李石洲 袁耀華 任小冬 陳大慶 雷勝橋 李秋明

(1.廣東粵北華南虎省級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理處，韶關(guān)，512023；2.上海動(dòng)物園；上海，200335；3.蘇州動(dòng)物園，蘇州，215000)

華南虎(Pantheratigrisamoyensis)為中國(guó)特有的虎亞種，野外已多年未發(fā)現(xiàn)其蹤跡，現(xiàn)存華南虎均為20世紀(jì)50—60年代捕獲的6只華南虎的后代[1]。現(xiàn)存華南虎分別飼養(yǎng)于國(guó)內(nèi)各動(dòng)物園和繁育基地，近親繁殖造成的遺傳多樣性缺失已不可避免，母虎的受孕率與幼虎成活率極不穩(wěn)定，且現(xiàn)存活的華南虎中出現(xiàn)疾病多樣化趨勢(shì)。由于華南虎種群小、血液樣品采集困難，華南虎血液方面研究較少，可查資料不多，僅發(fā)現(xiàn)數(shù)篇報(bào)道有關(guān)華南虎血液指標(biāo)。目前可查資料顯示華南虎血常規(guī)指標(biāo)的研究數(shù)據(jù)各有差異，不利于華南虎的疾病診斷和健康狀況評(píng)估。動(dòng)物血液指標(biāo)是反映動(dòng)物機(jī)體狀況的重要指標(biāo)，是動(dòng)物疾病臨床診斷和治療的重要依據(jù)[2]。本研究從國(guó)內(nèi)僅存約160只華南虎中選取部分健康的華南虎作為研究對(duì)象，采集血樣對(duì)華南虎血常規(guī)各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定和分析，形成華南虎血常規(guī)正常參考值范圍，為華南虎飼養(yǎng)管理、疾病防治和保育繁殖等提供科學(xué)參考，幫助華南虎種群健康發(fā)展。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

本項(xiàng)目的研究對(duì)象為華南虎的血液，在全國(guó)人工圈養(yǎng)的華南虎中選擇部分健康華南虎采集血液樣本，血樣標(biāo)本制備時(shí)華南虎為空腹12 h以上。成年虎在舒泰+哆咪靜的復(fù)合麻醉狀態(tài)下從其后肢或尾部靜脈穿刺采血，有小部分樣本是在治療夾籠控制下從尾部靜脈穿刺采血，幼年虎捕捉后強(qiáng)制在其后肢靜脈穿刺采血。檢測(cè)時(shí)血清標(biāo)本清晰，無(wú)溶血現(xiàn)象方為有效樣本。把華南虎血采集在盛有抗凝劑(K3 EDTA或K2 EDTA)真空采血試管中用作血細(xì)胞分析(血常規(guī))。血樣采集后需要輕輕搖勻幾次，使抗凝劑與血液混勻，放置15—20 min，并在15 min到4 h內(nèi)測(cè)試，最佳測(cè)試時(shí)間為30 min到2 h。如需要運(yùn)輸，需在2—8 ℃密封條件下進(jìn)行。由于華南虎為大型食肉類貓科動(dòng)物，血液樣本采集困難，2014—2017年僅采集到36只華南虎血樣，有效樣本30份，無(wú)效樣本6份。經(jīng)檢測(cè)得到血常規(guī)檢測(cè)報(bào)告30份，年齡性別信息見(jiàn)表1。

表1 有效樣本的年齡和性別統(tǒng)計(jì)

Tab.1 Age and gender statistics for valid samples

1.2 研究設(shè)備材料和方法

主要儀器和耗材有：美國(guó)Hemavet 950 FS 獸用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀；配套的試劑盒(Hemavet 950 FS專用試劑包)；真空采血管-抗凝劑(K3 EDTA或K2 EDTA)、一次性采血器；電動(dòng)推剪、刮毛刀等?？紤]到華南虎分布在全國(guó)各地，血液采集后有效保存時(shí)間較短，空運(yùn)受到限制，其他運(yùn)輸方式都無(wú)法確保血樣及時(shí)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。因此，本項(xiàng)目分別在上海動(dòng)物園、廣州動(dòng)物園設(shè)立血液檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。秉著使本次試驗(yàn)的誤差最小化原則，兩家實(shí)驗(yàn)室均使用同一品牌、同一型號(hào)的儀器對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)。該血液細(xì)胞分析儀采用電阻抗法和射頻技術(shù)，具有全自動(dòng)處理和強(qiáng)大的軟件數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)，能確保獲得精確的分析結(jié)果。該設(shè)備采用的聚焦流專利技術(shù)，使鞘液形成渦流，包裹在樣品流周圍，然后使細(xì)胞按直線逐個(gè)通過(guò)記數(shù)孔，有效地避免了計(jì)數(shù)過(guò)程中血細(xì)胞的再次循環(huán)、重疊產(chǎn)生的不正確脈沖，大大提高了記數(shù)的準(zhǔn)確性，保證獲得精確的結(jié)果。

1.3 血常規(guī)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和參考值范圍的計(jì)算方法

應(yīng)用SPSS 20軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。應(yīng)用Kolmogorov-Smirnov對(duì)所有血常規(guī)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，同時(shí)計(jì)算出所有指標(biāo)的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、Kolmogorov-SmirnovZ值、漸近顯著性(雙側(cè))P值等。計(jì)算參考值范圍的方法有多種，其中最基本的有正態(tài)分布法和百分位數(shù)法[3]。表1給出了兩種方法90%、95%、99% 3種概率作為參考區(qū)間的計(jì)算公式[4]。2種方法比較，百分位數(shù)法適合于任何分布類型的資料，故在實(shí)際中最為常用，但由于參考值范圍所涉及的常常是波動(dòng)較大的兩端數(shù)據(jù)，使用百分位數(shù)法必須要有較大的樣本含量，否則結(jié)果很不穩(wěn)定；正態(tài)分布法要求資料必須服從或近似服從正態(tài)分布，優(yōu)點(diǎn)是結(jié)果比較穩(wěn)定，在樣本量不是很大的情況下仍然能夠進(jìn)行處理，缺點(diǎn)是適用范圍較窄，不適合偏態(tài)分布的數(shù)據(jù)資料[4]。

2 結(jié)果

2.1 血常規(guī)各項(xiàng)指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)及正常值范圍

本研究共收集血常規(guī)檢驗(yàn)報(bào)告30份，檢驗(yàn)時(shí)間為2014—2017年。白細(xì)胞和紅細(xì)胞、血紅蛋白、血小板等主要項(xiàng)目的數(shù)據(jù)達(dá)到30個(gè)，具備一定的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜合考量華南虎種群數(shù)量和本次實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況后，認(rèn)為95%的概率范圍能較好地兼顧可信度和精確度，故本文中的醫(yī)學(xué)參考值范圍取95%的概率為正常值參考區(qū)間。華南虎血常規(guī)各項(xiàng)統(tǒng)計(jì)參數(shù)及正常值范圍見(jiàn)表3。

2.2 血常規(guī)指標(biāo)分析

對(duì)血常規(guī)各項(xiàng)指標(biāo)的數(shù)據(jù)分布進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。符合正態(tài)分布項(xiàng)的血常規(guī)指標(biāo)正常參考值范圍采用正態(tài)分布法95%概率的公式計(jì)算(表2)。經(jīng)檢驗(yàn)，血小板計(jì)數(shù)和嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)兩項(xiàng)指標(biāo)不符合正態(tài)分布(P<0.05)，用百分位數(shù)法取95%概率計(jì)算血小板計(jì)數(shù)和嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)的正常參考值范圍(表3)。

表2 醫(yī)學(xué)參考值范圍的正態(tài)分布法和百分位數(shù)法計(jì)算公式[4]

Tab.2 Formulas of normal distribution method and percentile method for calculating the range of medical reference values

注：X^表示均值，S表示標(biāo)準(zhǔn)差，Pm表示第m百分位數(shù)

Note：X^is the mean value，Sis the standard deviation，Pmstands for them-th percentile

表3 華南虎血常規(guī)各項(xiàng)統(tǒng)計(jì)參數(shù)及正常值范圍

Tab.3 Statistical parameters and normal range of blood routine of South China tiger

注：X^表示均值，S表示標(biāo)準(zhǔn)差；**漸近顯著性(雙側(cè))即為正態(tài)性檢驗(yàn)中P值

Note：X^is the mean value，Sis the standard deviation.**The asymptotical significance(both sides)isP

2.3 差異性分析

研究血常規(guī)指標(biāo)，必須進(jìn)行年齡、性別等各種影響因素的差異性分析。我們采用單因素方差分析方法，對(duì)年齡、性別兩組進(jìn)行組間差異顯著性分析。如按性別分組后雌雄比例為13∶17，假設(shè)各項(xiàng)指標(biāo)組間差異不顯著進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，各項(xiàng)血常規(guī)指標(biāo)的差異顯著性均大于0.05，證明假設(shè)成立，即華南虎血常規(guī)雌、雄兩組差異不顯著。按年齡分組，幼齡組與成年組比例為14∶16，假設(shè)各項(xiàng)指標(biāo)組間差異不顯著進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組間檢驗(yàn)各項(xiàng)血常規(guī)指標(biāo)的Sig值均大于0.05，證明假設(shè)成立，即華南虎血常規(guī)幼齡組與成年組差異不顯著。因此，不同性別、年齡間華南虎血常規(guī)各項(xiàng)指標(biāo)差異不顯著。

3 討論

3.1 技術(shù)方法比較

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)虎的血液指標(biāo)研究較少，技術(shù)方法也各有不同。如張錫然等[5]關(guān)于東北虎(Pantheratigrisaltaica)和華南虎血象測(cè)定使用的血球計(jì)數(shù)板和光電比色法，檢測(cè)血常規(guī)指標(biāo)8項(xiàng)；凌明德等[6]關(guān)于華南虎血常規(guī)測(cè)定使用也是血球計(jì)數(shù)板和光電比色法，檢測(cè)血常規(guī)指標(biāo)9項(xiàng)；阿布力孜·阿布力米提等[7]關(guān)于東北虎和孟加拉白虎(Pantheratigristigris)的血常規(guī)指標(biāo)，檢測(cè)項(xiàng)目達(dá)18項(xiàng)。本文使用全自動(dòng)(獸用)血液細(xì)胞分析儀，采用電阻抗法和射頻技術(shù)，本項(xiàng)目檢測(cè)血常規(guī)指標(biāo)共23項(xiàng)，較全面地對(duì)華南虎血常規(guī)指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定。較早期華南虎血常規(guī)的檢驗(yàn)主要依靠手工計(jì)數(shù)等方法，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中存在較多可能產(chǎn)生誤差的步驟，隨著技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)大多數(shù)儀器均能做到全自動(dòng)分析結(jié)果，減少了手工計(jì)數(shù)等可能產(chǎn)生誤差的環(huán)節(jié)，保證了檢驗(yàn)結(jié)果的精確性。

3.2 條件假設(shè)和誤差控制

影響血常規(guī)檢驗(yàn)的主要因素可歸納為人為因素、生理因素、儀器因素、試劑因素等幾個(gè)方面，這些方面分別在檢驗(yàn)的不同階段影響結(jié)果[8]。在華南虎的血常規(guī)檢驗(yàn)中，這些影響因素同樣存在，還有更多影響因素不能忽視。如華南虎難以控制采血，各地飼養(yǎng)條件等不同，可供研究的樣本量極少。所以我們把從外觀、行為等比較正常且無(wú)明顯疾病的華南虎都暫認(rèn)為其是正常的。因此，在影響被研究指標(biāo)主要的可控制因素達(dá)到相同或基本相同就認(rèn)為是同質(zhì)，本文假設(shè)所有參加實(shí)驗(yàn)的華南虎都是在同質(zhì)的條件下進(jìn)行的。在本文所述研究中，通過(guò)人員培訓(xùn)、控制檢測(cè)程序等措施，來(lái)減少各種因素對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的影響。血小板的主要生理功能是參與凝血和止血，表2中血小板的漸近顯著性(雙側(cè))為0.033，不符合正態(tài)分布，且與張錫然等[5]、凌明德等[6]報(bào)道的參數(shù)有一定差別，這種差別產(chǎn)生的原因可能是采血方式、測(cè)定方法、華南虎飼養(yǎng)條件等不同而造成。本文按已得數(shù)據(jù)計(jì)算血小板的正常值范圍，對(duì)血小板的影響因素需要進(jìn)行進(jìn)一步研究。

3.3 華南虎血常規(guī)的比較

由于華南虎血常規(guī)指標(biāo)的研究較少，本文將2篇華南虎血液指標(biāo)相關(guān)論文中的數(shù)據(jù)進(jìn)行部分比較。張錫然等[5]測(cè)定部分項(xiàng)目的均值和范圍分別為白細(xì)胞8.73(5.5—19.0)103/mL、紅細(xì)胞652.30(443—769)104/mL、血小板13.40(6.2—32.0)104/mL、血紅蛋白12.68(11.3—14.0)g/mL，與本文所得結(jié)果有一定的差別，可能是檢測(cè)方法、儀器、華南虎飼養(yǎng)條件等與現(xiàn)在有很大的不同，造成一定的差別。凌銘德等[6]測(cè)定的白細(xì)胞計(jì)數(shù)(5.8—28.2)109/L，其范圍明顯大于本研究的白細(xì)胞計(jì)數(shù)范圍(8.54—23.77)109/L，但其雌性、雄性、幼虎的均值分別為11.75×109/L、11.95×109/L、13.89×109/L，與本文得到的均值12.19×109/L較為接近，其中大部分項(xiàng)目與本文中統(tǒng)計(jì)結(jié)果相近。

3.4 其他虎亞種相關(guān)研究結(jié)果比對(duì)與討論

為研究華南虎與其他虎亞種在血常規(guī)各項(xiàng)指標(biāo)之間有無(wú)差異，本文對(duì)已有的關(guān)于孟加拉虎、東北虎、白虎的血常規(guī)指標(biāo)進(jìn)行了對(duì)比分析。張錫然等[5]測(cè)定東北虎的部分血常規(guī)指標(biāo)的均值和范圍分別為白細(xì)胞8.92(4.0—14.0)103/mL、紅細(xì)胞683.8(530—940)104/mL、血小板15.67(6.2—39.8)104/mL、血紅蛋白12.99(9.5—19.7)g/mL等，與本文所得結(jié)果差別不大。阿布力孜·阿布力米提等[7]測(cè)定東北虎和孟加拉白虎的血常規(guī)各項(xiàng)指標(biāo)的均值和標(biāo)準(zhǔn)差與本文結(jié)果均存在較大差別，可能與該文選取的虎均為幼虎有一定關(guān)系，但其所述范圍均在本文所得正常值范圍內(nèi)。張紅緒等[9]測(cè)定的東北虎幼體白細(xì)胞(16.59±2.74)109/L、紅細(xì)胞(6.82±0.60)1012/L、血紅蛋白(118.92±17.24)g/L、血小板(415.38±71.51)109/L，其白細(xì)胞均值明顯大于本研究的(12.19±3.44)109/L，紅細(xì)胞均值小于本文的(8.08±1.09)1012/L，血紅蛋白均值也明顯小于本文(144.50±21.57)g/L，血小板均值大于本文的(369.83±632.35)109/L。而Shrivatav等[10]報(bào)道孟加拉虎部分血常規(guī)的范圍和平均值為：白細(xì)胞(6.2—11.05)、(8.5±1.49)103/μL，紅細(xì)胞(4.66—9.15)、(7.9±1.42)106/μL；血紅蛋白(7.8—13.8)、(12.8±1.65)g/dL等，其紅細(xì)胞的范圍和平均值與本文結(jié)果近似，但白細(xì)胞、血紅蛋白的均值和范圍都明顯小于本文所得結(jié)果。由此發(fā)現(xiàn)，華南虎與其他虎亞種血常規(guī)的各項(xiàng)指標(biāo)存在一定差別。華南虎血常規(guī)指標(biāo)正常參考值范圍不同于其他虎亞種，建立華南虎血常規(guī)指標(biāo)正常值對(duì)華南虎的飼養(yǎng)管理、疾病診治預(yù)防和保育繁殖研究工作很有必要。

致謝：本文血液檢測(cè)由上海動(dòng)物園和廣州動(dòng)物園完成；上海、廣州、蘇州、南昌動(dòng)物園等提供華南虎血液標(biāo)本；除本項(xiàng)目參加人員外，南昌動(dòng)物園黃薇、韶關(guān)華南虎基地劉力軍等對(duì)本項(xiàng)目給予了大力支持，在此一并感謝。