屠平光，范雅婷2，黃劍鋒，項 云，樓芳芳，章嘯君

(1.金華市農(nóng)業(yè)科學研究院，浙江 金華 321007； 2.金華廣福醫(yī)院)

卵母細胞體外成熟是胚胎工程和發(fā)育生物學的重要組成部分，是胚胎體外生產(chǎn)上游環(huán)節(jié)，其成熟率的高底和質(zhì)量的優(yōu)劣很大程度上決定了后期的結(jié)果，是體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)以及體細胞核移植生產(chǎn)核移植動物技術(shù)的重要環(huán)節(jié)，因此獲得具有較強發(fā)育能力的卵母細胞是各種后續(xù)相關胚胎生物技術(shù)的前提和關鍵點。目前，體外獲得的卵母細胞無論是成熟還是受精后支持發(fā)育的能力都比體內(nèi)差，說明體外成熟培養(yǎng)環(huán)境還遠未達到體內(nèi)的生理水平[1]。Sun等[2]歸因于培養(yǎng)基缺陷致胞質(zhì)成熟不充分。本實驗通過比較不同培養(yǎng)體系對金華豬卵母細胞的成熟率，建立金華豬卵母細胞比較理想的體外成熟培養(yǎng)體系，為后期開展核移植、體外胚胎構(gòu)建等實驗提供足量、優(yōu)質(zhì)的成熟卵母細胞。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 本試驗中所用試劑除特別指明外,均購自Sigma公司。FSH和LH購自寧波激素廠，豬卵泡液(PFF)、發(fā)情豬血清實驗室自制。體視顯微鏡(Olympus TRPT-4045型)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo 311)；倒置顯微鏡(Olympus-CKX41)；超凈工作臺(蘇州，SW-CJ-IB型)。

1.2金華豬卵巢采集 試驗所用豬卵巢采自金華屠宰場。在豬屠宰后20～30 min內(nèi)取出卵巢，立即無菌采集卵巢，用解剖剪切除子宮及卵巢上多余的脂肪組織后，放入盛有1000 mL含雙抗的滅菌生理鹽水中，初始控制溫度38℃，1 h內(nèi)帶回實驗室。

1.3金華豬卵泡卵母細胞的采集與體外成熟培養(yǎng) 采用抽吸法采集卵母細胞，用滅菌生理鹽水將卵巢清洗3次后，吸干卵巢表面的水珠，用帶有12號針頭的10 mL注射器抽取卵巢表面直徑為3～8 mm卵泡中的卵母細胞。將抽取物緩慢注入35 mm的揀卵皿中，靜置沉淀5～10 min后，于體視鏡下揀取形態(tài)正常，胞質(zhì)均勻，卵外有3～6層顆粒細胞包裹的卵丘-卵母細胞復合體(COCs)，用成熟培養(yǎng)液洗滌3次，然后移入已在CO2培養(yǎng)箱平衡2 h的50 μL的成熟培養(yǎng)微滴中，上蓋石蠟油，每個微滴培養(yǎng)卵母細胞10～20枚。培養(yǎng)條件為38.5℃，100%飽和濕度和5%CO2進行體外成熟培養(yǎng)(IVM)。

1.4試驗設計 卵母細胞體外成熟培養(yǎng)時,按培養(yǎng)液體系的不同分為4組：試驗組1為TCM199基礎培養(yǎng)液；試驗組2為TCM199基礎培養(yǎng)液+10 IU/mL FSH+10 IU/mL LH；試驗組3為TCM199基礎培養(yǎng)液+10 IU/mL FSH+10 IU/mL LH+10% PFF(卵泡液)；試驗組4為TCM199基礎培養(yǎng)液+10 IU/mL FSH+10 IU/mL LH+10% PFF+10%血清(發(fā)情金華豬血清/胎牛血清)；四種培養(yǎng)體系分別進行卵母細胞體外成熟培養(yǎng)，觀察卵母細胞體外成熟情況，以探討不同培養(yǎng)體系對金華豬卵母細胞體外成熟的影響，試驗重復3次。

1.5卵母細胞體外成熟的判斷 卵母細胞成熟培養(yǎng)44 h后，將卵母細胞(COCs)放入含0.1%的透明質(zhì)酸酶的成熟液中3 min，用僅僅比卵母細胞大幾個微米的吸管將卵母細胞反復吸入吹出，以去除卵丘細胞。在實體顯微鏡下觀察第一極體是否存在，以第一極體排出作為卵母細胞成熟的標準。

1.6數(shù)據(jù)分析 用Graphpad Prism 5軟件，對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1培養(yǎng)體系對金華豬卵母細胞體外成熟影響 由表1可見，試驗組4培養(yǎng)體系在金華豬卵母細胞成熟率最高；試驗組2和3之間成熟率差異不顯著(P>0.05)；添加性腺激素的試驗組2、3和4的成熟率顯著高于不添加性腺激素的試驗組1(P<0.05)。

表1 不同培養(yǎng)體系對金華豬卵母細胞

注：同列數(shù)據(jù)肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05),肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

2.2血清對金華豬卵母細胞成熟影響 結(jié)果如表2可知，在成熟液中分別加入10%的發(fā)情金華豬血清，10%的胎牛血清，其它成分相同，COCs在2種成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)后的成熟率分別為76.4±2.1，75.8±1.9，兩組之間卵母細胞的成熟率沒有顯著差異(P<0.05)。

表2 不同類型血清對金華豬卵母細胞成熟影響

注：同列數(shù)據(jù)肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05),肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

3 討論

豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)基種類很多，TCM199是當前應用最廣的基礎培養(yǎng)基之一[3]，大多數(shù)研究者認為在卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)中，添加激素FSH和LH，卵泡液PFF以及血清是常用的成份。Goto[4]等認為，血清中存在激素對卵母細胞的核質(zhì)成熟起重要作用。激素是哺乳動物卵母細胞成熟的重要物質(zhì)，它們在體內(nèi)調(diào)節(jié)卵母細胞成熟的作用機理已比較清楚。目前，在動物卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)體系中，通常使用商業(yè)化的胎牛血清[5]。本試驗在金華豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)體系中，添加發(fā)情金華豬血清同樣能夠提高卵母細胞的體外成熟率，實驗結(jié)果說明胎牛血清和發(fā)情金華豬血清對金華豬卵母細胞的核成熟效果一致，都可起到促進作用。說明在金華豬卵母細胞體外成熟中添加一定量的血清是必需的，相對于其它動物而言，發(fā)情豬血清較容易獲取，一次可采集的量較大，且容易制備，并且發(fā)情金華豬血清在促進金華豬卵母細胞的體外成熟具有同源性，可用自制價錢低廉的發(fā)情金華豬血清代替昂貴的胎牛血清用于豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)體系中。

本實驗共進行了4組不同培養(yǎng)體系試驗，結(jié)果表明，試驗組4采用TCM199作為體外成熟基礎培養(yǎng)液，添加10 IU/mL促卵泡素(FSH)、10 IU/mL促黃體素(LH)、10%卵泡液(PFF)、10%血清，在成熟率上均顯著高于其他試驗組(P<0.05)，但添加10%發(fā)情金華豬血清或10%胎牛血清，在卵母細胞的成熟率方面兩者無顯著差異(P>0.05)。說明FSH、LH、PFF以及血清組合添加應用可以提高金華豬卵母細胞的成熟率。