陳 敏，王 丹，閔可憐，湛曉蝶，劉 玲

（1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽(yáng) 621000；2.西南科技大學(xué)核廢物與環(huán)境安全國(guó)防重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 綿陽(yáng) 621000）

【研究意義】核素90Sr、137Cs是核裂變反應(yīng)的主要放射性產(chǎn)物，核試驗(yàn)、核事故和核武器的使用等導(dǎo)致核素90Sr、137Cs大量釋放到環(huán)境中，大氣中的放射性核素污染物隨降水進(jìn)入土壤環(huán)境［1］。90Sr、137Cs半衰期較長(zhǎng)，進(jìn)入環(huán)境很難清除，容易通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，對(duì)人體產(chǎn)生危害［2］。目前對(duì)土壤核素污染的監(jiān)測(cè)方法主要是取樣檢測(cè)法［3］，這種監(jiān)測(cè)方式工作量大，監(jiān)測(cè)成本高且不具有長(zhǎng)期性和連續(xù)性。在實(shí)際應(yīng)用中多采用生物監(jiān)測(cè)與理化監(jiān)測(cè)相結(jié)合的方式，可以真實(shí)有效全面反映污染對(duì)環(huán)境的危害。早在1987年我國(guó)就開(kāi)始了生物監(jiān)測(cè)工作，在水體、土壤、大氣等領(lǐng)域開(kāi)展生物監(jiān)測(cè)并取得了多方面的應(yīng)用成果［4］。隨著我國(guó)加大對(duì)核資源的開(kāi)發(fā)利用，造成核廢棄物、廢渣的產(chǎn)生，無(wú)疑增加了環(huán)境放射性污染的可能性［5-6］。因此，做好核素污染監(jiān)測(cè)和防治是一項(xiàng)勢(shì)在必行的工作，具有一定的前瞻性。

【前人研究進(jìn)展】當(dāng)環(huán)境發(fā)生改變時(shí)，生物針對(duì)環(huán)境變化做出適應(yīng)性改變，植物對(duì)不同脅迫產(chǎn)生的特征反應(yīng)，對(duì)環(huán)境有直接或間接的指示作用。核素和重金屬等脅迫在植物個(gè)體水平、細(xì)胞水平、分子水平各級(jí)產(chǎn)生影響［7-9］；對(duì)植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)有抑制作用，使植物外觀(guān)表現(xiàn)出病態(tài)特征［10］；對(duì)植物的生殖生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，影響植物開(kāi)花結(jié)果等［11-14］。研究Sr、Cs對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響，以期從眾多植物中尋找到敏感植物，為土壤核素Sr、Cs污染的生物監(jiān)測(cè)打下良好基礎(chǔ)。

【本研究切入點(diǎn)】目前已有大量關(guān)于生物監(jiān)測(cè)的研究報(bào)道，主要在大氣和水體污染方面取得了良好效果。由于土壤環(huán)境的復(fù)雜情況，鮮有針對(duì)土壤核素Sr、Cs污染，利用高等植物作為指示植物的研究。有研究發(fā)現(xiàn)，三葉草對(duì)大氣污染敏感［15］，有作為敏感植物的特征。同時(shí)，在植物修復(fù)領(lǐng)域，豆科植物對(duì)重金屬污染更為敏感，三葉草是豆科植物中很受歡迎的研究材料，對(duì)重金屬具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)運(yùn)能力［16-17］。其生長(zhǎng)快速，用途廣泛，常被用作草坪綠植，牧草、綠肥等，具有很大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究選取豆科植物三葉草作為試驗(yàn)材料，參照前人研究設(shè)置極低處理濃度，在環(huán)境條件更單一的水培環(huán)境中，分別研究Sr、Cs和Sr+Cs處理對(duì)植物生長(zhǎng)和生理生化的影響，對(duì)以高等植物作為土壤污染指示植物進(jìn)行初探。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植物為三葉草（Trifolium pratenseL.），種子購(gòu)于江蘇省宿遷市輝煌花木院。供試試劑SrCl2·6H2O和CsCl購(gòu)于綿陽(yáng)市信捷商貿(mào)有限責(zé)任公司。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2018年10月26日至2019年1月在西南科技大學(xué)溫室進(jìn)行。三葉草種子在育苗盆中用河沙∶珍珠巖=3∶1基質(zhì)育苗，待植株生長(zhǎng)到4片真葉時(shí)進(jìn)行移栽。試驗(yàn)采取盆栽水培方法，每盆（長(zhǎng)43.5 cm×寬20 cm×高14 cm）加入Hogland營(yíng)養(yǎng)液5 L（營(yíng)養(yǎng)液參照張曉雪等［18］的方法進(jìn)行配制，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)制pH 6.0）。純營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)7 d，待三葉草適應(yīng)水培環(huán)境后，更換營(yíng)養(yǎng)液并一次性添加SrCl2·6H2O和CsCl溶液。試驗(yàn)設(shè)3種處理，每種處理設(shè)置4個(gè)水平，分別為0.1、0.5、1、2 mg/L，Sr處理分別表示為Sr 0.1、Sr 0.5、Sr 1.0、Sr 2.0，Cs處理分別表示為Cs 0.1、Cs 0.5、Cs 1.0、Cs 2.0，Sr+Cs（1∶1）處理分別表示為（Sr+Cs）0.1、（Sr+Cs）0.5、（Sr+Cs）1.0、（Sr+Cs）2.0，以只含營(yíng)養(yǎng)液的空白處理作對(duì)照（CK）。每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1盆，共39盆，每盆定植10株，共390株。每隔1 d向盆中打入等量空氣，補(bǔ)充氧氣，同時(shí)觀(guān)察記錄三葉草生長(zhǎng)情況。每隔10 d向盆中補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)液，保證三葉草正常生長(zhǎng)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

盆栽培養(yǎng)45 d統(tǒng)計(jì)三葉草植株冠徑、葉面積、單株黃葉率等生長(zhǎng)指標(biāo)。培養(yǎng)50 d，每盆收獲8株三葉草，剪取植物葉片鮮樣保存測(cè)定相關(guān)生理生化指標(biāo)。用電子天平稱(chēng)量鮮重后烘干至恒重稱(chēng)取干重。

1.3.1 三葉草生理生化指標(biāo)測(cè)定 用硫代巴比妥酸（TBA）加熱比色法［19］測(cè)定植物葉片丙二醛（MDA）含量，用95%乙醇浸提比色法［20］測(cè)定葉片葉綠素含量；在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，每隔1 d觀(guān)察記錄1次三葉草生長(zhǎng)狀況，在試驗(yàn)處理后50 d統(tǒng)計(jì)各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)。

1.3.2 植株Sr、Cs含量測(cè)定 將植物烘干樣品研磨成粉末，稱(chēng)取0.5 g，加入10 mL硝酸（分析純）、5 mL高氯酸（分析純）于消解爐上消解至透明，然后每30 min趕酸1次，待酸霧趕盡冷卻后定容至10 mL，采用火焰原子吸收光譜法［21］測(cè)定樣品Sr、Cs含量。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用采用Microsoft Excel 2007和SPSS 25.0軟件進(jìn)行處理和單因素方差分析及多重比較。圖表采用Origin 9.0繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sr、Cs、Sr+Cs處理對(duì)三葉草生長(zhǎng)的影響

2.1.1 不同處理對(duì)三葉草各生長(zhǎng)指標(biāo)的影響 由表1可知，Sr處理對(duì)三葉草單株葉面積有顯著促進(jìn)作用，且隨處理濃度的升高呈下降趨勢(shì)，其中Sr0.1處理的葉面積比對(duì)照高8.6%，其余生長(zhǎng)指標(biāo)與對(duì)照無(wú)顯著差異。Cs處理對(duì)三葉草植株冠徑、單株葉面積、地上部鮮重均有顯著抑制作用，表現(xiàn)為Cs0.1、Cs0.5、Cs1.0、Cs2.0處理植株冠徑比對(duì)照分別低35.0%、25.0%、34.9%、28.0%，單株葉面積比對(duì)照分別低31.6%、32.4%、38.2%、41.7%，地上部鮮重比對(duì)照分別低46.2%、42.7%、41.7%、48.0%； Cs2.0處理三葉草地部鮮重顯著低于對(duì)照33.8%，其余Cs處理三葉草地下部鮮重與對(duì)照無(wú)顯著差異，說(shuō)明較低濃度Cs處理對(duì)三葉草地下部生長(zhǎng)影響不大。Sr+Cs處理三葉草各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)均顯著低于對(duì)照，表現(xiàn)為（Sr+Cs）0.1、（Sr+Cs）0.5、（Sr+Cs）1.0、（Sr+Cs）2.0處理植株冠徑比對(duì)照分別低31.6%、37.1%、29.5%、34.8%，單株葉面積比對(duì)照分別低16.8%、17.4%、19.4%、21.1%，地上部鮮重比對(duì)照分別低47%、51.6%、52.4%、59.9%，地下部鮮重比對(duì)照分別低26.2%、41.6%、43.9%、47.8%，表明Sr+Cs復(fù)合處理對(duì)三葉草地下部生長(zhǎng)抑制作用更強(qiáng)。

表1 Sr、Cs和Sr+Cs不同處理對(duì)三葉草各生長(zhǎng)指標(biāo)的影響Table 1 Effects of Sr, Cs and Sr+Cs treatments on the growth indicators of clover

2.1.2 不同處理三葉草葉片黃化表現(xiàn) 三葉草經(jīng)Sr、Cs和Sr+Cs處理后的前15 d生長(zhǎng)緩慢，未觀(guān)察到黃化葉片。處理后17 d，首先在Cs 2.0處理發(fā)現(xiàn)三葉草葉片表現(xiàn)異常（圖1 A），少數(shù)葉片出現(xiàn)邊緣黃化；在之后的觀(guān)察中發(fā)現(xiàn)，Cs處理和Sr+Cs處理的三葉草葉片陸續(xù)出現(xiàn)此現(xiàn)象，圖1B～D為葉片黃化過(guò)程，葉片黃化從邊緣開(kāi)始，逐漸向葉片中心蔓延，最終整個(gè)葉片黃化壞死。從整株來(lái)看，葉片黃化從植株底部老葉開(kāi)始向生長(zhǎng)點(diǎn)發(fā)展，嚴(yán)重的植株出現(xiàn)大量葉片黃化，但沒(méi)有植株徹底死亡。處理后45 d統(tǒng)計(jì)的三葉草單株黃葉率如圖2所示，可以看出Sr處理各濃度間三葉草單株黃葉率與對(duì)照無(wú)顯著差異；Cs和Sr+Cs處理下三葉草單株黃葉率隨處理濃度升高而逐漸上升，最高分別為38.2%、39.9%，在濃度大于0.5 mg/L時(shí)Sr+Cs處理下黃葉率大于Cs處理，說(shuō)明當(dāng)Sr、Cs復(fù)合處理對(duì)三葉草生長(zhǎng)影響更大。

圖1 三葉草生長(zhǎng)過(guò)程中葉片黃化表現(xiàn)Fig.1 Leaf yellowing performance in the growth of clover

圖2 三葉草單株黃葉率Fig.2 Yellow leaf rate of per plant of clover

2.1.3 不同處理對(duì)三葉草生物量的影響 植物生物量變化可以直接表明重金屬對(duì)植物生長(zhǎng)的影響。如圖3所示，比較3種處理三葉草地上部干質(zhì)量的大小關(guān)系可知，Sr處理下，僅Sr2.0處理地上部干質(zhì)量顯著低于對(duì)照；Cs處理和Sr+Cs處理下，地上部干質(zhì)量均顯著低于對(duì)照，以Cs2.0和（Sr+Cs）1.0處理的干質(zhì)量最低，比對(duì)照分別低48%和56%。比較3種處理三葉草地下部干質(zhì)量的大小關(guān)系可知，僅Sr+Cs處理的地下部干質(zhì)量顯著低于對(duì)照，以（Sr+Cs）1.0處理的干質(zhì)量最低，比對(duì)照低44%。綜上所述，Sr+Cs處理對(duì)三葉草的抑制作用最顯著，其次為Cs處理，Sr處理對(duì)三葉草生長(zhǎng)的影響較小。

圖3 三葉草植株地上部、地下部生物量Fig.3 Average shoot and root biomass of per plant of clover

2.2 Sr、Cs和Sr+Cs處理對(duì)三葉草生理生化的影響

2.2.1 不同處理對(duì)三葉草葉片MDA含量的影響 MDA是植物膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物，其含量間接反映植物膜脂過(guò)氧化程度和植物所受的逆境脅迫。由圖4可知，三葉草葉片MDA含量在3種處理下均隨處理濃度升高而逐漸增加，其中Sr處理濃度1.0 mg/L、Cs 處理濃度0.5 mg/L、Sr+Cs處理濃度1.0 mg/L時(shí)，三葉草葉片MDA含量顯著高于對(duì)照，說(shuō)明三葉草葉片MDA含量對(duì)Cs處理濃度更敏感；Cs 2.0處理三葉草葉片MDA含量最高達(dá)35.06 nmol/g，為對(duì)照的2.06倍，而（Sr+Cs）0.1處理下三葉草葉片MDA含量低于對(duì)照，隨后逐漸升高且顯著高于對(duì)照。綜上所述，三葉草葉片膜脂過(guò)氧化程度隨處理濃度升高而逐漸加重。

圖4 三葉草葉片MDA含量比較Fig.4 Comparison of MDA contents in leaves of clover

2.2.2 不同處理對(duì)三葉草葉片葉綠素含量的影響 植物葉綠素含量直接影響植物光合作用，與植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和葉片黃化密切相關(guān)。由圖5可知，Sr處理三葉草葉片葉綠素含量隨處理濃度升高逐漸降低，與對(duì)照差異不顯著；Cs 0.1、Cs 0.5、Cs 2.0處理三葉草葉片葉綠素總含量顯著低于對(duì)照，比對(duì)照分別低40%、53%、43%；（Sr+Cs）0.1、（Sr+Cs）1.0處理葉片葉綠素總含量顯著低于對(duì)照，比對(duì)照分別低32%、35%。綜上結(jié)果表明，Cs處理和Sr+Cs處理三葉草葉片葉綠素合成受到顯著抑制，植株形態(tài)發(fā)生明顯變化，葉面積減小，葉片黃化數(shù)量增多。

圖5 三葉草葉片葉綠素總含量比較Fig.5 Comparison of chlorophyll contents in leaves of clover

2.3 三葉草植株對(duì)Sr、Cs吸收情況比較

由圖6A可知，三葉草地上部和地下部Sr含量均隨Sr處理濃度的升高而顯著升高，其地上部Sr含量在0.49～1.89 mg/kg之間，地下部Sr含量在0.31～1.13 mg/kg之間，在Sr處理濃度2.0 mg/L時(shí)植株Sr含量達(dá)到最高，且表現(xiàn)為地上部＞地下部，表明三葉草對(duì)Sr有一定的轉(zhuǎn)運(yùn)能力。由圖6 B可知，三葉草地上部和地下部Cs含量均隨Cs處理濃度的升高而顯著升高，其地上部Cs含量在1.80～14.54 mg/kg之間，地下部Cs含量在1.65～11.25 mg/kg之間，在Cs處理濃度2.0 mg/L時(shí)植株Cs含量達(dá)到最高。在單一Cs處理濃度超過(guò)0.1 mg/kg時(shí)，三葉草地上部Cs含量高于地下部；Sr+Cs處理三葉草地上部Cs含量高于地下部，說(shuō)明三葉草對(duì)Cs具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)運(yùn)能力。比較圖6A與圖6B，在同一濃度Sr+Cs處理下，三葉草對(duì)Cs有更強(qiáng)的積累能力，其地上部和地下部Cs含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Sr含量。綜上所述，三葉草對(duì)Sr的積累量較低，對(duì)三葉草生長(zhǎng)的影響較小，對(duì)Cs積累量較高，使三葉草生長(zhǎng)受到影響，且表現(xiàn)出受脅迫特征。

3 討論

對(duì)土壤Sr、Cs污染的研究主要針對(duì)植物修復(fù)方面，研究者往往重點(diǎn)關(guān)注植物對(duì)Sr和Cs耐受性、生物量大小、吸收能力以及轉(zhuǎn)運(yùn)能力等，以期篩選出超富集植物。本研究中，參照前人［18,22-23］研究的基礎(chǔ)，設(shè)置了比以往研究更低的濃度，表現(xiàn)出Cs處理比Sr處理對(duì)三葉草生長(zhǎng)抑制作用更大。唐永金等［24］研究在高濃度Sr、Cs（500 mg/kg）處理下，Sr處理植物生長(zhǎng)更好。有研究表明，低濃度Sr處理對(duì)植物生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，高濃度Sr抑制植物生長(zhǎng)［25］。本研究中，Sr處理對(duì)三葉草生長(zhǎng)無(wú)顯著影響，但其單株葉面積顯著增加，可能是由于三葉草對(duì)Sr的吸收量較小且三葉草對(duì)Sr不敏感，因此與對(duì)照無(wú)顯著差異。洪曉曦等［26］研究發(fā)現(xiàn)，低濃度Cs處理對(duì)油菜生長(zhǎng)發(fā)育有促進(jìn)作用，而高濃度Cs處理油菜生長(zhǎng)受到抑制，株高、生物量、葉綠素含量、POD活性都呈下降趨勢(shì)。本研究中，添加Cs的處理濃度較低，但Cs處理和Sr+Cs處理對(duì)三葉草的生長(zhǎng)具有抑制作用，表現(xiàn)為植株冠徑、單株葉面積、植株鮮重和葉綠素含量等均顯著低于對(duì)照，表明三葉草對(duì)Cs處理較為敏感。

本研究結(jié)果表明，三葉草葉片MDA含量隨3種處理濃度的升高呈顯著上升的趨勢(shì)，與安冰等［22］、儲(chǔ)玲等［27］的研究結(jié)果一致。這表明Sr處理對(duì)三葉草的影響首先表現(xiàn)在生理水平，其生長(zhǎng)表現(xiàn)與對(duì)照無(wú)顯著差異，可能原因是三葉草對(duì)Sr的吸收量還不足以打破三葉草生理平衡以及三葉草對(duì)Sr、Cs的響應(yīng)程度不同。在Cs處理和Sr+Cs處理下，三葉草無(wú)論是在生理水平和個(gè)體水平均表現(xiàn)出脅迫反應(yīng)，進(jìn)一步表明三葉草對(duì)Cs的敏感性。有研究表明，重金屬脅迫會(huì)影響植物葉綠素的合成，進(jìn)而影響植物光合作用合成有機(jī)物，使植物生長(zhǎng)受到抑制，表現(xiàn)出黃葉現(xiàn)象［28］。本研究中，Sr處理三葉草的生長(zhǎng)與對(duì)照無(wú)顯著差異，且其葉片葉綠素含量與對(duì)照亦無(wú)顯著差異，這與多數(shù)低Sr促進(jìn)葉綠素形成的研究結(jié)果存在差異［29］，其原因可能為不同植株對(duì)Sr的抗逆性存在明顯差異。然而，Cs處理和Sr+Cs處理，三葉草葉片明顯黃化，且葉片葉綠素含量顯著低于對(duì)照，這與武慧斌［30］研究中Cs處理紅三葉草葉綠素含量降低的結(jié)果一致。

不同植物對(duì)Sr、Cs的吸收能力不同，有的植物對(duì)Cs的吸收能力大于對(duì)Sr的吸收能力［18,31］，有的植物則相反［23］，但均表現(xiàn)為植物體內(nèi)Sr、Cs含量隨處理濃度的升高而升高［22,24,32］。本研究3種處理下三葉草對(duì)Cs的吸收能力均強(qiáng)于對(duì)Sr的吸收能力，兩種元素的含量均隨處理濃度的升高而逐漸升高。有研究報(bào)道，Sr和Ca具有相似化學(xué)性質(zhì)，Ca的存在會(huì)降低植物對(duì)Sr的吸收［33］，試驗(yàn)所用營(yíng)養(yǎng)液Ca離子豐富，這可能是三葉草對(duì)Sr吸收量較小的原因。三葉草地上部Cs含量也大于其地下部，Hampton等［34］、White等［35］、Qi等［36］報(bào)道的Cs毒性機(jī)理表明，植物對(duì)K和Cs的吸收依賴(lài)同一載體，二者具有競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。楊俊誠(chéng)等［37］研究表明，在Cs污染的土壤中施加K可有效減少植株對(duì)Cs的吸收。此外，植物在缺少K元素時(shí)葉片也會(huì)表現(xiàn)出葉緣呈黃色或赤褐色焦枯［38］，還會(huì)表現(xiàn)出葉綠素含量下降和葉面積減小等特征［39］。本研究中，Cs處理和Sr+Cs處理三葉草葉片黃化特征明顯，從葉片邊緣黃化至整個(gè)葉片，此現(xiàn)象與植物缺鉀癥狀極為相似，且三葉草對(duì)Cs有較強(qiáng)的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)能力。這可能是由于Cs存在時(shí)，Cs元素競(jìng)爭(zhēng)性占用了K元素的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，抑制了三葉草對(duì)K元素的吸收，最終導(dǎo)致三葉草葉片出現(xiàn)缺鉀癥狀。研究表明，Sr和Cs相互影響、相互抑制植物對(duì)Sr和Cs的吸收［40］，當(dāng)Sr、Cs復(fù)合處理后，植物對(duì)Sr、Cs的積累量均小于單一Sr、Cs處理，這與本研究結(jié)果一致。由于水培環(huán)境與土壤環(huán)境存在很大差異，水培結(jié)果不能完全代表土壤污染情況，需進(jìn)一步進(jìn)行土培驗(yàn)證，探究三葉草對(duì)Cs的敏感性，并且在之后的研究中應(yīng)注意Sr與Ca、Cs與K元素之間的相互影響，進(jìn)一步探究植物對(duì)Sr、Cs的敏感機(jī)理。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，Sr、Cs和Sr+Cs處理三葉草生長(zhǎng)情況存在差異，其中Sr處理對(duì)三葉草生長(zhǎng)無(wú)顯著影響，而Cs處理和Sr+Cs處理對(duì)三葉草產(chǎn)生了一定程度的毒害作用，導(dǎo)致三葉草葉綠素含量顯著降低，葉面積減小，生物量降低，葉片黃化，膜脂過(guò)氧化程度加重，表明三葉草對(duì)Cs較為敏感，具有作為Cs污染土壤指示植物的潛力。Cs處理三葉草個(gè)體水平表現(xiàn)出特異性特征，即三葉草葉片邊緣出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)，在葉片邊緣形成一圈黃色干枯，并逐漸向葉片中心發(fā)展，直至整個(gè)葉片黃化干枯，此現(xiàn)象可能成為三葉草對(duì)Cs污染土壤的指示特征。