(xiàn)者，對(duì)酒的品質(zhì)有顯著影響。紅曲霉應(yīng)用于釀酒，在我國(guó)已有一千多年的歷史[8]，在福建、浙江等地均有利用紅曲霉釀造黃酒的歷史?！褒垘r沉缸酒”使用古田紅曲、廈門白曲、藥曲復(fù)合而成的3 種酒曲，使其風(fēng)味帶有紅曲曲香、中草藥香和米酒香；“閩北紅酒”則采用當(dāng)?shù)氐臑跻录t曲釀制，這種酒曲表面青黑，皮張有菌絲，聞起來(lái)鮮香而帶酸味。紅曲菌自身能夠產(chǎn)生豐富酶系，在發(fā)酵過(guò)程中，提供糖化力和酯化能力，增加酒體的風(fēng)味[9]，或者通過(guò)代謝生成醌、酚類等物質(zhì)[10]，豐富酒體的口感。

目前，我國(guó)傳統(tǒng)甜米酒的研究主要集中在優(yōu)勢(shì)菌種分離篩選、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)成分分析和工藝改良等方面，而對(duì)其發(fā)酵過(guò)程中不同種類微生物的相互作用以及特征性風(fēng)味物質(zhì)形成機(jī)理仍未明確。本文利用紫紅曲霉和釀酒酵母以不同比例復(fù)配進(jìn)行甜米酒的發(fā)酵，通過(guò)監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中微生物、理化指標(biāo)、有機(jī)酸和揮發(fā)性成分的種類和含量的動(dòng)態(tài)變化，探究微生物互作對(duì)甜米酒風(fēng)味物質(zhì)形成的影響，建立重要風(fēng)味物質(zhì)與微生物代謝之間的關(guān)聯(lián)，為解析紅曲甜米酒風(fēng)味形成機(jī)理奠定重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

紫紅曲霉RP2 和釀酒酵母G20 由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 原料與試劑

一級(jí)糯米、麥芽購(gòu)于市場(chǎng)；酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（YPD）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；發(fā)酵專用豆粕粉，天津市利發(fā)隆化工科技有限公司；磷酸二氫鉀、硝酸鈉、硫酸鎂、磷酸、硫酸鋅、檸檬酸，西隴化工股份有限公司；乙酸、乳酸，北京化工廠；酒石酸、琥珀酸、亞鐵氰化鉀，上海麥克林股份有限公司；氯化鈉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

數(shù)字電子天平BSA124S-CW，Sartorius 科學(xué)儀器（北京）有限公司；pH 計(jì)，Alalis 公司；超凈工作臺(tái)SW-CJ-1FD，蘇凈安泰公司；全自動(dòng)滅菌鍋，日本TOMY 公司；立式全溫雙層振蕩培養(yǎng)箱HZQ-F100，金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司；高速冷凍離心機(jī)3-18k，德國(guó)Sigma 公司；糖度計(jì)PAL-BX/RI，日本ATAGO 公司；酒精計(jì)LAL2T，昆達(dá)光學(xué)儀器；高效液相色譜儀LC-20A，日本島津公司；氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀TSQ9000，美國(guó)賽默飛公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 菌種培養(yǎng) 配制紅曲霉種子液：糯米粉4%，蛋白胨0.8%，發(fā)酵專用豆粕粉0.5%，磷酸二氫鉀0.2%，硝酸鈉0.2%，硫酸鎂0.1%。將紫紅曲霉RP2 接種于50 mL 種子液中，30 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。

將釀酒酵母G20 接種于50 mL YPD 液體培養(yǎng)基，30 ℃，200 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h。

1.4.2 甜米酒發(fā)酵 將麥芽打碎成粉，過(guò)200 目篩，備用。將200 g 大米和400 mL 超純水混合，浸泡2 h，蒸熟（米粒膨脹、透明無(wú)白芯，不軟爛）；冷卻后加入100 g 麥芽，置于65 ℃恒溫水浴下90 min 并不斷攪拌。設(shè)置5 組不同復(fù)配比的微生物發(fā)酵菌種，酵母添加量為1%（2×107CFU/μL），紫紅曲霉的添加量分別為0，1%，5%，10%，20%（60 CFU/μL）。自然pH 條件下接種，30 ℃，150 r/min恒溫?fù)u床中通氣培養(yǎng)48 h。

1.4.3 樣品制備與理化指標(biāo)檢測(cè) 在發(fā)酵0，12，24，36，48 h 分別取發(fā)酵液，7 500 r/min 離心10 min，分離上清液和沉淀，備用。取1 mL 上清液樣品，用糖度計(jì)和酒精計(jì)分別測(cè)定糖度和酒精度。

1.4.4 微生物計(jì)數(shù) 取1 mL 發(fā)酵液，加入9 mL超純水，充分混勻，制備10 倍稀釋溶液；同理依次制備不同梯度稀釋溶液。取適量各梯度稀釋溶液，涂布于PDA 平板，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.4.5 有機(jī)酸檢測(cè) 取5 mL 發(fā)酵液樣品，加入800 μL 106 g/L 亞鐵氰化鉀溶液和800 μL 300 g/L ZnSO4溶液，充分混勻，8 000 r/min 離心5 min，取上清液，0.22 μm 濾膜過(guò)濾后用于HPLC 分析[11]。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取5 種有機(jī)酸（酒石酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸）標(biāo)準(zhǔn)品，加入超純水溶解，定容至100 mL，配成儲(chǔ)備液（質(zhì)量濃度分別為20.0，100.0，200.0，50.0，4.0 g/L）。將5 種有機(jī)酸儲(chǔ)備液等體積混合稀釋，0.22 μm 濾膜過(guò)濾，制備混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

使用HPLC 進(jìn)行檢測(cè)。色譜柱：Inertsil C18（250 mm×4.6 mm×5 μm）；流 動(dòng) 相：0.01 mol/L KH2PO4水溶液（pH 2.7）；流速：0.5 mL/min；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：215 nm；柱溫：30 ℃；運(yùn)行時(shí)間：40 min；進(jìn)樣量：10 μL。

定性定量分析方法：通過(guò)比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間定性各目標(biāo)物。用外標(biāo)法定量，混合標(biāo)準(zhǔn)樣品和樣品在同一色譜條件下檢測(cè)，繪制濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中有機(jī)酸的含量。

1.4.6 揮發(fā)性成分檢測(cè) 取7 mL 發(fā)酵液樣品，置于20 mL 頂空樣品瓶中，加入2.5 g NaCl，30 ℃超聲處理30 min；利用固相微萃取纖維PDMS 100 μm，萃取富集[12]。

使用氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)。色譜柱：DB-1 毛細(xì)管色譜柱，30 m×0.25 m×0.25 μm。色譜條件：200 ℃脫附進(jìn)樣3 min，無(wú)分流，進(jìn)樣口溫度200℃，柱溫箱起始溫度45 ℃，保留時(shí)間3 min，以5℃/min 升至190 ℃，保留時(shí)間25 min；載氣He，流速1.0 mL/min。質(zhì)譜條件：電離方式EI；電離電壓70 eV；離子源溫度200 ℃；掃描質(zhì)量范圍：35～335 u。

使用NIST 2005 和Wiley 07 MS 數(shù)據(jù)庫(kù)做揮發(fā)性風(fēng)味化合物的鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜米酒發(fā)酵過(guò)程中微生物動(dòng)態(tài)變化

發(fā)酵前期，酵母菌迅速增殖，在12 h 活菌數(shù)達(dá)到峰值，隨后數(shù)量開(kāi)始緩慢減少；而紅曲霉的數(shù)量在發(fā)酵12 h 前、后對(duì)應(yīng)先減少后增加，與酵母菌呈相反的生長(zhǎng)趨勢(shì)（圖1）。兩種微生物對(duì)應(yīng)截然相反的生長(zhǎng)趨勢(shì)可能源于對(duì)環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)成分的競(jìng)爭(zhēng)性利用。值得注意的是，隨著紅曲霉初始添加量的增加，酵母菌活菌總數(shù)不斷增加，在紅曲霉添加量為10%和20%的樣品組中，發(fā)酵12 h 酵母菌數(shù)量達(dá)到4×106CFU/μL 以上，表明紅曲霉的加入顯著促進(jìn)了酵母菌的增殖（圖1b），可能原因是紅曲霉產(chǎn)生的某些代謝產(chǎn)物被酵母菌利用，促進(jìn)其生長(zhǎng)。在同一發(fā)酵體系中，兩種微生物的共培養(yǎng)表現(xiàn)出既有競(jìng)爭(zhēng)又有協(xié)作的動(dòng)態(tài)互作關(guān)系。

2.2 甜米酒發(fā)酵過(guò)程中糖度和酒精度的動(dòng)態(tài)變化

發(fā)酵過(guò)程中，酒樣中糖度不斷降低，酒精度不斷升高；紅曲霉添加量越高，糖度越低，酒精度越高（圖2）。酒樣中糖度和酒精度與微生物變化趨勢(shì)一致，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酵母迅速增殖，不斷消耗糖類物質(zhì)進(jìn)行酒精發(fā)酵；而紅曲霉的添加能夠促進(jìn)酵母數(shù)量的增加，加速糖的消耗和酒精的積累。

圖1 不同接種量的紅曲霉（0～20%）發(fā)酵過(guò)程中紅曲霉（a）和酵母菌（b）數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of Monascus（a）and yeast（b）during fermentations with different inoculation size of Monascus（0-20%）

圖2 不同接種量的紅曲霉（0～20%）發(fā)酵過(guò)程中糖度（a）和酒精度（b）的動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes of sugar degree（a）and alcoholic degree（b）during fermentations with different inoculation size of Monascus（0-20%）

2.3 甜米酒發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸的動(dòng)態(tài)變化

米酒中的主要有機(jī)酸為酒石酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸。發(fā)酵過(guò)程中，甜米酒酒樣中的有機(jī)酸含量和種類不斷增加；發(fā)酵12～36 h 以酒石酸、乳酸、乙酸為主，發(fā)酵48 h 以乙酸、乳酸、檸檬酸為主。與未添加對(duì)照組相比，添加紅曲霉共發(fā)酵的酒樣中有機(jī)酸的整體含量顯著提高，且隨紅曲霉添加量的增加而增加（圖3）；添加20%紅曲霉發(fā)酵48 h 酒樣中有機(jī)酸含量是未添加對(duì)照組的9倍，達(dá)到了90 mg/L（圖3e）。發(fā)酵12～36 h，在未添加紅曲霉對(duì)照組中，乳酸含量達(dá)到了50%以上，而在添加紅曲霉的樣品中，酒石酸含量迅速增加，占主體地位，在36 h 達(dá)到峰值后減少；而乳酸、乙酸和檸檬酸的含量在發(fā)酵12～36 h 較低，發(fā)酵48 h達(dá)到峰值，添加紅曲霉樣品中乙酸含量約為有機(jī)酸總量的50%，4 種有機(jī)酸的峰值含量均隨紅曲霉添加量的增加而增加（圖3）。鑒于紅曲霉的數(shù)量在12～48 h 迅速增加，上述結(jié)果表明紅曲霉對(duì)甜米酒發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸的產(chǎn)生和積累具有重要貢獻(xiàn)。

圖3 不同接種量的紅曲霉（0～20%）發(fā)酵過(guò)程中5 種有機(jī)酸含量的動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes of organic acids content during fermentations with different inoculation size of Monascus（0-20%）

2.4 甜米酒發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性成分的動(dòng)態(tài)變化

米酒酒樣中共檢出47 種揮發(fā)性化合物，包括6 種醇類、14 種酸類、12 種酯類、8 種醚類、4 種醛酮類、2 種醌類和1 種酚類。醇類含量所占比重最高，其次為酯類，而醌類和酚類等所占比重相對(duì)較小。

樣品中檢測(cè)到的醇類主要有：乙醇、香草醇、苯甲醇、正戊醇、異丁醇、丁二醇、苯乙醇。其中香草醇和苯甲醇在發(fā)酵前期含量較多，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，其含量逐漸減少，轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的酯類。苯甲醇能緩慢自然氧化，轉(zhuǎn)化為苯甲醛和芐醚，生成杏仁味[13]；正戊醇具有蘋果白蘭地香氣和辛辣味；苯乙醇具有柔和愉快且持久的玫瑰香氣[13-14]，其在樣品中濃度隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)增加，是后期醇類組分中的主要成分；而異丁醇則會(huì)給酒體帶來(lái)苦味。

樣品中檢測(cè)到的酸類物質(zhì)有4-羥基扁桃酸、十八烷酸、十五烷酸、戊酸等，其中4-羥基扁桃酸是主要成分。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酸類物質(zhì)的種類逐漸增加，而含量逐漸減少。發(fā)酵前期檢測(cè)到十八烷酸、十五烷酸等脂肪酸在發(fā)酵后期不再被檢出，而其對(duì)應(yīng)酯類種類和含量增加，表明了酸類物質(zhì)向酯類的轉(zhuǎn)化。

隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酯類含量呈迅速增加的趨勢(shì)。樣品中共檢測(cè)出12 種酯類，主要有乙酸乙酯、安息香酸芐酯、乳酸乙酯等。乙酸乙酯是發(fā)酵酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)，具有濃烈的水果香氣，使米酒具有蜜香清雅的獨(dú)特風(fēng)格；安息香酸芐酯具有淡而微弱的杏仁味；乳酸乙酯香氣較弱，味微甜，可賦予米酒醇厚感，是米酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)[13，15-17]。

與未添加對(duì)照組相比，添加紅曲霉增加了發(fā)酵酒樣的揮發(fā)性組分的種類和含量（圖4）。在紅曲霉添加量為20%的樣品中，共檢出21 種主要風(fēng)味物質(zhì)，其中酯類有8 種。不同紅曲霉添加量下，不同種類揮發(fā)性組分的相對(duì)含量變化趨勢(shì)基本一致。醇類相對(duì)含量平穩(wěn)增加；酯類在發(fā)酵前12 h快速累積，達(dá)到峰值，而后維持在較高含量，總體相對(duì)含量在揮發(fā)性組分中最高，歸因于紅曲霉較強(qiáng)的酯化能力。揮發(fā)性酸類在前12 h 迅速消耗，而醛酮和酚類在發(fā)酵過(guò)程中一直處于較低含量（圖4）。

圖4 不同接種量的紅曲霉（0～20%）發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性組分含量的動(dòng)態(tài)變化Fig.4 Dynamic changes of volatile components content during fermentations with different inoculation size of Monascus（0-20%）

3 結(jié)論

本文將紫紅曲霉與釀酒酵母以不同比例復(fù)配用于甜米酒發(fā)酵，研究?jī)煞N微生物的動(dòng)態(tài)變化及其對(duì)甜米酒風(fēng)味的影響。結(jié)果表明，以發(fā)酵12 h為分界，酵母菌先增加后減少而紅曲霉則對(duì)應(yīng)先減少后增加；添加紅曲霉能夠顯著促進(jìn)釀酒酵母的增殖，加速糖的消耗和酒精的積累；紅曲霉對(duì)甜米酒發(fā)酵過(guò)程中酒石酸等有機(jī)酸的產(chǎn)生和積累具有重要貢獻(xiàn)，同時(shí)增加了酯類等揮發(fā)性組分的種類和含量，對(duì)甜米酒風(fēng)味的形成產(chǎn)生了重要影響。

4 討論

在甜米酒發(fā)酵體系中，同時(shí)接種的紫紅曲霉和釀酒酵母呈現(xiàn)此消彼長(zhǎng)的競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，而酵母菌的數(shù)量則隨著紅曲霉接種量的增加而顯著增加，表明紅曲霉的代謝可能釋放了某些促酵母增殖因子，這類因子具體是什么物質(zhì)需要深入研究。此外，酵母菌接種量的增加是否能促進(jìn)紅曲霉的增殖也需要進(jìn)一步研究。添加紫紅曲霉可以增加有機(jī)酸和揮發(fā)性組分的種類和含量，對(duì)甜米酒風(fēng)味的豐富具有重要影響。

甜米酒酒樣中檢出的有機(jī)酸主要有酒石酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸。酒石酸是葡萄酒的特征酸，具有特殊風(fēng)味；乳酸能增加酒體的濃厚感，使酒質(zhì)柔和濃醇；琥珀酸呈現(xiàn)鮮味、辣味和特殊的酸味，有調(diào)和酒體的作用；檸檬酸酸味圓潤(rùn)溫和，有水果味；乙酸較強(qiáng)烈，有刺激感，爽口帶甜[15，18]。添加紅曲霉發(fā)酵36 h，酒石酸是主要的有機(jī)酸，而發(fā)酵48 h 后，乙酸是有機(jī)酸的主要組分，高濃度的乙酸會(huì)產(chǎn)生不良風(fēng)味，可通過(guò)控制發(fā)酵時(shí)間來(lái)調(diào)整有機(jī)酸的組成，優(yōu)化甜米酒的風(fēng)味。對(duì)于揮發(fā)性組分，醇類和酯類對(duì)風(fēng)味影響顯著，添加紅曲霉能夠促進(jìn)酵母的增殖而提高醇類的生成量，而紅曲霉自身較強(qiáng)的酯化能力使酒樣中的酯類在發(fā)酵前期迅速積累，并持續(xù)維持在較高水平，對(duì)甜米酒風(fēng)味有積極影響。酒樣中檢出的醚類主要有8 種，包括乙二醇月桂酸醚、2，6-二羥基二苯醚、2-乙酰氨基-1-苯酚醚、1-單亞油酰甘油三醚、二甲醚、4-甲基苯甲酸醚、4-羥基-3-甲氧基芐醇乙醚、3-羥基-4-甲氧基芐基醇醚；然而，醚類在不同條件下含量變化較大，在發(fā)酵過(guò)程中未被持續(xù)檢出，可能與其性質(zhì)不穩(wěn)定或者檢測(cè)方法的靈敏度有關(guān)。