崔國寧　劉喜平　陳嘉慧　崔樹婷　譚霞

摘要：目的? 觀察半夏瀉心湯聯(lián)合IL-12轉染骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）對胃癌荷瘤裸鼠的抑瘤作用。方法? 取培養(yǎng)第3代的BMSCs，采用LV5空載慢病毒及LV5 IL-12過表達慢病毒轉染BMSCs細胞，分別于轉染48、72 h后，倒置熒光顯微鏡觀察，經(jīng)嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉染BMSCs，RT-qPCR檢測BMSCs中IL-12的表達。Balb/C裸鼠腋窩皮下接種人胃癌BCG-823細胞建立胃癌荷瘤裸鼠模型，實驗分為成瘤組、空載組、轉染組、藥物組、聯(lián)合組?？蛰d組、轉染組和聯(lián)合組經(jīng)尾靜脈注射0.2 mL含1×10⁷/mL轉染慢病毒的BMSCs懸液，藥物組和聯(lián)合組給予半夏瀉心湯27.43 g/kg灌胃，每次0.5 mL，成瘤組給予等量生理鹽水灌胃，隔日測量并計算瘤體體積，連續(xù)干預13 d，取瘤體組織，計算抑瘤率。結果? 倒置熒光顯微鏡下穩(wěn)定轉染病毒的BMSCs呈不規(guī)則形、星形，蜂窩狀綠色熒光分布，經(jīng)RT-qPCR驗證，轉染BMSCs的IL-12 mRNA表達升高，與正常BMSCs、空載BMSCs比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與成瘤組、空載組比較，轉染組、藥物組及聯(lián)合組瘤體積及瘤質(zhì)量增加較?。≒<0.05）;與轉染組、藥物組比較，聯(lián)合組瘤體積及瘤質(zhì)量增加最?。≒<0.05）;與空載組比較，轉染組、藥物組及聯(lián)合組抑瘤率明顯升高（P<0.05）;與轉染組、藥物組比較，聯(lián)合組抑瘤率明顯升高（P<0.05）。結論? 半夏瀉心湯及IL-12轉染的BMSCs對胃癌荷瘤裸鼠均有一定的抑瘤作用，二者聯(lián)合具有協(xié)同增效作用。

關鍵詞：半夏瀉心湯;骨髓間充質(zhì)干細胞;白細胞介素-12;裸鼠

中圖分類號：R285.5 ???文獻標識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2020）01-0039-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201906381

Study on Antitumor Effects of Banxia Xiexin Decoction Combined with IL-12 Transfected BMSCs on Nude Mice with Gastric Cancer

CUI Guoning， LIU Xiping， CHEN Jiahui， CUI Shuting， TAN Xia

Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China

Abstract： Objective To observe the antitumor effects of Banxia Xiexin Decoction combined with IL-12 transfected BMSCs on nude mice with gastric cancer. Methods BMSCs of the third generation were cultured and transfected by LV5 no-load lentiviruses and IL-12 overexpression lentiviruses into BMSCs. The expression of IL-12 in BMSCs was detected by RT-qPCR after transfected 48 hours and 72 hours through inverted fluorescence microscopy. A nude mouse model of gastric cancer was established by subcutaneous inoculation of human gastric cancer BCG-823 cells into the axilla of Balb/C nude mice. The model was divided into tumorigenic group， no-load group， transfection BMSCs， medicine group and combination group. No-load BMSCs， transfection group and combination group were injected 0.2 mL BMSCs suspension containing 1×10⁷/mL lentivirus via tail vein respectively. The medicine group and combination group were given Banxia Xiexin Decoction for gavage （27.43 g/kg， 0.5 mL each time）. The tumorigenic group was given the same dose of saline for gavage. Tumor volume of each group was measured and calculated every other day. After 13 days of continuous intervention， tumor tissue was taken to calculate the antitumor rate. Results BMSCs stably transfected with the virus showed irregular， star-shaped and honeycomb-like green fluorescence distribution under inverted fluorescence microscopy. The expression of IL-12

mRNA in the transfection BMSCs was increased by RT-qPCR， and there was statistical significance between the normal BMSCs and no-load BMSCs （P<0.05）. Compared with tumorigenic group and no-load group， the tumor mass and tumor weight of the transfection group， the medicine group and the combination group increased little （P<0.05）; Compared with the transfection group and the medicine group， the tumor mass and tumor weight of the combination group were the least （P<0.05）; Compared with the no-load group， the antitumor rates of the transfection group， the medicine group and the combination group significantly increased （P<0.05）. Compared with the transfection group and the medicine group， the antitumor rate of the combination group significantly increased （P<0.05）. Conclusion Banxia Xiexin Decoction combined with BMSCs transfected with IL-12 have certain anti-tumor effects on nude mice with gastric cancer， and their combination has a significant synergistic effect.

Keywords： Banxia Xiexin Decoction; BMSCs; IL-12; nude mice

骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是起源于中胚層的一種多能干細胞，具有腫瘤趨向特性，是腫瘤靶向治療首選種子細胞^[1]。IL-12是一種免疫刺激性細胞因子，被認為是細胞免疫應答反應中的初始因子，能激活T淋巴細胞、NK細胞，破壞腫瘤細胞的免疫逃逸，具有很強的抗腫瘤作用^[2]。轉染是真核細胞主動或被動導入外源的DNA片段，從而獲得新表型的過程。已有研究表明，通過轉染將IL-12導入BMSCs，使其過表達IL-12，對卵巢癌、結腸癌有顯著抑瘤作用^[3-4]。半夏瀉心湯是臨床防治胃癌的常用方劑，臨床療效確切^[5]。有研究表明，半夏瀉心湯可抑制人胃癌細胞增殖、誘導人胃癌細胞凋亡^[6-10]。然而，過表達IL-12的BMSCs對胃癌是否有抑瘤作用，半夏瀉心湯對其抑瘤作用是否具有協(xié)同增效作用迄今尚未見報道。本研究以半夏瀉心湯對胃癌荷瘤裸鼠進行灌胃，同時將IL-12轉染的BMSCs經(jīng)胃癌荷瘤裸鼠尾靜脈注射進行聯(lián)合干預，探討半夏瀉心湯聯(lián)合IL-12轉染BMSCs對胃癌荷瘤裸鼠抑瘤作用是否具有協(xié)同作用，以期為中西醫(yī)結合防治胃癌提供可借鑒的思路。

1? 實驗材料

1.1? 動物及細胞株

60只SPF級Balb/C裸鼠，體質(zhì)量15～20 g，4～8周齡，雄雌不限，北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物許可證號SCXK（京）2014-0004，飼養(yǎng)于重慶威斯騰生物科技有限公司SPF級實驗室，溫度23～25 ℃，相對濕度50%±10%，12 h/12 h晝夜交替。BGC-823人胃癌細胞，上海中國科學院細胞庫提供。裸鼠BMSCs，重慶威斯騰生物公司提供，由本實驗室傳代培養(yǎng)并保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2? 藥物及制備

半夏瀉心湯（半夏、干姜、黃芩、紅參各15 g，炙甘草10 g，黃連6 g，大棗20 g），飲片購于甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學藥學院景明教授鑒定符合國家藥典規(guī)定。飲片按原方比例混合^[11]，浸泡30 min，煎煮2次，第1次加8倍水，煎煮1 h后取煎液，第2次加6倍水，煎煮30 min后合并煎液，離心，過濾，濃縮，給藥量按70 kg成人與裸鼠體表面積換算等效劑量為2.31 g原藥材/mL^[12]。

1.3? 主要試劑及儀器

LV5空載慢病毒、IL-12過表達慢病毒（威斯騰生物提供，滴度為3×10⁸、5×10⁸ TU/mL），嘌呤霉素（美國Sigma公司，批號P8833），sybrgreen Ⅰ（美國Thermo公司，批號A25741），DMEM-F12培養(yǎng)基（美國Thermo公司，批號C11330500BT），胎牛血清（美國Thermo公司，批號10099-141），胰蛋白酶（上海碧云天生物技術有限公司，批號C0201），青霉素-鏈霉素溶液（上海碧云天生物技術有限公司，批號C0222），DMSO（美國Amresco公司，批號V900090），Trizol（美國Takara，批號9109），熒光定量PCR試劑（美國Takara，批號RR820）。二氧化碳培養(yǎng)箱（日本三洋公司），迷你型超速離心機（德國Eppendorf公司），電子分析天平（瑞士Precisa12A），倒置熒光顯微鏡、照像系統(tǒng)（日本Olympus公司），實時熒光定量PCR儀（德國Eppendorf公司），0.22、0.45 μm混合纖維素濾膜（美國Millipore公司），切片機、展片機、烤片機（德國Leica公司）。

2? 實驗方法

2.1? LV5空載慢病毒及LV5-IL-12過表達慢病毒轉染骨髓間充質(zhì)干細胞

取對數(shù)生長期BMSCs，PBS清洗，胰蛋白酶（0.25%EDTA）消化細胞3 min，收集細胞15 mL置于離心管，離心5 min重懸細胞，培養(yǎng)板加入細胞懸液，使每孔細胞約為5×10⁵個，置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當鋪板時細胞融合率約為50%，每孔培養(yǎng)基體積為100 μL，融合度約為70%時，細胞生長狀態(tài)較好。取出病毒，4 ℃冰箱保存，離心20 s，PBS清洗2次，取出離心后的病毒和細胞，使用移液器吸取準確體積病毒液加入準備好的培養(yǎng)基，吸去原細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基，在目的細胞中加感染復數(shù)（MOI值）為50的LV5空載慢病毒及LV5-IL-12過表達慢病毒病毒液200 μL，同時每孔按8 μg/mL加入適量的聚凝胺，混勻，置于37 ℃、5%CO₂培養(yǎng)箱孵育過夜。8 h后更換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別于轉染48、72 h后，用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達，若陽性則黃綠色比較明亮，并估算慢病毒轉染BMSCs的效率。

2.2? 嘌呤霉素篩選LV5空載慢病毒及LV5-IL-12過表達慢病毒穩(wěn)定轉染的骨髓間充質(zhì)干細胞

取對數(shù)生長期BMSCs，用新鮮無抗無血清培養(yǎng)基制成1.5×10⁵個/mL細胞懸液。96孔培養(yǎng)板中每孔加細胞懸液100 μL，再向每孔加適量新鮮無抗無血清的培養(yǎng)基，混勻后置于37 ℃、5%CO₂培養(yǎng)箱靜置過夜。用嘌呤霉素濃度分別為0、2、4、6、8、10 μg/mL新鮮無抗無血清培養(yǎng)基溶液替換各孔中舊的培養(yǎng)基。篩選細胞：24孔板中以5×10⁴～8×10⁴個/孔的密度鋪板，孵育過夜;剔除舊的培養(yǎng)基，加MOI值為50的病毒顆粒，加入聚凝胺使其終濃度為8 μg/mL，病毒轉導后6～8 h，再加1 mL完全培養(yǎng)基，孵育過夜;病毒轉導后48 h，使用嘌呤霉素篩選培養(yǎng)基替換舊的完全培養(yǎng)基，孵育;待抗性細胞長滿以后，細胞轉入25 cm²培養(yǎng)瓶，收獲細胞。

2.3? RT-qPCR驗證骨髓間充質(zhì)干細胞的IL-12過表達

分別取貼壁生長的正常BMSCs、LV5空載慢病毒轉染BMSCs、LV5-IL-12過表達慢病毒轉染BMSCs，每10 cm²加入Trizol試劑1 mL，直至細胞全部溶化。將上述勻漿液室溫放置5 min。每1 mL Trizol試劑用量的勻漿液中加入0.2 mL氯仿，蓋緊管蓋，震搖15 s，室溫靜置2～3 min，4 ℃、10 000 r/min離心10 min。吸取上層水相置于新試管中，加等體積預冷的異丙醇，蓋緊管蓋，輕輕搖勻。室溫靜置10 min，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，棄除上清液，每管加入75%乙醇1 mL潤洗，4 ℃、7500 r/min離心5 min。打開管蓋，沉淀干燥，將RNA沉淀溶于無RNase水中，測定RNA濃度后進行反轉錄。反應條件：25 ℃、10 min，42 ℃、50 min，85 ℃、5 min。擴增條件：94 ℃、4 min，94 ℃、20 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，35個循環(huán)，72 ℃檢測信號。基因引物序列見表1。分析目的基因的相對表達量，結果以Ct值表示，Ct值表示每個反應管內(nèi)熒光信號到達設定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，Ct值越大，表達量越低。ΔΔCt值=處理組（目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值）-未處理組（目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值），用2^-ΔΔCt表示基因相對表達量^[13]。

2.4? 造模、分組及干預

實驗裸鼠55只，自由攝食飲水，常規(guī)飼養(yǎng)1周后，將對數(shù)生長期的人胃癌BCG-823細胞制成濃度為1×10⁷/mL細胞懸液，于每只裸鼠腋窩皮下接種150 μL。直到裸鼠腫瘤生長直徑約0.5～1 cm³，再從55只裸鼠中選取腫瘤大小比較一致的50只，隨機分為5組。成瘤組給予生理鹽水0.5 mL/只灌胃;空載組裸鼠尾靜脈注射0.2 mL/只空載慢病毒轉染的BMSCs細胞懸液（1×10⁷/mL）;轉染組裸鼠尾靜脈注射0.2 mL/只LV5-IL-12過表達慢病毒轉染的BMSCs細胞懸液（1×10⁷/mL）;藥物組給予裸鼠0.5 mL/只（每次0.6 g/20 g）半夏瀉心湯灌胃，1次/d;聯(lián)合組在尾靜脈注射0.2 mL/只LV5-IL-12過表達慢病毒轉染BMSCs細胞懸液的同時，給予半夏瀉心湯0.5 mL/只（每次0.6 g/20 g）灌胃，1次/d。連續(xù)干預13 d。實驗過程中隔日計算荷瘤裸鼠腫瘤體積變化。腫瘤體積（V）=長徑×短徑²/2。實驗結束后，腹腔注射3.5%水合氯醛（1 mL/100 g）麻醉，取瘤體組織，剔除纖維包膜，稱重，計算抑瘤率。抑瘤率（%）=（模型組平均瘤重-干預組平均瘤重）÷模型組平均瘤重×100%。

3? 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4? 結果

4.1? 熒光顯微鏡觀察LV5-IL-12過表達慢病毒轉染骨髓間充質(zhì)干細胞結果

MOI值為50轉染的細胞，細胞轉染48 h后，普通光鏡自然光下細胞形態(tài)規(guī)則，生長良好。熒光顯微鏡下LV5空載慢病毒轉染的BMSCs和LV5-IL-12過表達慢病毒轉染的BMSCs綠色熒光強度增強，呈不規(guī)則形、星形，蜂窩狀聚集分布。72 h后細胞融合現(xiàn)象明顯，綠色熒光強度達到最高，轉染率達90%。結果見圖1、圖2。

4.2? LV5-IL-12過表達慢病毒轉染骨髓間充質(zhì)干細胞IL-12 mRNA表達結果

經(jīng)慢病毒轉染后，IL-12 mRNA穩(wěn)定表達于BMSCs中，IL-12 mRNA表達較正常BMSCs和空載慢病毒轉染BMSCs明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而正常BMSC和空載慢病毒轉染BMSCs IL-12 mRNA表達變化不明顯，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結果見表2。

4.3? 半夏瀉心湯聯(lián)合白細胞介素-12轉染骨髓間充質(zhì)干細胞對裸鼠腫瘤體積、瘤質(zhì)量及抑瘤率的影響

各組裸鼠接種人胃癌BCG-823細胞2 d內(nèi)，裸鼠體表外觀無明顯變化，飲食活動基本正常。第3日裸鼠腋下出現(xiàn)瘤塊，并逐漸增大，5～7 d裸鼠腋下腫塊無明顯變化，第9日后裸鼠腋下瘤塊明顯增大。第13日各組裸鼠飲食及活動明顯減少，裸鼠腋下腫瘤體積增大均較顯著。與成瘤組及空載組比較，轉染組、藥物組及聯(lián)合組裸鼠腋下腫瘤體積及質(zhì)量增加較小，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與轉染組、藥物組比較，聯(lián)合組裸鼠腋下腫瘤體積及質(zhì)量增加最小，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與成瘤組及空載組比較，轉染組、藥物組及聯(lián)合組平均抑瘤率分別為36.9%、42.3%、60.5%，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結果見表3、表4。

5? 討論

BMSCs良好的遷移性、腫瘤趨向性^[14]、易于分離擴增和易于導入外源基因的特點，使其成為腫瘤生物治療的首選載體。利用BMSCs作為胃癌生物治療的載體，追蹤并運送腫瘤靶向藥物到惡性腫瘤內(nèi)部，或?qū)⒒蛐揎椀腂MSCs作為基因治療的靶向載體以增強其抗腫瘤效應^[15-16]，是胃癌治療的全新思路與探索，可能為胃癌的治療帶來希望。有研究表明，BMSCs可靶向遷移到胃癌組織，促進胃癌細胞的增殖^[17]，而基因修飾后的BMSCs對腫瘤具有靶向治療作用，如轉染解聚素-金屬蛋白酶17-shRNA的BMSCs具有靶向歸巢至裸鼠乳腺癌移植瘤并發(fā)揮抑瘤作用^[18]，經(jīng)慢病毒介導的IL-24基因轉染BMSCs后，能顯著抑制肺癌細胞A549的增殖，促進凋亡^[19]。IL-12是一種細胞刺激因子，可刺進T細胞和NK細胞活化^[20]，T細胞是一類抗惡性腫瘤的特異性效應T細胞，可通過特異性識別，分泌多種細胞因子、趨化因子殺傷腫瘤細胞，而NK細胞活化對腫瘤具有直接殺傷作用^[21]。體內(nèi)研究表明，IL-12可抑制原發(fā)腫瘤的生長及轉移灶的發(fā)生，具有很好的抗腫瘤作用^[22-23]。研究發(fā)現(xiàn)，慢病毒介導IL-12過表達BMSCs后，通過腹腔注射移植治療可延長腫瘤腹水模型小鼠的存活率，對惡性腹水腫瘤小鼠具有保護作用^[24]。

胃癌屬中醫(yī)學“噎嗝”“癥瘕”等范疇，多由飲食不節(jié)、寒溫不適，損傷脾胃，使痰濁阻滯中焦，郁久化毒，致痰毒內(nèi)盛，阻礙氣機而成。據(jù)此我們提出健脾補虛、化痰散結、清解癌毒是防治胃癌的關鍵治法，半夏瀉心湯是體現(xiàn)該治法的代表方劑。半夏瀉心湯源于《傷寒雜病論》，方中半夏、干姜辛開以化痰散結，黃連、黃芩苦降以清解癌毒，人參、大棗、甘草健脾補虛。諸藥配伍，共奏健脾補虛、化痰散結、清解癌毒之功，與胃癌的中醫(yī)病機相對應。半夏瀉心湯治療胃癌等消化道腫瘤，臨床療效確切^[25]。我們早期研究發(fā)現(xiàn)，半夏瀉心湯可降低大鼠胃黏膜腸化增生或異型增生的發(fā)生，阻斷或逆轉胃癌前病變^[26]，抑制人胃癌細胞增殖，誘導人胃癌細胞凋亡，保護胃癌微環(huán)境對腹膜間皮細胞的損傷^[27-29]，抑制人胃癌腹膜高轉移潛能細胞的生長增殖及侵襲轉移^[30]。

本實驗所用半夏為生品，其始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列下品，原書云“多毒，不可久服”。由于其含有毒性成分，所以生半夏的臨床應用較少。通過炮制可減輕其毒性作用，但炮制品中肌苷、鳥苷、腺苷、琥珀酸、鹽酸麻黃堿含量明顯下降^[31]。半夏瀉心湯中含有半夏、干姜與人參，基礎研究發(fā)現(xiàn)生半夏粉與干姜、人參配伍后對小鼠孕體及胎兒無明顯毒性^[32];臨床研究表明，炮制半夏多用于輕證、初病，而重癥痼疾則力有未逮，名醫(yī)李可用生半夏45 g治療中風先兆或急性期，療效肯定^[33];張成銘^[34]研究表明，15～45 g生半夏治療惡性腫瘤16例均取得一定療效而無不良反應。可見，通過恰當?shù)呐湮?、準確的辨證及可行的用法可改善生半夏的毒副作用，但是，對于半夏瀉心湯中生半夏的拓展應用，仍需要基礎研究對其原方的毒副作用機制作進一步探討。其次，人參為五加科植物人參的干燥根和根莖，紅參為人參蒸制后的干燥根和根莖，其性偏熱，具有火大、勁足、功效強的特點，補虛作用強于人參。研究表明，人參中多糖及皂苷具有抗腫瘤作用^[35]，通過比較不同生長年限和不同部位人參與紅參中總多糖的含量發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地、不同年限人參與紅參中總多糖含量差別不大，但紅參中可溶性多糖含量明顯高于人參^[36];高效液相色譜法測定紅參中含有多種人參皂苷^[37]，其中，Rg3通過抑制胃癌SGC7901細胞中Wnt/β聯(lián)蛋白通路激活從而抑制細胞的侵襲、遷移及血管生成擬態(tài)的形成^[38]。

本研究選擇LV5慢病毒質(zhì)粒為載體，能表達綠色熒光蛋白，并將BMSCs作為載體細胞被慢病毒轉染。在熒光顯微鏡下空載BMSCs和IL-12過表達，均可顯示綠色熒光，說明2種BMSCs成功被慢病毒轉染，構建了空載病毒和IL-12過表達慢病毒體系。采用RT-qPCR法檢測BMSCs中IL-12基因表達，結果顯示，經(jīng)慢病毒介導IL-12基因轉染BMSCs后，BMSCs中IL-12基因表達明顯升高，證實成功構建了IL-12過表達的BMSCs。通過胃癌荷瘤裸鼠尾靜脈注射被IL-12過表達的BMSCs，與成瘤組、空載組比較，胃癌荷瘤裸鼠腫瘤體積明顯減小，瘤質(zhì)量明顯減輕，抑瘤率達36.9%，同時發(fā)現(xiàn)半夏瀉心湯對胃癌荷瘤裸鼠腫瘤也有顯著的抑瘤作用。半夏瀉心湯與IL-12過表達慢病毒轉染BMSCs聯(lián)合過表達慢病毒對胃癌荷瘤裸鼠腫瘤平均抑制率達60.5%，明顯高于轉染組和藥物組。因此，半夏瀉心湯及IL-12過表達慢病毒轉染的BMSCs對胃癌荷瘤裸鼠均有一定的抑瘤作用，二者聯(lián)合具有顯著的協(xié)同增效作用。本研究為中藥復方聯(lián)合基因轉染BMSCs治療胃癌提供了新的策略與思路，為臨床應用提供了依據(jù)。

參考文獻：

[1] ENGLISH K， MAHON B P， WOOD K J. Mesenchymal stromal cells：role in tissue repair， drug discovery and immune modulation[J]. Curr Drug Deliv，2014，11（5）：561-571.

[2] HERNANDEZ-ALCOCEBA R， POUTOU J， BALLESTEROS-BRIONES M C， et al. Gene therapy approaches against cancer using in vivo and ex vivo gene transfer of interleukin-12[J]. Immunotherapy，2016，8（2）：179-198.

[3] 張霞，都治香，王娜，等.白細胞介素12基因修飾骨髓間充質(zhì)干細胞對卵巢癌細胞生長的影響[J].中國組織工程研究，2017，21（9）：1346-1351.

[4] 何楊，林晨，高琴，等.慢病毒介導人白細胞介素12轉染鼠骨髓間充質(zhì)干細胞可抑制CT26瘤體的生長[J].中國組織工程研究，2018，22（25）：3944-3949.

[5] 花寶金，王芳，侯煒.半夏瀉心湯化裁治療消化系統(tǒng)腫瘤54例[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2006，13（2）：74-76.

[6] 劉喜平，李沛清，席時燕，等.半夏瀉心方配伍與誘導BGC-823細胞凋亡關系的血清藥理學研究[J].中醫(yī)雜志，2006，47（2）：134-137.

[7] 李沛清，劉喜平，席時燕.半夏瀉心方及其配伍藥組含藥血清對人胃癌BGC-823細胞生長抑制作用及p53表達的影響[J].中藥藥理與臨床， 2005，21（5）：7-9.

[8] 席時燕，劉喜平，李沛清.半夏瀉心方及其配伍藥組含藥血清對人胃癌BGC-823細胞增殖及bcl-2表達的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2006， 13（4）：20-22.

[9] 汪永鋒，劉喜平，徐曉艷.半夏瀉心方配伍藥組含藥血清對人胃癌細胞凋亡及凋亡相關基因的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2006，13（5）：27-29.

[10] 王萍，李娟，劉喜平，等.半夏瀉心方及配伍藥組含藥血清抑制人胃癌BGC-823細胞增殖的實驗研究[J].甘肅中醫(yī)學院學報，2005，22（5）：14-17.

[11] 鄧中甲.方劑學[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2003：88.

[12] 劉喜平，崔國寧，董俊剛，等.參苓白術散與痛瀉要方對潰瘍性結腸炎大鼠內(nèi)源性間充質(zhì)干細胞動員的比較研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志， 2018，25（11）：41-45.

[13] LIVAK K J， SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^ΔΔCt method[J]. Methods，2001，25（4）：402-408.

[14] 單連慧，李海存，安新穎，等.基于文獻計量學的中國干細胞治療臨床應用現(xiàn)狀研究[J].中華細胞與干細胞雜志（電子版），2016，6（1）：47-51.

[15] CAMMAROTA F， LAUKKANEN M O. Mesenchymal stem/stromal cells in stromal evolution and cancer progression[J]. Stem Cells Int， 2016，2016：4824573.

[16] CHEN T， YANG K， YU J， et al. Identification and expansion of cancer stem cells in tumor tissues and peripheral blood derived from gastric adenocarcinoma patients[J]. Cell Res，2012，22（1）：248-258.

[17] 陳超，李海濤.骨髓間充質(zhì)干細胞移植對胃癌模型大鼠腫瘤細胞的影響[J].中國組織工程研究，2016，20（41）：6158-6163.

[18] 賈文婷，蔡準，張雪鵬，等.ADAM17-shRNA轉染的骨髓間充質(zhì)干細胞對裸鼠乳腺癌移植瘤生長的影響[J].中國腫瘤生物治療雜志，2017， 24（10）：1088-1092.

[19] 祁秋干，周清華，李印，等.人骨髓間充質(zhì)干細胞表達外源性IL-24基因?qū)Ψ伟┘毎鸄549增殖的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2014，24（9）：11-16.

[20] ITO S E， SHIROTA H， KASAHARA Y， et al. IL-4 blockade alters the tumor microenvironment and augments the response to cancer immunotherapy in a mouse model[J]. Cancer Immunol Immunother， 2017，66（11）：1485-1496.

[21] WANG Z， TILL B， GAO Q. Chemotherapeutic agent-mediated elimination of myeloid-derived suppressor cells[J]. Oncoimmunology， 2017，6（7）：e1331807.

[22] TUGUES S， BURKHARD S H， OHS I， et al. New insights into IL-12-mediated tumor suppression[J]. Cell Death Differ，2015， 22（2）：237-246.

[23] YUE T， ZHENG X， DOU Y， et al. Interleukin 12 shows a better curative effect on lung cancer than paclitaxel and? cisplatin doublet chemotherapy[J]. BMC Cancer，2016，16（1）：665.

[24] WANG A， ZHOU X， ZHAO J， et al. Therapeutic effects of bone marrow mesenchymal stem cells expressing interleukin-12 in mice bearing malignant ascites tumor[J]. Int J Clin Exp Med，2015，8（9）：15840- 15845.

[25] 劉瑞，花寶金.運用氣機升降理論治療腫瘤探析[J].中國中西醫(yī)結合雜志，2015，35（1）：104-106.

[26] 張艷，汪永鋒，劉喜平，等.半夏瀉心方及其拆方配伍藥組對實驗性大鼠胃癌前病變胃黏膜組織病理學影響[J].甘肅中醫(yī)，2007，20（6）：69-71.

[27] 崔國寧，劉喜平，李沛清，等.半夏瀉心湯含藥血清對胃癌微環(huán)境誘導人腹膜間皮細胞氧化應激反應的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2017，28（1）：12-14.

[28] 王璟，劉喜平，李沛清，等.半夏瀉心湯含藥血清對胃癌微環(huán)境誘導腹膜間皮HMrSV5細胞損傷的保護作用[J].時珍國醫(yī)國藥，2015，26（11）：2566-2568.

[29] 張煒，劉喜平，明海霞，等.半夏瀉心湯含藥血清對胃癌微環(huán)境誘導腹膜間皮HMrSV5細胞凋亡的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2016，31（9）：3735- 3738.

[30] 劉喜平，李沛清，明海霞，等.半夏瀉心湯含藥血清對胃癌腹膜轉移細胞系GC9811-P增殖及侵襲轉移的影響[J].中國中西醫(yī)結合雜志，2016， 36（10）：1224-1228.

[31] 楊冰月，李敏，敬勇，等.半夏及其炮制品化學成分及功效的差異研究[J].中草藥，2018，49（18）：4349-4355.

[32] 徐建亞，張衎，謝輝輝，等.生半夏及干姜人參半夏丸對小鼠生殖相關毒性的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2017，32（7）：3154-3157.

[33] 陳旸，朱宏，曹軍平，等.毒性中藥生半夏在急重癥中的應用及病案舉隅[J].中華災害救援醫(yī)學，2017，5（10）：594-596.

[34] 張成銘.大劑量生半夏治療惡性腫瘤16例[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報， 2007，9（6）：108-109.

[35] 羅林明，石雅寧，姜懿納，等.人參抗腫瘤作用的有效成分及其機制研究進展[J].中草藥，2017，48（3）：582-596.

[36] 齊濱，劉莉，趙大慶，等.人參、西洋參和紅參中糖類含量的比較研究[J].中國藥房，2013，24（7）：616-618.

[37] 王敏，趙振霞，劉永利，等.紅參中5種人參皂苷含量的超高效液相色譜法同時測定[J].時珍國醫(yī)國藥，2019，30（1）：56-58.

[38] 李燁婷，唐有為.人參皂苷Rg3體外通過抑制Wnt/β聯(lián)蛋白通路阻止胃癌SGC7901細胞血管生成擬態(tài)的形成[J].中國腫瘤生物治療雜志， 2019，26（5）：518-523.

（收稿日期：2019-06-26）

（修回日期：2019-07-14;編輯：華強）

基金項目：國家自然科學基金（81860813）

通訊作者：劉喜平，E-mail：Lxp-d257@163.com