韓若冰 韓 磊 湯吉偉 趙德睿 李和平

(東北林業(yè)大學(xué)野生動物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱，150040)

鹿茸是雄性鹿科(Cervidae)動物(除馴鹿Rangifertarandus外)特有的能周期性再生的附屬器官[1]，其在快速生長期的細(xì)胞分裂速度是癌細(xì)胞的30多倍[2]?，F(xiàn)已有研究表明梅花鹿(Cervusnippon)鹿茸生長速度可達(dá)到12.5 mm/d[3]，馬鹿(Cervuselaphus)甚至可達(dá)到27.5 mm/d[4]。由于其具有生長速度甚至比癌細(xì)胞快卻不發(fā)生癌變的特點，鹿茸一直以來都是廣大科學(xué)家研究的重點和熱點。鹿茸的生長發(fā)育與再生受到遺傳因素、營養(yǎng)因素、光照、溫度、睪酮等體內(nèi)激素的影響。決定鹿茸發(fā)生及再生的關(guān)鍵組織為鹿茸干細(xì)胞，與此同時，在鹿茸發(fā)生及鹿茸每年的再生過程中，均需要干細(xì)胞微環(huán)境的參與[5]。然而，利用傳統(tǒng)的實驗技術(shù)很難從分子水平上深入探究鹿茸生長發(fā)育的機(jī)理。隨著高通量測序技術(shù)的興起和發(fā)展，越來越多的科學(xué)家試圖運用miRNA在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮的作用來探究鹿茸獨特的生物學(xué)特性(快速生長發(fā)育和周期性再生)，以期為人類癌癥治療甚至是器官再生研究提供新的思路和見解。

microRNA(miRNA)是一類由植物、動物和一些病毒編碼的小分子單鏈非編碼RNA(-22個核苷酸)[6-9]。首次在秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)中被發(fā)現(xiàn)，作為一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，通過與靶mRNA的3′UTR完全或不完全互補(bǔ)配對在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用[10]，已在多種動植物體中廣泛應(yīng)用[11-13]。在鹿茸生物學(xué)領(lǐng)域也有研究表明miRNA可以通過直接或間接的作用調(diào)控鹿茸的生長發(fā)育。本文結(jié)合已有文獻(xiàn)對現(xiàn)有microRNA調(diào)控鹿茸生長發(fā)育的研究進(jìn)行了總結(jié)并且提出展望。

1 miRNA相關(guān)技術(shù)的研究概況

1.1 miRNA芯片技術(shù)的應(yīng)用

對于鹿茸生長發(fā)育的研究主要有直接克隆和RT-PCR法。2004年，利用人類及鼠的特異性寡核苷酸探針的微芯片篩選miRNA的實驗證明miRNA芯片技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和穩(wěn)定性好等特點[14]。miRNA芯片技術(shù)可以用來鑒定動植物體中miRNA的存在及表達(dá)量情況，是檢測不同組織或部位間miRNA表達(dá)的重要方法[14]，運用miRNA芯片技術(shù)來了解miRNA在鹿茸生長發(fā)育中的調(diào)控作用是一種經(jīng)濟(jì)而有效的方法。但現(xiàn)階段關(guān)于miRNA在鹿茸生物學(xué)領(lǐng)域(生長發(fā)育以及周期性再生)的研究報道較少。

1.2 RNA-seq測序技術(shù)的應(yīng)用

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，高通量測序技術(shù)應(yīng)運而生。RNA-seq是新一代高通量測序技術(shù)，運用這種高通量測序技術(shù)可以將組織中的RNA(mRNA，miRNA，lncRNA)全部或部分測出來，反映它們在不同組織或者細(xì)胞之間的表達(dá)水平，并且可以鑒定出組織或者細(xì)胞之間差異性表達(dá)的RNA(mRNA，miRNA，lncRNA)。其中，Small RNA-seq技術(shù)是一種運用高通量測序技術(shù)鑒定動植物體中miRNA表達(dá)量情況的方法。其主要通過測序原始數(shù)據(jù)質(zhì)控、標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)分析、miRNA家族分析、miRNA靶基因預(yù)測和靶基因GO、KEGG富集分析等對組織內(nèi)所有miRNA進(jìn)行測序和表達(dá)定量。從而進(jìn)一步探究其在動植物體中發(fā)揮的調(diào)控作用。隨著small RNA-seq測序技術(shù)的日益發(fā)展，miRNA在鹿茸生長發(fā)育中的研究也取得了一定的突破和進(jìn)展。

2 miRNA在鹿茸中的研究進(jìn)展

2.1 鹿茸組織中miRNA的鑒定

利用miRNA芯片技術(shù)對鹿茸組織中miRNA進(jìn)行鑒定的相關(guān)報道較少。目前主要有對于馬鹿和梅花鹿miRNA的相關(guān)研究，對于其他的鹿科動物還少有涉及。崔東明等[15]對鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞和軟骨細(xì)胞進(jìn)行了miRNA鑒定并進(jìn)行了差異表達(dá)分析。通過培養(yǎng)鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞及軟骨細(xì)胞、制備鹿茸頂端間充質(zhì)及軟骨組織miRNA芯片、芯片雜交及數(shù)據(jù)分析，最終得到鹿茸間充質(zhì)部位的miRNA 289條(117個miRNA表達(dá)上調(diào)，71個miRNA表達(dá)下調(diào))，軟骨部位存在的miRNA 304條(97個miRNA表達(dá)上調(diào)，87個miRNA表達(dá)下調(diào))。其中，軟骨組織和間充質(zhì)組織中差異表達(dá)的miRNA有158條。通過miRNA芯片技術(shù)鑒定鹿茸頂端組織中的miRNA為將來miRNA在鹿茸生長發(fā)育中的研究提供了重要的數(shù)據(jù)參考基礎(chǔ)。

Chen等[16]鑒定了馬鹿軟骨組織中保守的miRNA和新的miRNA。最終在馬鹿軟骨組織中鑒定出399個miRNA，其中345個為高度保守的miRNA，54個為鹿茸軟骨組織特有的miRNA，為馬鹿鹿茸的生物學(xué)研究以及再生鹿茸軟骨組織中miRNA的研究提供了參考。Ba等[17]通過高通量測序技術(shù)對梅花鹿增茸期和休眠期的骨膜干細(xì)胞進(jìn)行miRNA測序，鑒定得到2個時期的差異表達(dá)miRNA，其中8個miRNA表達(dá)顯著下調(diào)，6個miRNA表達(dá)顯著上調(diào)。鑒定出20種保守的鹿茸特有的miRNA。通過對靶基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，結(jié)果表明Wnt、MAPK和TGF-beta信號通路可能是鹿茸再生過程中必不可少的信號通路，但是這些信號通路在鹿茸再生的過程中如何發(fā)揮調(diào)控作用需要進(jìn)一步的實驗來證明。

2.2 miRNA對生長因子的調(diào)控作用

多種生長因子及其受體在鹿茸的生長發(fā)育過程中均發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。如：表皮生長因子(EGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等。隨著后續(xù)研究的深入，對于這幾種生長因子在鹿茸生長發(fā)育過程中的功能以及在鹿茸頂端組織中的表達(dá)量情況已有相關(guān)研究。目前miRNA對VEGF、TGF、IGF發(fā)揮的調(diào)控作用以及對鹿茸細(xì)胞增殖產(chǎn)生的影響也開展了相關(guān)研究。

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)主要存在于鹿茸頂端組織的前成軟骨層及軟骨層，并且對于鹿茸軟骨內(nèi)血管的形成具有一定的作用[18]。李璐[19]通過實驗證實VEGF是miRNA-93-5P與miRNA-20b-5p調(diào)控的靶基因，轉(zhuǎn)染實驗證明miRNA-93-5P與miRNA-20b-5p的過表達(dá)能抑制鹿茸軟骨細(xì)胞的正常生長發(fā)育。還證明了梅花鹿軟骨細(xì)胞中VEGF的表達(dá)與bFGF、IGF的表達(dá)存在一定的關(guān)聯(lián)性。這些生長因子之間可能存在著某種相互作用，從而共同調(diào)節(jié)著梅花鹿鹿茸的生長發(fā)育。然而生長因子如何通過相互作用來調(diào)節(jié)鹿茸生長發(fā)育還尚未被揭示。另有研究表明miRNA-15a和miRNA-15b是鹿茸VEGFR的新調(diào)控因子[20]，它們抑制鹿茸軟骨細(xì)胞的增殖。TGF-B是一類多功能的生長因子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化等方面具有一定的作用[21]。鹿茸頂端組織的5個層中均具有TGF-B1的表達(dá)，但其表達(dá)量不盡相同。TGF-B可與Wnt信號通路共同作用使細(xì)胞維持在間充質(zhì)細(xì)胞的狀態(tài)。韓香玉[21]通過Hiseq深度測序、qPCR和雙熒光素酶活性檢測證實了miRNA-148a-3p靶向調(diào)控TGF-B2基因，同時，利用MTT法表明miRNA-148a-3p對鹿茸軟骨細(xì)胞體外增殖活性有一定的抑制作用。轉(zhuǎn)染miRNA-148a-3p后TGF-B2、TGF-βRⅡ和IGF-1蛋白的表達(dá)水平有所下降，證明這三者之間存在一定的關(guān)聯(lián)性。這也印證了李璐[19]的實驗，說明不同的生長因子之間可能存在著某種聯(lián)系，它們共同作用調(diào)節(jié)鹿茸的生長發(fā)育。

2.3 miRNA對鹿茸細(xì)胞增殖的作用

隨著高通量測序技術(shù)的迅速發(fā)展，應(yīng)用small RNA-seq技術(shù)對鹿茸生長發(fā)育進(jìn)行的研究越來越多。Yao等[22]分析了鹿茸生長發(fā)育過程中miRNA的表達(dá)量，其中12個基因在鹿茸的快速生長期表達(dá)量顯著升高(Fn1，Sox9，Col2a1，Acan，Col9a1，Col11a1，Hapln1，Wwp2，F(xiàn)gfr3，Comp，Sp7 和 Ihh)，該研究還發(fā)現(xiàn)了一些miRNA和基因共同作用參與了軟骨形成和軟骨內(nèi)成骨的過程。比如：miR-3072-5p，miR-1600，miR-34-5p，miR-6889-5p和 miR-6729-5p。最終通過比較鹿茸生長中心的快速生長期和初期生長期，構(gòu)建了miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。對于將來鹿茸發(fā)育過程中miRNA和靶基因、不同miRNA之間以及不同基因之間的研究具有重要的意義。Hu等[23]通過對鹿茸重量存在差異的100個個體的鹿茸尖部增殖區(qū)進(jìn)行高通量測序，共鑒定出1 082個miRNA，鑒定得到一些基因(COL1A1，COL1A2，COL3A1，F(xiàn)N1和ATP6)和一些miRNA(miR-21，let-7i和 miR-27b)與鹿茸的生理生長特性高度相關(guān)。該研究最終篩選得到可以作為鹿茸重量DNA標(biāo)記的14個候選基因和6個候選miRNA，并且構(gòu)建了關(guān)于鹿茸生長發(fā)育的miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，該研究對從分子水平上揭示鹿茸重量的不同具有一定的參考基礎(chǔ)。孟星宇[24]在制備鹿茸軟骨細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞的miRNA芯片基礎(chǔ)上，運用實驗證明miR-1對鹿茸軟骨細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，S期細(xì)胞含量明顯減少，G0/G1期細(xì)胞含量明顯增加。李婷等[25]通過雙熒光素酶報告基因檢測實驗確定了let-7a、let-7f是IGF-1R基因的靶基因，并且證實let-7a、let-7f對鹿茸頂端組織的軟骨細(xì)胞增殖具有抑制作用，而let-7a、let-7f的抑制物可以通過上調(diào)細(xì)胞內(nèi)IGF-1R的表達(dá)量進(jìn)而使細(xì)胞增殖速度加快。Hu等[26]驗證確定了miR-18a是鹿茸增殖的重要調(diào)控因子，且可以顯著抑制鹿茸軟骨細(xì)胞的增殖。對于miRNA對鹿茸細(xì)胞增殖影響的研究，填補(bǔ)了RNA組學(xué)在鹿茸生物學(xué)中運用的數(shù)據(jù)，為鹿茸生長發(fā)育的進(jìn)一步揭示提供了參考。

2.4 miRNA對鹿茸再生調(diào)控的研究進(jìn)展

鹿茸的周期性再生是一個復(fù)雜的過程，伴隨著皮膚、血管、神經(jīng)和骨組織等組織的再生。目前對于miRNA在鹿茸再生的過程中發(fā)揮怎樣的作用還未見詳細(xì)的報道。Runx2在軟骨細(xì)胞分化和成熟過程中起重要作用，Runx2可能在梅花鹿鹿茸再生的過程中扮演著重要的角色[27]，而miRNA-27a可以通過下調(diào)Runx2的激活劑進(jìn)而抑制Runx2的表達(dá)[28]。由此可見miRNA-27a是鹿茸再生過程中一個重要的miRNA，可能通過調(diào)控鹿茸軟骨組織的再生進(jìn)而調(diào)控鹿茸的整個再生過程。鹿茸的再生屬于割處再生，茸角傷口愈合而不留瘢痕。在大鼠傷口中局部使用miRNA-29b治療可以減少傷口愈合過程中瘢痕的形成，這提示我們miRNA-29b可能在鹿茸割處再生的過程中也發(fā)揮著不可或缺的作用[29]。但是對于miRNA在鹿茸再生中發(fā)揮的具體作用還需要進(jìn)一步的實驗來闡明。

3 總結(jié)與展望

鹿茸生長發(fā)育以及周期性再生的相關(guān)研究一直以來都是眾多學(xué)者研究的重點和熱點。鹿茸再生由內(nèi)部組織(軟骨和骨)和外部組織(皮膚、血管和神經(jīng))所構(gòu)成，鹿茸的生長發(fā)育是一個復(fù)雜的過程，在這個過程中，鹿茸的骨組織、皮膚、血管、神經(jīng)等組織均在生長。眾多細(xì)胞因子之間通過相互作用協(xié)同調(diào)節(jié)鹿茸生長發(fā)育。探究miRNA對于鹿茸生長發(fā)育的作用有助于我們從RNA組學(xué)的角度了解鹿茸的生長發(fā)育，這無疑加速了人們對鹿茸生長發(fā)育獨特生理學(xué)特點的認(rèn)知。

綜上所述，目前對于miRNA通過介導(dǎo)生長因子進(jìn)而調(diào)控鹿茸生長發(fā)育的研究主要集中在對VEGF、IGF和TGF這3個生長因子的研究上，對于miRNA如何靶向其他的生長因子以及對鹿茸的生長發(fā)育發(fā)揮怎樣的作用和影響等方面尚未見報道。Yao[22]等構(gòu)建的鹿茸生長中心的miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對于其中不同基因之間、不同miRNA之間、miRNA與它的靶基因之間通過什么樣的競爭和協(xié)作關(guān)系來調(diào)控鹿茸生長發(fā)育我們尚未了解。對于這個龐大而又復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)也知之甚少。同時，由于現(xiàn)有鹿科動物的基因組比較匱乏，使得鹿科動物的研究具有一定的局限性。在接下來的研究中，應(yīng)結(jié)合RNA組學(xué)不斷探索miRNA的調(diào)控機(jī)制以及對鹿茸生長發(fā)育甚至是再生的作用，這將為鹿茸生長發(fā)育甚至是人類腫瘤治療以及器官再生提供重要的參考依據(jù)。