李 嫚，涂瑞沙，余書勇，徐小江，尹俊峰

自身免疫性甲狀腺炎是指以機(jī)體自身甲狀腺組織作為抗原的自身免疫性疾病，又稱為橋本甲狀腺炎[1]。自身免疫性甲狀腺炎的發(fā)病機(jī)制與誘發(fā)因素較復(fù)雜，可能與遺傳、免疫及環(huán)境等多種因素有關(guān)，而甲狀腺抗體對(duì)機(jī)體而言視為破壞性抗體，會(huì)引起機(jī)體免疫調(diào)節(jié)發(fā)生改變[2]。目前該疾病無(wú)特定的治療措施，大部分患者是在甲狀腺功能減退的情況下才開始用藥治療[3]。夏枯草是唇形科、夏枯草屬的多年生草本植物，其干燥果穗可入藥，辛、苦、寒，具有清熱瀉火、明目、散結(jié)消腫的功效。夏枯草在抗菌、抗病毒、抗過(guò)敏、降血壓及血糖等方面均有顯著效果，臨床可將其用于高血壓、肺結(jié)核以及甲狀腺腫大等疾病治療[4]，還可以減輕大鼠記憶力損傷[5]。夏枯草膠囊的主要成分是夏枯草提取物，可以改善橋本甲狀腺炎患者的甲狀腺功能[6]，但關(guān)于其對(duì)自身免疫性甲狀腺炎的作用機(jī)制以及對(duì)機(jī)體自身免疫情況的研究報(bào)道較少。因此，本研究通過(guò)制備自身免疫性甲狀腺炎大鼠模型來(lái)探索夏枯草膠囊對(duì)其免疫指標(biāo)及NF-κB信號(hào)通路的影響，為自身免疫性甲狀腺炎臨床治療方案制定提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1試劑及儀器 夏枯草膠囊(國(guó)藥準(zhǔn)字Z19991033，聚協(xié)昌北京藥業(yè)有限公司，規(guī)格：0.35×10粒×2板)，全弗式佐劑(CFA)與不全弗式佐劑(IAF)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒(中國(guó)上海喬羽生物科技有限公司)，白介素-12(IL-12)試劑盒(中國(guó)北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司)，IL-10試劑盒(中國(guó)上海廣銳生物科技有限公司)，干擾素-γ(INF-γ)試劑盒(中國(guó)上海機(jī)純實(shí)業(yè)有限公司)，甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體(TPOAb)試劑盒(中國(guó)上海冠導(dǎo)生物工程有限公司)，甲狀腺球蛋白抗體(TGAb)試劑盒(中國(guó)上海茁彩生物科技有限公司)，NF-κB抗體(佰思諾天津生物科技有限公司)，顯微鏡(Ti2-U，NIKON)，切片機(jī)(HM 340E，賽默飛)。

1.2動(dòng)物及分組 SPF級(jí)SD雄性健康大鼠50只，4～5周齡，體質(zhì)量190～210 g，購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(粵)2016-0041，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，培育室溫度為20～25℃，濕度40%～50%，人工光照晝夜時(shí)間各12 h，飲水自由。將50只SD大鼠隨機(jī)分別為對(duì)照組、模型組、干預(yù)組，干預(yù)組又分為夏枯草低劑量組、夏枯草中劑量組、夏枯草高劑量組。每組10只。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1模型制備：制模過(guò)程參考文獻(xiàn)[7]，將甲狀腺球蛋白(PTg)與CFA等體積混合乳化液于大鼠足墊部皮下與背部皮下多位點(diǎn)注射，其中PTg注射劑量為每只100 μg，1次/周，連續(xù)2周，完成初次免疫；從第3周開始至第6周，將PTg與IAF等體積混合乳化液進(jìn)行注射，PTg劑量及皮下注射方式與上相同。

1.3.2藥物干預(yù)：各組大鼠第7周開始進(jìn)行藥物干預(yù)，根據(jù)夏枯草膠囊成年人服用的最大劑量、大鼠與成人藥物折算系數(shù)(W)6.25進(jìn)行換算，得出大鼠夏枯草膠囊的最大使用劑量為112 mg/100 g，夏枯草低、中、高劑量組大鼠分別進(jìn)行28、56、112 mg/(100 g·d)灌胃干預(yù)，模型組及對(duì)照組大鼠灌胃等體積的生理鹽水，連續(xù)干預(yù)4周。

1.4檢測(cè)指標(biāo) 藥物干預(yù)結(jié)束后，采取組織及血液，觀察各組大鼠甲狀腺病理組織變化，檢測(cè)甲狀腺激素水平[血清三碘甲狀腺素(T3)、甲狀腺素(T4)、促甲狀腺素(TSH)]、自身免疫抗體(TGAb、TPOAb)水平、炎性因子(IL-10、IL-12、TNF-α、INF-γ)水平以及甲狀腺組織中NF-κB蛋白水平，檢測(cè)各組大鼠甲狀腺組織中Bax、Bcl-2基因相對(duì)表達(dá)量。

1.4.1HE染色：末次給藥后次日，麻醉處死大鼠，取出甲狀腺組織，一部分甲狀腺組織固定于10%甲醛中性溶液中，經(jīng)常規(guī)石蠟切片，蘇木精、伊紅染色、脫水、透明、固定封片，于顯微鏡下觀察各組大鼠甲狀腺組織病理結(jié)構(gòu)。

1.4.2蛋白免疫印跡(Western blot)：將采集的甲狀腺組織一部分置于-80℃超低溫冰箱存儲(chǔ)，用于Western blot與RT-PCR實(shí)驗(yàn)，提取組織總蛋白，調(diào)整蛋白質(zhì)濃度，經(jīng)SDS-PAGE電泳、膜轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入NF-κB、β-actin一抗，于4℃條件下孵育過(guò)夜，再用TBST漂洗40 min，分為3次漂洗，再加入經(jīng)HRP標(biāo)記的二抗繼續(xù)孵育1 h，根據(jù)ECL試劑盒說(shuō)明書對(duì)蛋白條帶進(jìn)行顯影、定影，觀察各組蛋白條帶成像情況，并進(jìn)行蛋白條帶分析。

1.4.3RT-PCR：采用Trizol試劑盒提取甲狀腺組織的總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，參考RT-PCR試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行PCR反應(yīng)體系配比、擴(kuò)增體系設(shè)置，所用內(nèi)參基因及Bax、Bcl-2引物均由上海生工提供，以2-ΔΔCt計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4.4甲狀腺激素、自身免疫抗體及炎性因子檢測(cè)：末次給藥后次日，麻醉各組大鼠，采取心臟血2 ml，3000 r/min離心20 min，取上層血清用于實(shí)驗(yàn)，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)TGAb、TPOAb、T3、T4、TSH、IL-10、IL-12、TNF-α、INF-γ水平，詳細(xì)操作過(guò)程參考試劑盒說(shuō)明書。

2 結(jié)果

2.1大鼠甲狀腺組織病理情況比較 采用HE染色觀察各組大鼠甲狀腺組織病理情況，結(jié)果顯示對(duì)照組甲狀腺濾泡形狀橢圓形，且大小均勻排列，濾泡中充滿膠質(zhì)，無(wú)炎性浸潤(rùn)；模型組大鼠甲狀腺濾泡形狀不規(guī)則，有劈裂情況，且濾泡間隙增大，濾泡中膠質(zhì)較少，有明顯炎性浸潤(rùn)；夏枯草組甲狀腺濾泡形態(tài)較模型組規(guī)則，濾泡腔內(nèi)含有膠質(zhì)，炎性浸潤(rùn)減少。見圖1。

2.2大鼠T3、T4、TSH比較 模型組與夏枯草低、中、高劑量組血清T3、T4、TSH水平均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；夏枯草低、中、高劑量組血清T3、T4、TSH水平低于模型組，且隨著劑量的增加而逐漸降低(P<0.05)。見表1。

表1 5組大鼠血清T3、T4、TSH水平比較

注：夏枯草低、中、高劑量組分別給予夏枯草膠囊28、56、112 mg/(100 g·d)；T3為血清三碘甲狀腺素，T4為甲狀腺素，TSH為促甲狀腺素；與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，cP<0.05；與夏枯草低劑量組比較，eP<0.05；與夏枯草中劑量組比較，gP<0.05

2.3大鼠自身免疫抗體水平 模型組與夏枯草低、中、高劑量組TGAb、TPOAb水平均高于對(duì)照組(P<0.05)；夏枯草低、中、高劑量組TGAb、TPOAb水平均低于模型組，且隨著劑量的增加而逐漸降低(P<0.05)。見表2。

2.4大鼠血清炎性因子水平 模型組與夏枯草低、中、高劑量組血清IL-12、TNF-α、INF-γ水平高于對(duì)照組，而IL-10水平低于對(duì)照組(P<0.05)；夏枯草低、中、高劑量組血清IL-12、TNF-α、INF-γ水平低于模型組，而IL-10水平高于模型組，且呈劑量依賴性(P<0.05)。見表3。

表2 5組大鼠TGAb、TPOAb水平比較

注：夏枯草低、中、高劑量組分別給予夏枯草膠囊28、56、112 mg/(100 g·d)；TGAb為甲狀腺球蛋白抗體，TPOAb為甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體；與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，cP<0.05；與夏枯草低劑量組比較，eP<0.05；與夏枯草中劑量組比較，gP<0.05

表3 5組大鼠血清炎性因子水平比較

注：夏枯草低、中、高劑量組分別給予夏枯草膠囊28、56、112 mg/(100 g·d)；IL-10為白介素-10，IL-12為白介素-12，TNF-α為腫瘤壞死因子-α，INF-γ為干擾素-γ；與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，cP<0.05；與夏枯草低劑量組比較，eP<0.05；與夏枯草中劑量組比較，gP<0.05

2.5大鼠NF-κB、Bax、Bcl-2水平 模型組與夏枯草低、中、高劑量組NF-κB蛋白水平高于對(duì)照組，Bcl-2 mRNA水平低于對(duì)照組(P<0.05)；模型組Bax mRNA水平高于對(duì)照組，夏枯草低、中、高劑量組Bax mRNA水平均低于對(duì)照組(P<0.05)；夏枯草低、中、高劑量組NF-κB蛋白和Bax mRNA水平均低于模型組，而Bcl-2 mRNA水平高于模型組(P<0.05)。見圖2、表4。

圖2 5組大鼠甲狀腺組織NF-κB蛋白水平蛋白免疫印跡結(jié)果

1.對(duì)照組；2.模型組；3.夏枯草低劑量組；4.夏枯草中劑量組；5.夏枯草高劑量組

表4 5組大鼠甲狀腺組織NF-κB蛋白與Bax、Bcl-2基因水平比較

注：夏枯草低、中、高劑量組分別給予夏枯草膠囊28、56、112 mg/(100 g·d)；與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，cP<0.05；與夏枯草低劑量組比較，eP<0.05；與夏枯草中劑量組比較，gP<0.05

3 討論

自身免疫性甲狀腺炎屬于免疫性疾病，臨床常采用甲狀腺激素替代治療、免疫治療等措施，病情嚴(yán)重者會(huì)采取手術(shù)治療。西藥在自身免疫性甲狀腺炎治療過(guò)程中取得較好療效，尤其當(dāng)患者出現(xiàn)其他急癥時(shí)，西藥治療可以快速緩解患者的病情，但是單純西醫(yī)治療也存在不良反應(yīng)多的局限性。中醫(yī)認(rèn)為自身免疫性甲狀腺炎屬于“癭病”及“虛勞”的范疇，其發(fā)病與飲食失調(diào)、七情內(nèi)傷、先天失養(yǎng)等多種因素有關(guān)。夏枯草膠囊是夏枯草中藥制劑，具有抗病毒、抗炎以及降血糖等多種功效，廣泛應(yīng)用于臨床[8]。本研究結(jié)果顯示，自身免疫性甲狀腺炎大鼠的甲狀腺濾泡呈現(xiàn)出形狀不規(guī)則，間隙較大且其中膠質(zhì)較少，還有炎性浸潤(rùn)，而夏枯草膠囊干預(yù)可以明顯減輕這種病理變化，表明夏枯草膠囊對(duì)自身免疫性甲狀腺炎大鼠的甲狀腺組織結(jié)構(gòu)損傷有較好的保護(hù)作用。

甲狀腺能夠調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝速度、機(jī)體合成蛋白以及調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)多種激素的敏感性，行使這些功能主要是通過(guò)甲狀腺素來(lái)實(shí)現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示，模型組血清T3、T4水平升高，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)血清TSH、TGAb、TPOAb含量也增加，提示自身免疫性甲狀腺炎大鼠的甲狀腺功能呈現(xiàn)出減退情況。夏枯草膠囊干預(yù)后可以降低大鼠血清T3、T4、TSH、TGAb、TPOAb含量，此結(jié)果與俞靈鶯等[9]研究結(jié)果相似，由此表明夏枯草膠囊可以改善自身免疫性甲狀腺炎大鼠的甲狀腺功能。甲狀腺組織病理結(jié)果以及機(jī)體血清學(xué)指標(biāo)均表明自身免疫性甲狀腺炎大鼠的甲狀腺功能存在損傷，而夏枯草膠囊干預(yù)治療可以緩解這種情況，也證實(shí)夏枯草膠囊確實(shí)可以用于治療此類疾病。

淋巴細(xì)胞以及自身抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)也參與自身免疫性甲狀腺炎的發(fā)生，如Th細(xì)胞介導(dǎo)產(chǎn)生的炎性因子。Th1細(xì)胞可以分泌TNF-α以及INF-γ等細(xì)胞因子，參與機(jī)體細(xì)胞免疫[10]。Th2細(xì)胞可以分泌IL-10、IL-6等因子，參與機(jī)體體液免疫[11]。IL-12主要是由B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，能夠促進(jìn)活性T細(xì)胞增殖，促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，同時(shí)還可以誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)與NK細(xì)胞的毒性并促進(jìn)其分泌TNF-α、INF-γ等細(xì)胞因子[12-13]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清IL-12、TNF-α、INF-γ水平增高，IL-10含量降低，而夏枯草膠囊干預(yù)后可以降低大鼠血清IL-12、TNF-α、INF-γ水平，提高IL-10含量。王永清等[14]認(rèn)為夏枯草可通過(guò)有效降低毒性彌漫性甲狀腺炎患者自身抗體水平來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體的異常免疫功能，減輕機(jī)體的炎性反應(yīng)，改善患者甲狀腺功能。由此推測(cè)夏枯草膠囊可能通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體IL-12、TNF-α、INF-γ、IL-10水平來(lái)降低自身免疫性甲狀腺炎大鼠機(jī)體炎性反應(yīng)。TNF-α作為促炎因子之一，其與體內(nèi)多種炎性信號(hào)通路活化有關(guān)，包括NF-κB信號(hào)通路。在免疫性疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，TNF-α能夠激活NF-κB信號(hào)通路，再反向啟動(dòng)TNF-α的轉(zhuǎn)錄，形成正反饋環(huán)[15]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠甲狀腺組織中的NF-κB蛋白水平明顯高于對(duì)照組，由此推測(cè)，NF-κB信號(hào)通路在自身免疫性甲狀腺炎大鼠呈現(xiàn)出活化狀態(tài)。

Cho等[16]研究發(fā)現(xiàn)，夏枯草水性提取物可以通過(guò)抑制NF-κB/Snail信號(hào)通路以及調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白水平抑制腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移，具有抑制惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的活性。本研究結(jié)果顯示，夏枯草膠囊干預(yù)治療可以降低自身免疫性甲狀腺炎大鼠NF-κB蛋白水平，由此推測(cè)夏枯草膠囊可以抑制自身免疫性甲狀腺炎大鼠NF-κB信號(hào)通路激活。激活NF-κB信號(hào)通路不僅可以促進(jìn)TNF-α轉(zhuǎn)錄，還可以促進(jìn)其下游凋亡、增殖等相關(guān)蛋白表達(dá)，參與機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)、炎性反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡等多種生理或病理過(guò)程[17]。Bcl-2基因過(guò)量表達(dá)可以抑制細(xì)胞凋亡，Bax基因過(guò)量表達(dá)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，二者在細(xì)胞凋亡進(jìn)程起著拮抗作用[18-19]。本研究結(jié)果顯示，夏枯草可以降低自身免疫性甲狀腺炎大鼠Bax基因表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2基因表達(dá)。余欣然等[7]研究顯示，夏枯草膠囊可以抑制甲狀腺濾泡細(xì)胞的凋亡，從而減輕甲狀腺功能損傷。祁崗等[20]研究顯示，自身免疫性甲狀腺炎小鼠甲狀腺組織中Bcl-2呈現(xiàn)出高表達(dá)現(xiàn)象，本研究結(jié)果與報(bào)道不一致，分析原因?yàn)榭赡苓€存在其他作用途徑來(lái)調(diào)控基因表達(dá)，還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，夏枯草膠囊對(duì)自身免疫性甲狀腺炎大鼠的甲狀腺功能有一定的改善作用，還能調(diào)節(jié)機(jī)體自身免疫抗體水平，可能是通過(guò)降低IL-12、TNF-α、INF-γ水平，增加IL-10含量來(lái)減輕機(jī)體的炎性反應(yīng)，還有可能是通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路活化，降低其介導(dǎo)的炎性反應(yīng)；同時(shí)還可以影響凋亡相關(guān)基因表達(dá)，但其中作用機(jī)制還需要更深層次研究。