安清明，吳震洋，孟金柱，趙園園，樊軍德，田秀珍，王 星

（1.銅仁學(xué)院，貴州 銅仁 554300；2.華珍牧業(yè)有限公司，貴州 銅仁 554300）

貴州白山羊是中國(guó)著名的地方山羊品種，主要分布在黔東南、黔東北等地區(qū)，存欄量100多萬(wàn)只，是發(fā)展貴州畜牧業(yè)的重要種質(zhì)資源。脂聯(lián)素（adiponectin，ADIPOQ）是脂肪細(xì)胞分泌的唯一與脂肪含量負(fù)相關(guān)的細(xì)胞因子，相關(guān)文獻(xiàn)表明，ADIPOQ基因在脂肪代謝中起重要的調(diào)控作用[1]，脂聯(lián)素基因由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，其主要編碼的脂聯(lián)素蛋白由信號(hào)肽、可變區(qū)、N-膠原蛋白三螺旋區(qū)域和C-球狀區(qū)域構(gòu)成，能夠通過(guò)結(jié)合蛋白直接參與調(diào)解脂肪酸氧化和糖類攝取過(guò)程[2]。目前，研究發(fā)現(xiàn)ADIPOQ基因與人體的肥胖、胰島素耐受性和動(dòng)脈粥樣硬化等疾病相關(guān)[3]，但在家畜動(dòng)物研究中發(fā)現(xiàn)ADIPOQ基因遺傳變異對(duì)家畜動(dòng)物的生產(chǎn)性狀具有一定的影響，如ADIPOQ基因變異可以影響豬的胴體性狀[4]，影響牛的眼肌面積、背標(biāo)厚度[5]，影響綿羊的生長(zhǎng)速度和胴體性狀等[6]。但在山羊中該基因的研究報(bào)道較少，僅發(fā)現(xiàn)954G/A變異可以影響山羊產(chǎn)羔數(shù)[7]。因此，本研究擬通過(guò)ADIPOQ基因的序列和表達(dá)分析，進(jìn)一步增進(jìn)貴州白山羊的遺傳多樣性和發(fā)育情況的了解，以期對(duì)貴州白山羊的合理利用提供一定的數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用的貴州白山羊血樣及組織樣均采自貴州省銅仁市德江縣高山鎮(zhèn)。采集的新鮮血樣和組織樣分別于-20℃和-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

Bio-Rad PCR儀，Bio-Rad 凝膠成像儀，高速低溫離心機(jī)，水平電泳儀，ABI實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，DNA提取試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，熒光定量試劑盒，PCR預(yù)混酶等。

1.3 PCR引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI中綿羊ADIPOQ基因序列（NC_019458.2），利用Primer 5.0 設(shè)計(jì)特異性引物：F：GGATTCTGAACATCATTCATTC，R:CAGATGAGTTGGTGGGAGAC，用于ADIPOQ基因序列分析；設(shè)計(jì)特異性引物F：TACAAGAACGACAAGGCCCT，R：ACTTGGTCACCCTTCTCCAG用于組織特異性表達(dá)分析，其中熒光定量分析以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因，特異性引物為F: CTGACCTGCCGCCTGGAGAAA，R:GTAGAAGAGTGAGTGTCGCTT，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 ADIPOQ基因部分序列PCR擴(kuò)增及測(cè)定

PCR反應(yīng)體系：DNA樣品1μl，Taq PCR預(yù)混酶11 μl，10 mmol·L-1上下游混合引物1 μl，加ddH2O至20μl。

PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，34個(gè)循環(huán)，延伸5 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)無(wú)特異性條帶后送生工生物工程（上海）測(cè)序。

1.5 遺傳多樣性數(shù)據(jù)處理

用MEGA5.0軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析比對(duì)，通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查找相關(guān)物種序列，建立數(shù)據(jù)庫(kù)，用Lasergene7.0軟件對(duì)相關(guān)物種序列進(jìn)行處理并建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 ADIPOQ基因?qū)崟r(shí)熒光定量分析

采用Trizol法提取貴州白山羊各組織（心、肝、脾、肺和腎）總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照說(shuō)RT-qPCR說(shuō)明書指導(dǎo)配置反應(yīng)體系并設(shè)定反應(yīng)程序。采用RT-qPCR方法分析ADIPOQ基因在白山羊心、肝、脾、肺和腎中的表達(dá)特異性。熒光定量試驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)重復(fù)，采用2-△△CT方法將數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，最后利用Minitab16.0進(jìn)行顯著性差異分析。

圖1 貴州白山羊ADIPOQ基因測(cè)序結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序結(jié)果分析

已知引物擴(kuò)增序列為455 bp，將檢測(cè)的DNA測(cè)序經(jīng)Chromas軟件進(jìn)行結(jié)果分析（圖1），結(jié)果顯示所用貴州白山羊樣品測(cè)定序列波峰信號(hào)單一，無(wú)其他雜亂信號(hào)干擾，預(yù)示測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確，可用于后續(xù)的序列分析。

2.2 貴州白山羊ADIPOQ基因差異性對(duì)比結(jié)果分析

利用MEGA5.0程序?qū)Ρ狙芯恐袦y(cè)得的貴州白山羊ADIPOQ基因序列與An等[6]發(fā)現(xiàn)的綿羊等位基因A和B進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)貴州白山羊與綿羊等位基因A和B共有8處核苷酸變異，分別為c.26 C/G、c.161 C/T、c.190 C/A、c.196 C/T、c.226 C/T、c.331 C/A、c.407 C/T和c.418 G/A變異，比對(duì)結(jié)果見圖2。

2.3 貴州白山羊ADIPOQ基因群體間遺傳特征

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索其它6個(gè)不同物種ADIPOQ基因與本試驗(yàn)檢測(cè)得到的貴州白山羊核苷酸序列根據(jù)領(lǐng)位相連法（Neighbor-joining，NJ法）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3），結(jié)果表明，貴州白山羊與綿羊遺傳距離最近，與牛和牦牛次之，而與豬、人類遺傳距離較遠(yuǎn)，這一結(jié)果與這些物種在生物學(xué)上進(jìn)化分類一致。

圖2 貴州白山羊與綿羊ADIPOQ基因核苷酸序列比對(duì)結(jié)果

圖3 不同物種ADIPOQ基因核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹

2.4 貴州白山羊ADIPOQ基因在不同組織中的表達(dá)分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)貴州白山羊心、肝、脾、肺和腎組織中的ADIPOQ基因編碼mRNA的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，由圖4可知，ADIPOQ基因在肺組織中的表達(dá)量最高，其次是脾、心和肝，在腎中的表達(dá)量最低。

圖4 貴州白山羊ADIPOQ基因編碼mRNA表達(dá)分析

3 討論

通過(guò)測(cè)序結(jié)果比對(duì)分析，雖然在貴州白山羊樣本里沒(méi)有發(fā)現(xiàn)核苷酸變異，但與綿羊不同等位基因比對(duì)發(fā)現(xiàn)8處核苷酸變異位點(diǎn)，說(shuō)明貴州白山羊與綿羊物種之間存在的種間差異，也可能是貴州白山羊樣品來(lái)源群體經(jīng)過(guò)了世代選擇，使得白山羊群體間核苷酸變異減少，但該結(jié)果也表明，白山羊與綿羊之間仍具有核苷酸變異，且這用變異差距可能會(huì)影響到貴州白山羊的生產(chǎn)性狀，已有研究表明ADIPOQ基因核苷酸變異可以影響豬、牛和綿羊的生產(chǎn)性狀[4-7]。本研究基于遺傳距離聚類算法構(gòu)建了貴州白山羊群體的聚類圖，通過(guò)與不同物種之間的聚類分析，推測(cè)了物種間的適應(yīng)性進(jìn)化，研究發(fā)現(xiàn)，貴州白山羊與綿羊間的遺傳距離最小，牛屬次之，這與物種的進(jìn)化關(guān)系一致，且它們均屬于偶蹄目家畜，與其它物種間的進(jìn)化距離較遠(yuǎn)。

對(duì)貴州白山羊內(nèi)臟器官進(jìn)行ADIPOQ基因編碼mRNA表達(dá)量檢測(cè)，結(jié)果表明在所檢測(cè)器官中均有表達(dá)，但在肺臟中表達(dá)量最高，在腎臟中表達(dá)量最低，這與李雪梅等研究結(jié)果存在差異[8]，但與陳宇光等研究結(jié)果相似，結(jié)果均發(fā)現(xiàn)ADIOQ基因mRNA在腎臟組織中的表達(dá)量最低[9]。本研究對(duì)貴州白山羊ADIPOQ基因序列和蛋白進(jìn)行了分析，分析結(jié)果有助于對(duì)ADPOQ基因序列變異和功能進(jìn)行深入研究，也為進(jìn)一步研究ADIPOQ基因?qū)F州白山羊生長(zhǎng)性能和脂肪累積過(guò)程中的功能奠定了遺傳信息基礎(chǔ)。