袁志鷹　李東洋　李亞林　管賀　劉湘丹　謝夢(mèng)洲　黃惠勇

摘要：目的? 基于傅里葉變換衰減全反射紅外光譜（ATR-FTIR）結(jié)合超高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器（UPLC-DAD）技術(shù)快速區(qū)分不同品種百合藥材粉末。方法? 采用ATR-FTIR采集百合樣品紅外光譜數(shù)據(jù)并導(dǎo)入Simca軟件，建立正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）模型，在此基礎(chǔ)上，聯(lián)用UPLC-DAD技術(shù)測(cè)定正品百合、偽品金百合及微波干燥卷丹中王百合苷A含量，分析其差異性。結(jié)果? OPLS-DA二維得分圖及層次聚類(lèi)分析圖對(duì)卷丹與百合、卷丹與偽品金百合、熱風(fēng)干燥卷丹與微波干燥卷丹進(jìn)行了良好的分類(lèi)。卷丹的王百合苷A含量為2.09～3.28 mg/g，百合的王百合苷A含量為1.36～1.77 mg/g，偽品金百合的王百合苷A含量為1.03～1.05 mg/g，微波干燥卷丹的王百合苷A含量為3.92～4.01 mg/g。卷丹和百合中的王百合苷A含量高于偽品金百合，微波干燥卷丹的王百合苷A含量高于普通熱風(fēng)干燥卷丹。結(jié)論? 本研究建立的方法操作簡(jiǎn)單、方便、快速，可為百合飲片、百合藥膳產(chǎn)品開(kāi)發(fā)及相關(guān)藥材的質(zhì)量控制提供借鑒。

關(guān)鍵詞：百合;傅里葉變換衰減全反射紅外光譜;超高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器;王百合苷A

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.1 ???文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A??? 文章編號(hào)：1005-5304（2020）01-0057-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201901219

Identification of Lilii Bulbus and Its Counterfeit by ATR-FTIR and UPLC-DAD

YUAN Zhiying^{1，2，3}， LI Dongyang¹， LI Yalin¹， GUAN He¹， LIU Xiangdan¹， XIE Mengzhou^1，3， HUANG Huiyong^1，3

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China; 2. Hunan Engineering Technology Center of Standardization and Function of Chinese Herbal Decoction Pieces， Changsha 410208， China; 3. Hunan Engineering Technology Center of Functional Food Homology of Medicine， Changsha 410208， China

Abstract： Objective To quickly distinguish different kinds of Lilii Bulbus powder based on ATR-FTIR and UPLC-DAD. Methods The infrared spectral data of samples were collected by ATR-FTIR， and the data was imported into Simca software to establish the orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLS-DA） model. On this basis， UPLC-DAD was used to determine the content of regaloside A in genuine Lilii Bulbus and Lilium trompeten （counterfeit） and microwave dried Lilium lancifolium Thunb.， and the differences among different samples were analyzed. Results Two-dimensional score map of OPLS-DA and hierarchical cluster analysis were used to classify the three groups of Lilium lancifolium Thunb. and Lilium broumii F.E. Brown var.viridulum Baker， Lilium lancifolium Thunb. and Lilium trompeten （counterfeit）， hot-air dried Lilium lancifolium Thunb. and microwave dried Lilium lancifolium Thunb. The content of regaloside A in Lilium lancifolium Thunb. was 2.09–3.28 mg/g， 1.36–1.77 mg/g in Lilium broumii F.E. Brown var.viridulum Baker， 1.03–1.05 mg/g in Lilium trompeten （counterfeit）， and 3.92–4.01 mg/g in microwave Lilium lancifolium Thunb. The content of regaloside A in Lilium lancifolium Thunb. and Lilium broumii

F.E. Brown var.viridulum Baker was significantly higher than that in the counterfeit， while the content of regaloside A in microwave dried Lilium lancifolium Thunb. was higher than that in the hot-air dried Lilium lancifolium Thunb. Conclusion The method is simple， convenient and rapid， which can provide references for the development of medicinal diet products of Lilii Bulbus and the quality control of related medicinal materials.

Keywords： Lilii Bulbus; ATR-FTIR; UPLC-DAD; regaloside A

超高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器（UPLC-DAD）多應(yīng)用于代謝組學(xué)分析及其他一些生化領(lǐng)域，近年來(lái)在天然產(chǎn)物的分析方面運(yùn)用也逐漸興起^[1-2]。傅里葉變換衰減全反射紅外光譜（ATR-FTIR）以其快速、綠色、樣品無(wú)損等特點(diǎn)近年來(lái)被廣泛用于中藥研究^[3-5]。采用UPLC-DAD聯(lián)用紅外光譜技術(shù)研究中草藥不同居群間藥材品質(zhì)差異性，對(duì)中藥復(fù)雜成分體系的研究更加有利^[6]。

百合始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》收錄百合為卷丹Lilium lancifolium Thunb.、百合Lilium broumii F.E. Brown var. viridulum Baker、細(xì)葉百合Lilium pumilum DC.的干燥肉質(zhì)鱗葉^[7-10]，具有潤(rùn)肺止咳、養(yǎng)心安神功效，用于陰虛燥咳、嘮嗽咳血、虛煩驚悸、多夢(mèng)失眠、精神恍惚。本課題組前期在百合藥材資源調(diào)研中發(fā)現(xiàn)，藥材市場(chǎng)中百合以卷丹和百合2個(gè)品種為主，細(xì)葉百合很少，而同屬植物金百合Lilium trompeten因親緣關(guān)系較近被作為百合Lilium broumii F.E. Brown var. viridulum Baker代用品在市場(chǎng)上出售。除此之外，藥材加工方式對(duì)藥材活性成分亦具有明顯影響^[11]。目前，百合藥材鑒別主要采用外觀觀察、顯微特征觀察等傳統(tǒng)方法。由于卷丹、百合、金百合的親屬關(guān)系近，且粉碎后原有外觀性狀特征消失，故傳統(tǒng)鑒別方法難以區(qū)分不同品種及不同加工方式的百合藥材粉末。

本研究在課題組前期對(duì)百合產(chǎn)地環(huán)境、化學(xué)成分研究^[12-14]的基礎(chǔ)上，采用ATR-FTIR結(jié)合Simca軟件建立百合粉末定性鑒別正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）模型，在此基礎(chǔ)上，聯(lián)用UPLC-DAD技術(shù)對(duì)正品百合、偽品金百合及微波干燥卷丹進(jìn)行主要成分王百合苷A含量測(cè)定，探索其差異性特征，為快速區(qū)分百合及其同屬藥材、混偽品及微波干燥藥材提供參考。

1? 儀器與試藥

Nicolet is 5傅里葉變換紅外光譜儀，iD5 ATR附件（賽默飛科技公司）;Simca13.0數(shù)據(jù)分析處理軟件（瑞典Umetrics公司）;202型電熱恒溫干燥箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）;Agilent 1290 Infinity型超高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）;FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）;KM-250DE型中文液晶臺(tái)式超聲波清洗器（昆山美美超聲儀器有限公司）;AR124CN電子天平（上海奧豪斯有限公司）;Millipore純水儀（美國(guó)Millipore公司）。

王百合苷A對(duì)照品（批號(hào)0252-DT01，純度98%，上海Standard Technology）;乙腈為色譜純（韓國(guó)LG公司），乙酸為色譜純（天津市化學(xué)試劑研究所），乙醇為分析純（安徽安特生物化學(xué)有限公司），水為超純水。

收集卷丹、百合及金百合樣品共55批次，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院周日寶教授、周小江教授共同鑒定，分別為百合科植物卷丹Lilium lancifolium Thunb.、百合Lilium broumii F.E. Brown var. viridulum Baker和金百合Lilium trompeten的干燥肉質(zhì)鱗莖。卷丹：長(zhǎng)橢圓形，頂端較尖，基部較寬，邊緣薄，微波狀，常向內(nèi)卷曲;鱗葉長(zhǎng)2～3.5 cm，寬1～3 cm，長(zhǎng)寬比2～2.3，厚1～3 mm，邊緣薄;乳白色或淡黃棕色，光滑、半透明，有脈紋3～8條，角質(zhì)樣;無(wú)臭，味微苦。百合：卵圓形或狹卵圓形，頂端稍尖;鱗葉長(zhǎng)1.5～5 cm，寬0.5～1.5 cm，長(zhǎng)寬比為3，厚約4 mm;表面乳白色至乳黃色，有脈紋3～5條，有的不甚明顯，角質(zhì)樣;無(wú)臭，味微苦至無(wú)苦味。金百合：呈長(zhǎng)橢圓形，邊緣呈波狀，脈紋明顯。微波干燥卷丹：乳白色或淡黃棕色，表面略膨脹，其他外觀形狀特征和卷丹相同。取湖南龍山卷丹，水浴蒸煮5 min，樣品S19～S34于60 ℃熱風(fēng)干燥12 h，即得熱風(fēng)干燥卷丹;樣品S50～S55微波干燥（功率700 W）30 min，即得微波干燥卷丹。樣品來(lái)源信息見(jiàn)表1。

2? 方法與結(jié)果

2.1? 定性鑒別模型的建立

2.1.1? 圖譜信息采集

將各批樣品干燥、粉碎，過(guò)200目篩，取約0.05 g，置于ATR附件上，均勻平鋪，用杠桿壓緊以確保藥材粉末與ATR附件緊密接觸，采集紅外光譜。采集條件：分辨率4 cm^-1，掃描16次，光譜掃描范圍5500～600 cm^-1，背景環(huán)境中CO₂和H₂O的影響通過(guò)背景自動(dòng)扣除。55批樣品ATR-FTIR疊加圖見(jiàn)圖1。

2.1.2? 平均光譜圖分析

從圖1可以看出，不同批次樣品峰型相似，峰位基本相同，無(wú)法直接通過(guò)光譜圖進(jìn)行區(qū)分。截取S19紅外光譜（見(jiàn)圖2）進(jìn)行分析可知，主要吸收特征峰波數(shù)1022 cm^-1附近吸收峰歸屬為羥基C-O的伸縮振動(dòng)，1151 cm^-1附近吸收峰歸屬為酯的C-O-C的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)，1506 cm^-1附近吸收峰推測(cè)歸屬為苯環(huán)上的C=C骨架振動(dòng)，1652 cm^-1附近吸收峰推測(cè)歸屬為烯烴的C=C伸縮振動(dòng)，2930 cm^-1附近吸收峰推測(cè)歸屬為烷烴C-H的伸縮振動(dòng)，3648 cm^-1附近吸收峰推測(cè)歸屬為羥基O-H的伸縮振動(dòng)。不同批次樣品的光譜吸收峰有較小的差異，這可能與其產(chǎn)地環(huán)境因素和植株本身遺傳因素不同導(dǎo)致其化學(xué)成分和含量不同有關(guān)。王百合苷A為百合藥材的主要化學(xué)成分，其分子結(jié)構(gòu)式的部分特征官能團(tuán)與百合藥材粉末紅外光譜推測(cè)的官能團(tuán)具有密切的關(guān)聯(lián)性。

2.1.3? 正交偏最小二乘判別分析

利用Simca軟件的OPLS-DA可快速自動(dòng)建模分組對(duì)比數(shù)據(jù)之間的差異性。本研究中的原始光譜經(jīng)預(yù)處理后導(dǎo)入Simca13.0軟件，分為卷丹與百合、卷丹與金百合（偽品）、熱風(fēng)干燥卷丹和微波干燥卷丹三個(gè)組，分別進(jìn)行OPLS-DA，經(jīng)自動(dòng)平滑、自動(dòng)基線校正預(yù)處理，OPLS-DA二維得分圖可準(zhǔn)確區(qū)分卷丹與百合、卷丹與金百合、熱風(fēng)干燥卷丹和微波干燥卷丹，見(jiàn)圖3～圖5。

2.1.4? 層次聚類(lèi)分析

采用層次聚類(lèi)分析（HCA），鑒別卷丹與百合、熱風(fēng)干燥卷丹與微波干燥卷丹、卷丹與金百合，在聚類(lèi)樹(shù)狀圖中將每一類(lèi)進(jìn)行標(biāo)記，分組顯示誤判個(gè)數(shù)為0，識(shí)別準(zhǔn)確率為100%，見(jiàn)圖6。

2.2? 王百合苷A含量差異性分析

2.2.1? 色譜條件

色譜柱為T(mén)hermo Hypersil Gold C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）;流動(dòng)相：乙腈-0.5%乙酸;梯度洗脫：0～13 min，2%～2%A;13～15.2 min，2%～5%A;15.2～17.5 min，5%～5%A;17.5～19.5 min，5%～12%A;19.5～22.0 min，12%～25%A;22.0～25.0 min，25%～50%A;25.0～27.0 min，50%～90%A;27.0～29.0 min，90%～95%A;29.0～31.05 min，95%～2%A;31.05～32.0 min，2%～2%A;流速：0.2 mL/min;柱溫：30 ℃;進(jìn)樣體積：2.00 μL;DAD選擇最大吸收波長(zhǎng)：309 nm。色譜圖見(jiàn)圖7。

2.2.2? 供試品溶液制備

取樣品干燥，粉碎，過(guò)200目篩，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%乙醇25 mL，避光靜置1 h，稱定質(zhì)量，超聲提?。üβ?50 W，頻率40 kHz）40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%乙醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾（0.22 μm），取續(xù)濾液，即得。

2.2.3? 對(duì)照品溶液制備

分別精密稱取王百合苷A對(duì)照品適量，置于量瓶中，加80%乙醇溶解稀釋，配制成濃度分別為0.556、0.680 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.4? 方法學(xué)考察

2.2.4.1? 精密度試驗(yàn)

選取對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行UPLC分析，連續(xù)測(cè)定6次，記錄色譜圖，王百合苷A峰保留時(shí)間RSD=0.02%，峰面積RSD=0.25%，表明本方法精密度好。

2.2.4.2? 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取樣品S14，平行制備6份供試品溶液，進(jìn)行UPLC分析，結(jié)果供試品溶液中王百合苷A峰保留時(shí)間RSD=0.04%，峰面積RSD=0.48%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.4.3? 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品S14，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫放置，分別于0、2、4、8、12、24 h，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行UPLC分析，結(jié)果24 h內(nèi)供試品溶液中王百合苷A保留時(shí)間RSD=0.04%，峰面積RSD=0.84%，表明本方法穩(wěn)定性良好。

2.2.4.4? 線性關(guān)系考察

精密量取王百合苷A對(duì)照品，置于量瓶中，加入80%乙醇溶解并稀釋，搖勻，配成濃度為0.5、10、50、100、333、500 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行UPLC分析，記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程Y=20.988X+35.254（r=0.999 2），線性范圍為1.0～1000 ng。

2.2.4.5? 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品（S14）粉末9份，每份0.5 g，每3份樣品分別精密加入1、2、4 mL王百合苷A對(duì)照品溶液。按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行UPLC分析，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果王百合苷A平均加樣回收率為102.43%，RSD=1.25%，表明回收率良好，見(jiàn)表2。色譜圖見(jiàn)圖8。

2.2.5? 樣品王百合苷A含量測(cè)定

取卷丹（12批次）、熱風(fēng)干燥卷丹（10批次）、百合（4批次）、金百合（3批次）和微波干燥卷丹（3批次）樣品，每批3份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰面積，并計(jì)算樣品中王百合苷A含量。結(jié)果表明，不同樣品中王百合苷A含量存在差異。卷丹的王百合苷A含量為2.09～3.28 mg/g，百合的王百合苷A含量為1.36～1.77 mg/g，金百合的王百合苷A含量為1.03～1.05 mg/g，微波干燥卷丹的王百合苷A含量為3.92～4.01 mg/g。卷丹和百合的王百合苷A含量明顯高于偽品金百合，而微波干燥卷丹相對(duì)普通的熱風(fēng)干燥卷丹的王百合苷A含量更高。

3? 討論

ATR-FTIR作為一種綠色、無(wú)損的樣品分析手段，結(jié)合OPLS-DA可以更好區(qū)分組間差異，提高模型的有效性和解析能力。通過(guò)ATR-FTIR結(jié)合OPLS-DA分析，可將卷丹與百合、微波干燥卷丹與熱風(fēng)干燥卷丹、卷丹與偽品金百合藥材粉末在OPLS-DA得分圖上區(qū)分開(kāi)（同品種樣本聚合，不同品種樣本離散）。在此基礎(chǔ)上，采用UPLC-DAD對(duì)百合主要化學(xué)成分王百合苷A進(jìn)行含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)不同批次樣品中王百合苷A含量存在明顯差異，微波干燥卷丹>卷丹>百合>金百合。王百合苷A為百合的主要化學(xué)成分，其分子結(jié)構(gòu)部分特征官能團(tuán)與百合藥材粉末紅外光譜推測(cè)的官能團(tuán)可能具有一定的關(guān)聯(lián)性。

百合作為湖南省大宗藥食兩用主產(chǎn)藥材，近年來(lái)市場(chǎng)需求旺盛。由于正品百合價(jià)格較高，百合和卷丹中摻雜金百合現(xiàn)象較為常見(jiàn)，而金百合相關(guān)研究報(bào)道較少。且藥材打粉后失去原有性狀，難以鑒別，因此采用ATR-FTIR結(jié)合UPLC-DAD技術(shù)快速鑒別百合藥材粉末具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

[1] 田亞平，陳洋，于雷，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定獸用中藥散劑中喹諾酮類(lèi)藥物的研究[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2015，31（5）：685-688.

[2] 陳雛，吳燕，李彬，等.UPLC法測(cè)定川芎生長(zhǎng)過(guò)程中6種主要成分的含量變化[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2018，30（6）：997-1001.

[3] CHEN J， SUN S， ZHOU Q. Rapid identification and quantification of carbohydrate excipients in Gardeniae Fructus formula granules by ATR-FTIR spectroscopy[J]. Analytical Methods，2016，8（47）：8329-8336.

[4] 王振杰，曹珍，趙建成，等.ATR-FTIR結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法快速鑒別15種遠(yuǎn)志藥材[J].中藥材，2017，40（4）：807-810.

[5] 薛漫清，梁慶，黃釗，等.利用ATR-FTIR變化探討薄荷醇對(duì)皮膚角質(zhì)層結(jié)構(gòu)的影響[J].中草藥，2012，43（12）：2474-2477.

[6] ZHAO Y， JI Z， YUAN T， et al. Discrimination of wild paris based on near infrared spectroscopy and high performance liquid chromatography combined with multivariate analysis[J]. PLoS One， 2014，9（2）：e89100.

[7] 羅林明，裴剛，覃麗，等.中藥百合化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中藥新藥與臨床藥理，2017，28（6）：824-837.

[8] 王昌華，舒抒，銀福軍，等.藥用百合正源考證研究[J].中國(guó)中藥雜志， 2018，43（8）：1732-1736.

[9] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：132.

[10] 張黃琴，嚴(yán)輝，錢(qián)大瑋，等.不同產(chǎn)地百合藥材中8種活性成分的分析與評(píng)價(jià)[J].中國(guó)中藥雜志，2017，42（2）：311-318.

[11] 聶慧，嚴(yán)輝，錢(qián)大瑋，等.加工方法對(duì)百合質(zhì)量的影響研究[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2013，15（4）：308-313.

[12] 袁志鷹，陳乃宏，周小江，等.原子熒光法測(cè)定龍山卷丹百合中砷、汞含量[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2018，25（3）：90-93.

[13] 袁志鷹，劉湘丹，裴剛，等.HPLC測(cè)定百合中對(duì)香豆酸、沒(méi)食子酸含量[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2018，25（5）：82-85.

[14] 袁志鷹，周小江，黃惠勇，等.湖南卷丹百合適生地環(huán)境指數(shù)特征分析及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，38（7）：750-754.

（收稿日期：2019-01-18）

（修回日期：2019-03-05;編輯：陳靜）

基金項(xiàng)目：國(guó)家中藥標(biāo)準(zhǔn)化項(xiàng)目（ZYBZH-Y-HUN-24）;國(guó)家中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目（201728）;湖南省自然科學(xué)基金（2019JJ50446）;長(zhǎng)沙市科技計(jì)劃（kq1801044）;湖南省中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)化及功能工程技術(shù)研究中心開(kāi)放基金（2018-02-01）;湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)一流學(xué)科（2018年）

通訊作者：黃惠勇，E-mail：huanghy68@126.com