梁秋芳 張 熙 任曉鋒，2* 侯 婷 瞿志超 馮 洛 馬海樂(lè)，2

（1 江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 江蘇鎮(zhèn)江212013 2 江蘇大學(xué)食品物理加工研究院 江蘇鎮(zhèn)江 212013）

β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，簡(jiǎn)稱β-LG）主要是由反芻動(dòng)物乳腺細(xì)胞分泌的一種球狀蛋白，是牛乳清中最為豐富的蛋白質(zhì)，其含量占50%左右[1]。β-LG 除了為機(jī)體提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)以β-LG 為原料酶解得到的多肽具有多種生物功能活性，如抗氧化[2]，降血壓[3]，抗炎[4]和抑菌[5]等。然而，β-LG 具 有兩個(gè)二硫鍵（Cys66-Cys160 和Cys106-Cys199）和一個(gè)自由巰基（Cys121）[6]。當(dāng)β-LG 在加熱或者酶解（尤其是酶解環(huán)境的pH 值為2 或者8）的過(guò)程中，分子間的二硫鍵能夠維持分子的大分子結(jié)構(gòu)，甚至使得蛋白發(fā)生聚集，從而導(dǎo)致蛋白的酶解效率低，活性多肽很難釋放。目前，用于改善β-LG 酶解效率的方法有化學(xué)修飾、高壓、微波、加熱等[7]。

超聲波技術(shù)作為一種新型的物理加工技術(shù)，因無(wú)污染，操作簡(jiǎn)單及易控制等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于食品物理加工中。由于其獨(dú)特的聲空化、機(jī)械效應(yīng)及熱效應(yīng)[8]，因此超聲波可以改變蛋白的分子結(jié)構(gòu)，增加傳熱傳質(zhì)，提高大分子蛋白與酶的接觸頻率，從而改善蛋白的酶解，提高酶解產(chǎn)物的功能活性[9]。例如，Wang 等[10]研究了超聲處理使大豆蛋白的7S 和11S 球蛋白暴露，大豆蛋白酶解多肽的抗氧化活性提高。Jing 等[11]研究發(fā)現(xiàn)在超聲預(yù)處理?xiàng)l件：超聲功率150 W，超聲時(shí)間20 min，超聲溫度50 ℃下，核桃蛋白多肽的DPPH 自由基清除率顯著提高。然而，目前對(duì)于超聲波處理β-LG，酶解制備抗氧化活性多肽的研究非常有限。

本研究中采用掃頻超聲波預(yù)處理β-LG，堿性蛋白酶酶解制備抗氧化活性肽，研究不同的超聲預(yù)處理時(shí)間（10，20，30，60，90 min）對(duì)β-LG 的表觀結(jié)構(gòu)影響，超聲波對(duì)酶解產(chǎn)物的抗氧化活性及氨基酸組成、分子質(zhì)量分布和疏水性的影響，為超聲輔助β-LG 酶解制備抗氧化活性肽提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

乳清蛋白粉，西安裕華生物科技有限公司；堿性蛋白酶Alcalase 2.4L FG（228 000 U/g），諾維信生物技術(shù)有限公司；1，1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl（DPPH）自由基、2，2’-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）（ABTS）自由基，美國(guó)Sigma 公司；FeCl2·4H2O，上海沃凱Ourchem 化學(xué)試劑有限公司；MD75（12 000～14 000 u）透析袋，蘇州達(dá)麥迪生物醫(yī)學(xué)科技有限公司；其余試劑均為分析純級(jí)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 β-LG 的提取 β-LG 的提取參照LEEB等[12]的方法并稍作修改。將乳清蛋白配成質(zhì)量濃度為7 mg/100 mL 的均勻溶液，1∶1 加入質(zhì)量濃度為7 mg/100 mL 的NaCl 溶液，0.5 mol/L 的HCl 調(diào)節(jié)溶液pH 值為2，靜置30 min 后，5 000 r/min 離心20 min，取上清液，4 ℃透析20 h，收集透析袋中的溶液，濃縮冷凍干燥即得β-LG。

1.2.2 β-LG 的掃頻超聲波處理 本研究所使用的掃頻超聲波設(shè)備由江蘇大學(xué)馬海樂(lè)團(tuán)隊(duì)自主研制。超聲的掃頻頻率指超聲的頻率圍繞中心頻率在一個(gè)范圍內(nèi)以一定周期上下波動(dòng)[13]，用（fi±δ）kHz表示（fi為中心頻率，δ 為上下波動(dòng)幅度）。200 mL質(zhì)量濃度為3 mg/mL 的β-LG 密封于超聲袋中，水的體積為5.4 L（30 cm×36 cm×5 cm）進(jìn)行超聲。超聲條件：超聲頻率fi為40 kHz；頻率周期δ 為2 kHz；超聲功率為600 W；掃頻周期為500 s；間歇比為10∶3。超聲時(shí)間為10，20，30，60，90 min。超聲處理后的樣品一部分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冷凍干燥，一部分用于后期的酶解。

1.2.3 β-LG 的酶解 取超聲后的β-LG 溶液，水浴鍋預(yù)熱至50 ℃，0.5 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)溶液pH值至9，加入堿性蛋白酶（17 μL 酶/g 蛋白），酶解40 min，酶解過(guò)程中使用0.1 mol/L NaOH 對(duì)溶液進(jìn)行滴定，使溶液pH 值維持在9。酶解結(jié)束后，沸水浴滅酶10 min，調(diào)節(jié)溶液pH 值至7，冷卻離心，取上清液，濃縮、冷凍干燥。

1.2.4 酶解產(chǎn)物的抗氧化活性

1.2.4.1 DPPH·自由基清除率 2 mL×1 mg/mL 樣品（β-乳球蛋白酶解物）與2 mL×0.2 mmol/L DPPH 乙醇溶液振蕩混勻，在37 ℃下避光反應(yīng)30 min，后于517 nm 處測(cè)量吸光度值，蒸餾水代替樣品作空白。計(jì)算公式為：

式中，Ab——空白吸光度值；As——樣品吸光度值。

1.2.4.2 ABTS 法 將7 mmol/L ABTS 儲(chǔ)備液和2.45 mmol/L 高硫酸鉀混合后，25 ℃下避光靜置12～16 h，形成ABTS+·工作液；使用前用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）稀釋，使工作液在734 mm處吸光值為0.70±0.02。將20 μL×1 mg/mL 樣品與1 980 μL 的ABTS+·振蕩混勻，30 ℃下避光反應(yīng)10 min 后在波長(zhǎng)734 nm 處測(cè)吸光度值。超純水作為空白。用0～3 mmol/L Trolox 替代樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合。計(jì)算公式如下：

式中，Ab——空白吸光度值；As——樣品吸光度值。

1.2.4.3 亞鐵離子絡(luò)合能力 取2 mL×1 mg/mL樣品、0.05 mL×2 mmol/L 的FeCl2溶液和1.85 mL超純水均勻混合，室溫下避光反應(yīng)3 min 后加入0.1 mL×5 mmol/L Ferrozine 溶液，30 ℃下避光反應(yīng)30 min，在波長(zhǎng)562 nm 處測(cè)定反應(yīng)溶液的吸光度值，并以超純水作為對(duì)照。計(jì)算公式為：

式中，Ab——空白吸光度值；As——樣品吸光度值。

1.2.5 酶解產(chǎn)物的表面疏水性（H0）采用Kato等[14]的方法稍作修改，用于測(cè)定β-LG 和其酶解產(chǎn)物的H0。將β-LG 酶解液10 000×g 離心10 min 取上清液，稀釋至質(zhì)量濃度為1.0，0.8，0.6，0.4，0.2 mg/mL，溶劑為0.01 mol/L pH 7 的磷酸鹽緩沖液。取4 mL 樣品，加入8 mmol/L×20 μL ANS，充分混勻，25 ℃下避光反應(yīng)15 min，于激發(fā)波長(zhǎng)370 nm，發(fā)射波長(zhǎng)470 nm 下測(cè)得樣品熒光強(qiáng)度，并將熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白濃度進(jìn)行線性回歸分析，斜率即為表面疏水性H0。

1.2.6 酶解產(chǎn)物的氨基酸組成 采用氨基酸分析儀測(cè)定酶解上清液中的氨基酸組成，將樣品置于酸解管中，加入10 mL×6 mol/L HCl 真空封口，于110 ℃下酸解22 h，冷卻后，過(guò)濾、定容，上機(jī)測(cè)定。采用15%的三氯乙酸沉淀酶解上清液中的多肽后，直接上機(jī)測(cè)定樣品中游離氨基酸的含量?？偘被岷繙p去游離氨基酸的含量即得多肽中的氨基酸組成。

1.2.7 酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布 采用高效液相尺寸排阻色譜法測(cè)定β-LG 酶解液分子質(zhì)量分布。色譜柱：TSKgelG2000；流動(dòng)相的組成：乙腈∶水∶三氟乙酸為45∶5∶0.1；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；洗脫流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫為室溫。采用軟件Breeze（Waters，MA，USA）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。采用以下標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線：牛血清白蛋白（67 000 u）、細(xì)胞色素C（12 500 u）、桿菌肽（1 450 u）、L-色氨酸（204 u）。多肽的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量對(duì)數(shù)之間的關(guān)系的建立參考Zhou 等[15]的方法。根據(jù)分子質(zhì)量大小分成4 個(gè)區(qū)域：大于2 000 u，1 000～2 000 u，200～1 000 u，小于200 u，對(duì)各區(qū)域的色譜峰進(jìn)行積分，相對(duì)峰面積即為樣品各分子質(zhì)量的相對(duì)含量。

1.2.8 平均粒徑 β-LG 樣品配制成1 mg/mL 的溶液后，立刻使用動(dòng)態(tài)光散射粒徑分析儀Malvern Nanosizer ZS（Malvern，Worcestershire，UK）測(cè)量其平均粒徑，測(cè)量溫度為25 ℃。

1.2.9 掃描電鏡（SEM）用雙面膠將超聲處理與未超聲的β-LG 粉末固定在樣品臺(tái)上，并噴上一層金屬導(dǎo)電層，然后采用掃描電鏡在15 kV 的加速電壓下進(jìn)行微觀形態(tài)觀察，放大倍數(shù)為5 000倍。

1.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 試驗(yàn)平行重復(fù)3 次，取平均值，試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS Statistics 17.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，單因素方差分析，采用多重比較的方法進(jìn)行顯著性分析，顯著性水平P＜0.05 表示有顯著性差異。使用Origin 8.0 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲時(shí)間對(duì)β-LG 的平均粒徑的影響

蛋白質(zhì)的粒徑大小間接反映了蛋白的空間結(jié)構(gòu)變化，蛋白的聚集狀態(tài)。圖1 為不同超聲時(shí)間的超聲處理對(duì)β-乳球蛋白平均粒徑的影響。

從圖1 可以看出，超聲處理時(shí)間顯著影響β-LG 的粒徑大小。10 min 的超聲處理使得β-LG 的顆粒粒徑增大，然而20 min 和30 min 的超聲則使得蛋白粒徑減小，且顯著低于對(duì)照組。該結(jié)果表明短時(shí)間（10 min）的超聲處理可能不會(huì)破壞蛋白質(zhì)分子，只是誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子的規(guī)則排序，導(dǎo)致不穩(wěn)定聚集體的形成和粒徑的增加。隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)至20～30 min，粒徑大大減小，并且明顯低于對(duì)照組；這可能是因?yàn)樯鲜霾环€(wěn)定的聚集體在剪切力、微噴射、沖擊波等超聲效應(yīng)的作用下，以較小的蛋白質(zhì)顆粒分散。當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到60～90 min時(shí)，粒徑的變化與20～30 min 的超聲處理結(jié)果相反，小顆粒蛋白重新聚集，其粒徑達(dá)到604 nm（與對(duì)照組相比顯著）。同樣，Jiang 等[16]報(bào)道了超聲處理（450 W，24 min）引起了黑豆分離蛋白形成聚集體。Arzeni 等[17]研究發(fā)現(xiàn)高強(qiáng)度的超聲處理使得雞蛋蛋白的粒徑增加。β-LG 的聚集主要是由于超聲引起的大分子蛋白的非共價(jià)相互作用的變化，如靜電、氫鍵和疏水相互作用等驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)發(fā)生聚集，導(dǎo)致蛋白顆粒粒徑增大。

2.2 超聲時(shí)間對(duì)β-LG 的疏水性的影響

蛋白質(zhì)的表面疏水性（H0）可以表征蛋白分子表面暴露的疏水基團(tuán)的數(shù)量，蛋白分子間的疏水相互作用對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、分子構(gòu)象和功能至關(guān)重要。圖2 為不同超聲時(shí)間的超聲處理對(duì)β-乳球蛋白的表面疏水性的影響。

從圖2 中可以看出，掃頻超聲處理后β-LG表面疏水性增加了1.80%～9.55%。說(shuō)明超聲作用于β-LG，使蛋白分子內(nèi)埋的疏水殘基暴露，酶切位點(diǎn)大量暴露，使得酶解后活性多肽大量釋放，從而酶解液的抗氧化活性大幅度提高。長(zhǎng)時(shí)間的超聲后（60～90 min），β-LG 的表面疏水性有下降的趨勢(shì)，可能是蛋白在疏水作用的驅(qū)動(dòng)下相互靠近，蛋白分子發(fā)生聚集，使得已暴露的疏水基團(tuán)重新包埋于蛋白分子內(nèi)部，從而導(dǎo)致β-LG 疏水性下降。大量研究發(fā)現(xiàn)蛋白的疏水相互作用是蛋白質(zhì)重折疊過(guò)程中出現(xiàn)聚合的主要原因[13，17]。

2.3 超聲時(shí)間對(duì)β-LG 酶解產(chǎn)物的抗氧化活性的影響

圖1 不同超聲時(shí)間的超聲處理對(duì)β-乳球蛋白的平均粒徑的影響Fig.1 Effect of different ultrasound treatment time on the average particle size of β-lactoglobulin

人體在新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生各種各樣的氧化中間產(chǎn)物，如羥基自由基、超氧陰離子、超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶等[18]?；诓煌趸瘷C(jī)理的抗氧化能力檢測(cè)方法也多種多樣，本研究主要應(yīng)用基于電子轉(zhuǎn)移途經(jīng)的DPPH 自由基清除法、ABTS 法和抑制自由基產(chǎn)生的Fe2+絡(luò)合能力法來(lái)評(píng)價(jià)酶解產(chǎn)物的體外抗氧化能力。圖3 為不同超聲時(shí)間的超聲預(yù)處理對(duì)β-乳球蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響。

圖2 不同超聲時(shí)間的超聲處理對(duì)β-乳球蛋白的表面疏水性的影響Fig.2 Effect of different ultrasound treatment time on the surface hydrophobicity of β-lactoglobulin

從圖3 可以看出，超聲時(shí)間對(duì)β-LG 酶解產(chǎn)物的抗氧化活性具有顯著性影響。與對(duì)照組相比，10～90 min 的超聲處理使得酶解產(chǎn)物的DPPH·清除率顯著提高了7.97%～30.28%（P＜0.05）。其中除了超聲60 min，其它時(shí)間的超聲處理的自由基清除率間沒(méi)有顯著差異。對(duì)于ABTS·清除能力，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，TEAC 值呈先增加后減少的趨勢(shì)，其中超聲處理20 min 后，β-LG 酶解產(chǎn)物的TEAC 最大，即ABTS·清除能力達(dá)到最強(qiáng)，與不超聲相比增加了31.90%。體內(nèi)過(guò)渡金屬離子是自由基的另一重要來(lái)源，其通常含有未配對(duì)電子，可催化自由基的形成。對(duì)照組的Fe2+絡(luò)合能力為71.96%，超聲處理后，F(xiàn)e2+絡(luò)合率增加了7.53%～15.76%（P＜0.05）。其中30 min 的超聲處理后，其Fe2+絡(luò)合能力效果最佳，對(duì)比不超聲處理增加了15.76%。綜合3 個(gè)抗氧化的評(píng)價(jià)指標(biāo)，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，其抗氧化活性逐漸增加；在超聲處理時(shí)間為20～30 min 時(shí)，β-LG 酶解物的抗氧化活性最高；當(dāng)超聲時(shí)間延長(zhǎng)到60～90 min 后，其抗氧化活性逐漸下降。

圖3 不同超聲時(shí)間的超聲預(yù)處理對(duì)β-乳球蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響Fig.3 Effect of different ultrasound pretreatment time on the antioxidant activity of β-lactoglobulin hydrolysates

β-LG 酶解物的抗氧化活性取決于酶解產(chǎn)物的組成，如分子質(zhì)量分布、氨基酸組成、疏水性；而不同時(shí)間超聲預(yù)處理引起酶解產(chǎn)物的抗氧化活性的差異間接表明了超聲引起了β-LG 的結(jié)構(gòu)變化差異。因此，一方面研究者研究了不同時(shí)間超聲預(yù)處理引起了酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布、氨基酸組成、疏水性的變化；另一方面研究了不同超聲時(shí)間引起的β-LG 結(jié)構(gòu)變化。

2.4 超聲時(shí)間對(duì)β-LG 酶解產(chǎn)物的疏水性的影響

酶解產(chǎn)物的疏水性（H0）由其疏水性氨基酸的比例、所處位置，以及所含多肽所形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)決定。大量研究表明酶解產(chǎn)物的H0與其抗氧化活性密切相關(guān)[19-20]。圖4 為不同超聲時(shí)間的超聲預(yù)處理對(duì)β-乳球蛋白酶解產(chǎn)物的表面疏水性的影響。

如圖4 所示，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，β-LG 酶解液的疏水性大幅度增加，在10 min 時(shí)達(dá)到最大，隨后開(kāi)始下降，在30 min 達(dá)到最低，隨后開(kāi)始上升。在所有超聲時(shí)間下，其H0顯著高于對(duì)照組。該結(jié)果表明掃頻超聲預(yù)處理有助于β-LG 酶釋放出疏水性的氨基酸和多肽，從而提高了β-LG 的抗氧化活性。孫國(guó)威[21]研究發(fā)現(xiàn)多肽的抗氧化活性與其疏水性呈正相關(guān)，隨著疏水性的增大，大豆肽的抗氧化活性也有一定程度的增加。Cheison 等[22]認(rèn)為疏水性氨基酸越多，多肽的抗氧化活性越強(qiáng)；尤其是Cys、Trp、His、Pro、Tyr、Phe 以及Met 等疏水性氨基酸殘基，能夠促進(jìn)多肽與生物體內(nèi)脂質(zhì)的結(jié)合，從而增強(qiáng)了酶解產(chǎn)物的抗氧化活性。

圖4 不同超聲時(shí)間的超聲預(yù)處理對(duì)β-乳球蛋白酶解產(chǎn)物的表面疏水性的影響Fig.4 Effect of different ultrasound pretreatment time on the surface hydrophobicity of β-lactoglobulin hydrolysates

2.5 超聲時(shí)間對(duì)β-LG 酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布的影響

蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布與生物活性密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)較小分子質(zhì)量多肽比大分子質(zhì)量多肽具有更好的抗氧化活性，多肽的分子質(zhì)量越小，則越容易被人體消化吸收，到達(dá)靶向部位發(fā)揮生物活性[23-24]。表1 為不同超聲時(shí)間的超聲預(yù)處理對(duì)β-乳球蛋白酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布的影響。

表1 不同超聲時(shí)間對(duì)β-乳球蛋白酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布的影響Table 1 Effect of different ultrasound pretreatment time on the molecular weight distribution

從表1 可以看出，掃頻超聲處理大幅度改變了水解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布。超聲處理10～60 min 使得200～1 000 u 和1 000～2 000 u 的多肽組分含量分別增加了2.02%～4.37%，6.98～9.93%；大于2 000 u 多肽含量基本不變；而自由氨基酸的含量大幅度下降。以上結(jié)果表明，10～60 min 的掃頻超聲處理有利于分子質(zhì)量在200～2 000 u 多肽的釋放，從而提高了其酶解產(chǎn)物的抗氧化活性。小分子肽的釋放表明，超聲處理可能引起β-LG 結(jié)構(gòu)的松散，蛋白內(nèi)部的酶切位點(diǎn)大量外露，增加了堿性蛋白酶和酶解部位的接觸幾率。然而，超聲處理90 min 后，200～1 000 u 和1 000～2 000 u 的多肽含量顯著降低；對(duì)應(yīng)的自由氨基酸含量則顯著增加。可能由于超聲時(shí)間達(dá)到90 min 時(shí)，引起了蛋白重新聚集形成大的聚集體（圖1），堿性蛋白酶與蛋白酶解部位的接觸幾率減小，而這與β-LG酶解物的抗氧化活性的研究結(jié)果趨勢(shì)一致；當(dāng)超聲時(shí)間延長(zhǎng)到60～90 min 后，其抗氧化活性逐漸下降（圖2）。Gao 等[25]使用中性酶水解棉籽蛋白后發(fā)現(xiàn)，分子質(zhì)量在800～1 200 u 的組分抗氧化活性最強(qiáng)。Zhu 等[26]研究發(fā)現(xiàn)超聲提高了面筋蛋白水解產(chǎn)物分子質(zhì)量在500～3 000 u 的肽含量，并具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

2.6 超聲時(shí)間對(duì)β-LG 酶解產(chǎn)物中多肽氨基酸組成的影響

β-LG 酶解產(chǎn)物中自由氨基酸對(duì)于功能活性幾乎沒(méi)有貢獻(xiàn)作用，而其中多肽的氨基酸組成決定了多肽的抗氧化活性。因此，研究超聲對(duì)β-LG酶解產(chǎn)物中多肽氨基酸組成。表2 為不同超聲時(shí)間的超聲預(yù)處理對(duì)β-乳球蛋白酶解產(chǎn)物氨基酸組成的影響。

如表2 所示，掃頻超聲改變了酶解產(chǎn)物中多肽中氨基酸含量，尤其是對(duì)多肽的抗氧化活性具有較強(qiáng)貢獻(xiàn)度的Leu、Tyr、Phe 和His[25]，以上氨基酸的含量顯著增加。Cheison 等[22]認(rèn)為含疏水性氨基酸殘基的氨基酸的個(gè)數(shù)越多，多肽和生物體的脂質(zhì)結(jié)合越強(qiáng)，則多肽的抗氧化活性越高。對(duì)多肽中的疏水性氨基酸（HAAs）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，掃頻超聲顯著增加了多肽中的疏水性氨基酸的含量，尤其是超聲60 min 和90 min。從多肽的總氨基酸含量可以看出，掃頻超聲（尤其超聲時(shí)間為30 min和60 min）增加了以多肽形式存在的氨基酸含量，即掃頻超聲增加了酶解產(chǎn)物中的多肽含量，降低了其中的自由氨基酸含量，該結(jié)果和β-LG 酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布中的超聲引起自由氨基酸（即＜200 u 的多肽）比例大幅度下降相互印證。

表2 不同超聲時(shí)間對(duì)β-乳球蛋白酶解產(chǎn)物氨基酸組成的影響Table 2 Effect of different ultrasound pretreatment time on the composition of amino acids

2.7 超聲時(shí)間對(duì)β-LG 的表面微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖5 為不同超聲時(shí)間的超聲處理對(duì)β-乳球蛋白表觀形貌的影響。從圖5 中可以看出在掃描電鏡100 μm 的尺度下，β-LG 呈片狀結(jié)構(gòu)，10 min的超聲處理后，大分子蛋白表面出現(xiàn)了明顯的凸起，β-LG 出現(xiàn)了明顯的裂痕和空洞，蛋白變得更加疏松。隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，在超聲處理時(shí)間為20～30 min 時(shí)，大面積片狀的β-LG 消失，出現(xiàn)了大量的均勻小碎片。β-LG 小碎片的出現(xiàn)可能歸結(jié)于超聲引起的介質(zhì)中氣泡破裂時(shí)形成的局部熱點(diǎn)，以及由微流和沖擊波產(chǎn)生的剪切力[27]。當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到60～90 min 時(shí)，β-LG 碎片四周變得圓滑，碎片之間相互靠攏，連成一片，表明長(zhǎng)時(shí)間的超聲引起松散結(jié)構(gòu)的β-LG 相互聚集，大分子蛋白間距離縮小，重新組裝，形成了新的結(jié)構(gòu)的聚集體。有研究發(fā)現(xiàn)超聲能夠使玉米蛋白[28]、乳蛋白[29]等蛋白結(jié)構(gòu)變得疏松，并減少蛋白顆粒尺寸；也有研究發(fā)現(xiàn)超聲能使牛血清白蛋白[30]、紅豆蛋白[31]等蛋白形成聚集體。蛋白的種類、濃度對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的變化均有很大影響，本研究表明超聲工作參數(shù)對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)具有顯著影響，短時(shí)間的超聲可以使蛋白結(jié)構(gòu)松散，有利于蛋白的酶解，生物活性多肽的釋放；然而，長(zhǎng)時(shí)間超聲處理則使蛋白顆粒變大，蛋白發(fā)生聚集，對(duì)蛋白酶解有阻礙作用。

圖5 不同超聲時(shí)間對(duì)β-乳球蛋白表觀形貌的影響Fig.5 Effect of different ultrasound treatment time on the apparent morphology(scanning electron micrograph)of β-lactoglobulin

3 結(jié)論

不同時(shí)間的掃頻式超聲波預(yù)處理均能顯著提高β-LG 酶解產(chǎn)物的抗氧化活性（P＜0.05），其中超聲處理10～90 min 使得酶解產(chǎn)物的DPPH·清除率顯著提高了7.97%～30.28%（P＜0.05）；Fe2+絡(luò)合率增加了7.53%～15.76%（P＜0.05）。隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，β-LG 酶解產(chǎn)物表面疏水性呈先增加后降低的趨勢(shì)。掃頻超聲處理后β-LG 酶解產(chǎn)物表面疏水性增加了1.80%～9.55%。分子質(zhì)量分布表明，掃頻超聲處理10～60 min 有利于分子質(zhì)量在200～2 000 u 多肽的釋放，從而提高了其酶解產(chǎn)物的抗氧化活性。掃頻超聲波更有利于β-LG 酶解液釋放出更多的抗氧化肽。

β-LG 酶解產(chǎn)物的氨基酸分析研究表明，掃頻超聲波預(yù)處理后產(chǎn)物的疏水性氨基酸含量提高，這些都與酶解產(chǎn)物抗氧化活性的提高有關(guān)。利用掃描電鏡，觀察到掃頻超聲處理后β-LG 出現(xiàn)了明顯的裂痕和空洞，蛋白變得更加疏松。長(zhǎng)時(shí)間的超聲引起了松散結(jié)構(gòu)的β-LG 相互聚集，大分子蛋白間距離縮小，重新組裝，形成了新的結(jié)構(gòu)的聚集體。上述研究結(jié)果為蛋白質(zhì)超聲波加工技術(shù)的開(kāi)發(fā)和設(shè)備的研制提供理論依據(jù)。