盧美琳，石嘉琛，王家敏，喬自林＊

（1.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心 甘肅省動物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心 生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室,甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

甘肅高山細(xì)毛羊是20世紀(jì)80年代初通過雜交改良培育的毛肉兼用的地方品種，適應(yīng)高海拔牧區(qū)，生產(chǎn)性能優(yōu)良的綿羊品種之一，種質(zhì)資源價值高[1，2]。甘肅高山細(xì)毛羊的肉質(zhì)營養(yǎng)含量豐富、營養(yǎng)價值高, 深受西北居民喜愛。我國通過國家科技基礎(chǔ)條件平臺項目《畜禽種質(zhì)資源的收集、整理和保存》的開展，保存優(yōu)良品種遺傳資源。因甘肅高山細(xì)毛羊是保存的重要品種之一，通過建立骨骼肌細(xì)胞等細(xì)胞庫從細(xì)胞水平上進(jìn)行資源保存。為評估保存細(xì)胞的質(zhì)量狀況，開展了該細(xì)胞的生物學(xué)特性和外源污染物的檢查。

1 材料

1.1 主要試劑及材料

甘肅高山細(xì)毛羊骨骼肌細(xì)胞，由西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心甘肅省動物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心從健康的雄性甘肅高山細(xì)毛羊采集經(jīng)培養(yǎng)后液氮中保存，保存的細(xì)胞代次為P4代。

DMEM/F12和0.25%胰蛋白酶(蘭州百靈生物，批號:20190409和20140425)、胎牛血清（蘭州民海生物，批號：20141002）、二苯甲酰胺熒光染料和秋水仙素（Sigma）等。

1.2 儀器設(shè)備

倒置生物顯微鏡（Olympus，CKX-41）、低速離心機(jī)（湖南奧鑫公司，LK-C）、普通顯微鏡（Olympus，CX21）、CO2培養(yǎng)箱（Thermo，3111）、細(xì)胞計數(shù)儀（Countstar，IC1000）、倒置熒光顯微鏡（Olympus，IX71）等。

2 方法

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

按常規(guī)方法復(fù)蘇甘肅高山細(xì)毛羊骨骼肌細(xì)胞，用DMEM/F12培養(yǎng)基(含10%胎牛血清+1%雙抗)培養(yǎng)，接種培養(yǎng)48 h后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況及其形態(tài)，待細(xì)胞匯合達(dá)到90%左右，常規(guī)方法消化傳代培養(yǎng)，分瓶比例為1:3。

2.2 生長曲線繪制

選P6代處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，用完全培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液，并計數(shù)。以1×104個/ml密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種1ml，置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔24 h用0.25%胰蛋白酶消化3孔計數(shù)。以培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標(biāo)，以細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線，并計算其倍增時間和最大增殖密度。

倍增時間[4]=T/A，A=log2（Y/X），式中X為初始接種細(xì)胞數(shù)，Y為細(xì)胞最大增殖密度前一天的細(xì)胞數(shù)，T為培養(yǎng)時間。

2.3 染色體分析

細(xì)胞處理：選處于對數(shù)生長期的甘肅高山細(xì)毛羊骨骼肌細(xì)胞，向細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)加入終濃度為0.1umol/L秋水仙素，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，棄掉上清液。

細(xì)胞消化：用0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，1 000 r/min離心8 min，棄上清液，加入0.4% KCL，室溫放置20 min。

細(xì)胞固定：加固定液（冰醋酸：甲醇=1:3），預(yù)固定10 min，1 000 r/min離心10 min收集沉淀細(xì)胞，再加固定液重懸細(xì)胞，在渦流混懸器上振蕩完全，在冰上靜止10 min。重復(fù)固定重懸一次。

滴片及拍照：取細(xì)胞懸液滴到預(yù)冷的玻片上，使細(xì)胞充分分散，待干燥后于鏡下觀察，選擇細(xì)胞均勻分散的玻片用Giemsa染色，顯微鏡下觀察清晰染色體并拍照。

染色體計數(shù)：用Photoshop軟件計數(shù)染色體。

2.4 外源支原體污染檢查

用不含雙抗的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)甘肅高山細(xì)毛羊骨骼肌細(xì)胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)3代，取待第3代細(xì)胞完全匯合，且3天未換液的細(xì)胞，連同細(xì)胞培養(yǎng)瓶放置-20℃反復(fù)3次凍融，離心取上清備用。

選用Vero細(xì)胞作為指示細(xì)胞，培養(yǎng)液中加20%上述制備上清液后連續(xù)傳代培養(yǎng)3代，待第三代培養(yǎng)3天后，棄掉培養(yǎng)液,加入固定液5ml,放置5min進(jìn)行預(yù)固定，第二次固定10 min，棄掉固定液，用PBS液洗三次，吸干PBS液后加二苯甲酰胺熒光染料工作液5ml,室溫避光孵育30 min，吸出染液，用蒸餾水洗3次,吸干水使其干燥用熒光顯微鏡觀察并拍照。用無抗生素培養(yǎng)基培養(yǎng)Vero細(xì)胞，作為陰性對照組。

用已知陽性的供試品標(biāo)準(zhǔn)菌株2ml替代供試品,同法操作,作為陽性對照組。

結(jié)果判定：陽性在細(xì)胞內(nèi)、外可見大小不等、不規(guī)則的藍(lán)色熒光顆粒, 或絲狀物。陰性僅見指示細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。

3 結(jié)果

3.1 形態(tài)學(xué)觀察

骨骼肌細(xì)胞復(fù)蘇活率為90%，培養(yǎng)48 h后細(xì)胞形態(tài)良好，呈梭型和不規(guī)則三角形，見圖1A所示；繼續(xù)培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)逐漸匯合，接觸更緊密，96 h后形成單層致密，以明顯的梭形細(xì)胞為主，見圖1B。

圖1 骨骼肌細(xì)胞形態(tài)

3.2 生長曲線

骨骼肌細(xì)胞P7代生長曲線呈標(biāo)準(zhǔn)的“S”型，見圖2。以1×104個/ml密度培養(yǎng)2天后，進(jìn)入對數(shù)生長期，在第9天細(xì)胞密度為4.03×105個/ml，達(dá)到最高值。其倍增時間為41.78 h，符合細(xì)胞的體外生長規(guī)律。

圖2 骨骼肌細(xì)胞生長曲線

3.3 染色體分析

用油鏡觀察挑選出形態(tài)清晰、分散良好的細(xì)胞染色體進(jìn)行拍照，用Photoshop軟件進(jìn)行細(xì)胞染色體計數(shù)，見圖3。骨骼肌細(xì)胞的染色體條數(shù)為54條。

圖3 骨骼肌細(xì)胞染色體圖

3.4 支原體檢查

未加待檢細(xì)胞培養(yǎng)上清液的Vero細(xì)胞作為陰性對照組，其結(jié)果是僅在細(xì)胞核中有藍(lán)色熒光出現(xiàn)見圖4A；試驗組只在細(xì)胞核有藍(lán)色熒光出現(xiàn)，而核外無任何熒光顆粒見圖4B；而陽性對照組除在細(xì)胞核有藍(lán)色熒光出現(xiàn)外，細(xì)胞核外也出現(xiàn)大小不等且不規(guī)則的藍(lán)色熒光著色顆粒，見圖4C；試驗組結(jié)果與陰性對照組結(jié)果一致。

圖4 支原體檢查（×40）

4 討論

甘肅高山細(xì)毛羊是我國1980年育成的第一個高山型細(xì)毛羊品種[4]，是甘肅特有的細(xì)毛羊品種[5]，為了防止種質(zhì)資源的流失，試驗從細(xì)胞水平對甘肅高山細(xì)毛羊骨骼肌細(xì)胞建立細(xì)胞庫，并對保存質(zhì)量進(jìn)行檢測。通過細(xì)胞形態(tài)可以評估細(xì)胞的保存的質(zhì)量，細(xì)胞生長曲線可以反映細(xì)胞的增殖能力；染色體核型分析來鑒定細(xì)胞系的性別來源和種屬來源的確切指標(biāo)[6]。保存的甘肅高山細(xì)毛羊骨骼肌細(xì)胞形態(tài)呈梭形，生長曲線呈“S”型，染色體為54條，無外源支原體污染，細(xì)胞形態(tài)良好，增殖速度快，倍增時間短，為二倍體細(xì)胞，無外源物污染，從細(xì)胞水平上成功保存了甘肅高山細(xì)毛羊的種質(zhì)資源。