劉 艷，朱繼翔，陳 煒，朱郇憫, 陳曉明

(廣州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系，廣州 511436)

0 引 言

骨缺損病例在臨床治療中十分常見(jiàn)，常造成骨不連接，延遲愈合或不愈合及局部的功能障礙，影響人們生活質(zhì)量甚至威脅生命。目前，臨床上通常采用的骨修復(fù)材料仍存在成骨活性不高的問(wèn)題,難以滿足臨床需求[1]。脫鈣骨基質(zhì)(demineratized bone matrix，DBM)是一種天然骨衍生材料，自20世紀(jì)60年代人們就對(duì)其做了大量研究，DBM含有促進(jìn)骨等硬組織形成所必須的生物活性物質(zhì),具有優(yōu)異的性能[2]。早在 1965年 Urist用同種脫鈣骨基質(zhì)誘發(fā)肌肉內(nèi)異位成骨,證實(shí)了骨誘導(dǎo)學(xué)說(shuō),首次提出 DBM 具有誘導(dǎo)成骨的能力[3]。DBM具有傳導(dǎo)和誘導(dǎo)骨形成的雙重作用，是一種理想的骨組織工程支架材料,大量研究證明DBM種植體可應(yīng)用于骨缺損修復(fù)。然而DBM的臨床應(yīng)用尚存在一些不足，骨誘導(dǎo)因子在制備過(guò)程中通常會(huì)被消除或降低，不具備足夠的骨誘導(dǎo)活性；另一方面，DBM中的生長(zhǎng)因子釋放可能是不連續(xù)的, 可能會(huì)影響它的骨誘導(dǎo)活性。

研究發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)可以提高DBM的骨誘導(dǎo)活性[4]。BMP-2能單獨(dú)誘導(dǎo)異位成骨和單獨(dú)促進(jìn)骨缺損修復(fù)，骨組織工程常將生物活性大分子與支架結(jié)合來(lái)增加材料的骨誘導(dǎo)活性[5]。如果將血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、BMP-2等復(fù)合到DBM中,可以得到更好的成骨效果[6]。

脫細(xì)胞組織的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)作為支架在組織工程有廣泛的應(yīng)用，并且越來(lái)越普遍，其制備形式多，包括片，粉末和水凝膠[7]。制備ECM的組織來(lái)源廣泛，如真皮、膀胱、心肌、腦、心包、小腸粘膜下層、脊髓、脂肪等[7-12]。完整的ECM支架材料具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，保留了天然組織中發(fā)現(xiàn)的大量生物活性成分，如層粘連蛋白、細(xì)胞粘附蛋白，生長(zhǎng)因子和糖胺聚糖等。由天然的生物組織制備的凝膠比通過(guò)合成制備的凝膠具有更好生物相容性和更高的生物活性。脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠的成分和結(jié)構(gòu)符合仿生學(xué)的要求，具有強(qiáng)大的潛力[13]。

本研究旨在制備出具有緩釋生長(zhǎng)因子功能的DBM復(fù)合神經(jīng)脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠的復(fù)合材料，并考察其能否滿足構(gòu)建結(jié)構(gòu)性組織工程骨組織的需要。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

豬干骨、豬脊髓、Triton-100(MYM BIOLOGICAL TECHNOLOGY COMPANY)、脫氧膽酸鈉(BIOSHARP)、雙氧水(SCR，分析純)、鹽酸、京尼平(WaKo 和光)、人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2 Novoprotein)

1.2 神經(jīng)脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠/BMP-2/脫鈣骨復(fù)合材料的制備

取新鮮豬干骨,處理干凈，在30%過(guò)氧化氫條件下處理48 h；室溫下用蒸餾水反復(fù)浸洗30 min；用改良脫鈣液浸泡72 h，每24 h換液；蒸餾水反復(fù)浸洗30 min,真空冷凍干燥機(jī)干燥24 h，將脫鈣骨(DBM)切成1 cm×1 cm×0.5 cm。

取新鮮豬脊髓，剪去表面脂肪組織和部分神經(jīng)外膜，置于蒸餾水漂洗6 h；3% Trition-X100震蕩12 h；蒸餾水漂洗3次；4% 脫氧膽酸鈉水溶液震蕩24 h；蒸餾水漂洗3次。上述步驟再循環(huán)一次制得脫細(xì)胞神經(jīng)組織。神經(jīng)脫細(xì)胞組織經(jīng)冷凍干燥后粉碎，加入胃蛋白酶、0.01 mol/L HCL制得脫細(xì)胞神經(jīng)預(yù)凝膠,加入0.1 mol/L NaOH、10×PBS,獲得脫細(xì)胞神經(jīng)凝膠溶液；加入BMP-2;分別加入1%京尼平、2%京尼平、3%京尼平，室溫下放置數(shù)分鐘后形成凝膠。

將神經(jīng)脫細(xì)胞(NAM)凝膠在真空抽濾裝置下灌注到制備好的脫鈣骨中，加入40 μL脫細(xì)胞神經(jīng)凝膠充滿脫鈣骨孔隙，每40 μL脫細(xì)胞神經(jīng)凝膠含有0.8 μg BMP-2。冷凍真空冷凍干燥神經(jīng)脫細(xì)胞凝膠/京尼平/脫鈣骨。根據(jù)加入的京尼平含量不同，將其分組為NAM/BMP-2/DBM1、NAM/BMP-2/DBM2、NAM/BMP-2/DBM3。

1.3 復(fù)合材料性能

1.3.1 復(fù)合材料掃描電子顯微鏡觀察

取β-TCP、DBM、NAM/BMP-2/DBM1、NAM/BMP-2/DBM2、NAM/BMP-2/DBM3支架，用真空冷凍干燥器干燥后，表面噴金后掃描電鏡觀察。

1.3.2 材料力學(xué)性能測(cè)試

制備尺寸為8 mm×15 mm×5 mm DBM和β-TCP和NAM/DBM三組樣品，使用萬(wàn)能拉力壓縮測(cè)試儀進(jìn)行單軸壓縮試驗(yàn)，壓縮速率為20 mm/min。

1.3.3 BMP-2體外釋放研究

將NAM/BMP-2/DBM1、NAM/BMP-2/DBM2、NAM/BMP-2/DBM3分別浸泡在裝有500 μL PBS的1 mL試管中，放置于37 ℃、80 r/min恒定轉(zhuǎn)速的恒溫培養(yǎng)箱中。在設(shè)定取樣時(shí)間點(diǎn)內(nèi)取樣，每次將500 μL液體取完，重新加入500 μL PBS。根據(jù)ELISA試劑盒測(cè)定3組支架中BMP-2的釋放量，通過(guò)式(1)計(jì)算得BMP-2累積釋放率,n=4。

累積釋放率=(Ct1V+…+CtnV)/0.8×100

(1)

其中，Ctn為n時(shí)間點(diǎn)取樣時(shí)BMP-2濃度

1.3.4 細(xì)胞-支架共培養(yǎng)

將β-TCP、DBM、NAM/DBM制備成1 cm×1 cm×0.5 cm大小，用75%乙醇浸泡30 min，紫外照射30 min消毒，PBS清洗3次后置于6孔板中。將MC3T3-E1細(xì)胞分別種植到3種支架上，每孔細(xì)胞數(shù)量為1×105個(gè)細(xì)胞。用含有10%FBS,1%雙抗的α-MEM培養(yǎng)液(Gibco)在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，兩天換一次液。培養(yǎng)1天后用多聚甲醛固定后，掃描電鏡觀察細(xì)胞在支架上形態(tài)；細(xì)胞-支架共培養(yǎng)1、3、5、7d后用CCK-8試劑盒檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞在支架上增值情況并用Dead/Live試劑盒進(jìn)行染色，正置熒光顯微鏡觀察；細(xì)胞-支架共培養(yǎng)3、7、14 d后，用ALP試劑盒、BCA試劑盒檢測(cè)其堿性磷酸酶活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)中所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS進(jìn)行。結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。單因素方差分析用于檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，P<0.05被認(rèn)為是指示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

2 結(jié)果與討論

2.1 脫鈣骨復(fù)合脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)凝膠支架表面結(jié)構(gòu)及力學(xué)性能

骨支架作為種子細(xì)胞和生長(zhǎng)因子的載體，是骨組織修復(fù)的關(guān)鍵。骨支架的微觀結(jié)構(gòu)和材料性能對(duì)骨修復(fù)和再生有重要影響。由圖1(a)、(c)可知，DBM為三維多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔徑為152～529 μm,孔洞相互貫通，具有天然的孔隙，簡(jiǎn)單易得，大孔徑有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸和血管長(zhǎng)入。圖1(b)、(d)為β-TCP表面形貌，β-TCP，孔徑為105～408 μm,其孔隙比DBM小，密度較高。

由于支架材料是多孔的，NAM凝膠可以整合在DBM基質(zhì),增大內(nèi)表面積[14]。NAM凝膠屬于生物來(lái)源凝膠，來(lái)源于生物組織的細(xì)胞外基質(zhì)，其成分和結(jié)構(gòu)符合仿生學(xué)要求，研究發(fā)現(xiàn)NAM凝膠是目前最接近細(xì)胞生長(zhǎng)天然環(huán)境的支架材料[15]。NAM凝膠當(dāng)未使用交聯(lián)劑時(shí)，只有少量NAM凝膠與DBM復(fù)合(圖2(b);交聯(lián)劑含量為1%時(shí)復(fù)合的NAM凝膠量比無(wú)交聯(lián)劑時(shí)多(圖2(c)；交聯(lián)劑含量為2%時(shí)復(fù)合的NAM凝膠量明顯增多(圖2(d)；交聯(lián)劑含量為3%時(shí)復(fù)合的NAM凝膠量最高(圖2(e)。由圖2可知DBM與NAM凝膠的復(fù)合程度與交聯(lián)劑含量呈正比，復(fù)合材料的交聯(lián)劑含量越高，DBM交聯(lián)NAM凝膠量越多。

支架的力學(xué)性能對(duì)骨組織修復(fù)具有重要的影響。適當(dāng)?shù)牧W(xué)強(qiáng)度是理想的骨組織工程材料要求之一。由圖3(a)、(b)可知β-TCP組的抗壓強(qiáng)度顯著高于DBM、NAM/DBM,β-TCP組密度比其他兩組材料密度高。圖3(b)中β-TCP的抗壓強(qiáng)度為(20.5±1.26)MPa,DBM的抗壓強(qiáng)度為(1.04±0.44)MPa, NAM/DBM的抗壓強(qiáng)度為(1.00±0.30)MPa.脫鈣骨復(fù)合脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠后，抗壓強(qiáng)度稍低于未復(fù)合脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠，但兩組材料的抗壓強(qiáng)度沒(méi)有顯著性差異,結(jié)果表明復(fù)合凝膠對(duì)DBM的力學(xué)性能沒(méi)有影響。

圖2 DBM、NAM/DBM、NAM/Genipin/DBM 掃描電鏡圖

圖3 力學(xué)性能

2.2 體外BMP-2釋放動(dòng)力學(xué)

NAM凝膠是一類可吸收保持大量水分但不溶于水的三維生物材料[13]。將BMP-2溶于蒸餾水，利用NAM凝膠可吸收保持大量水分但不溶于水的特性可使NAM凝膠負(fù)載一定量的BMP-2。Genipin是一種天然優(yōu)良的生物交聯(lián)劑，研究發(fā)現(xiàn)在水凝膠中添加一定量交聯(lián)劑可以減慢其降解速度。不同含量的Genipin與神經(jīng)脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠形成的網(wǎng)絡(luò)交聯(lián)和溶脹度可影響釋放行為[16]。在NAM凝膠中加入Genipin可以延長(zhǎng)降解時(shí)間，增加BMP-2持續(xù)釋放時(shí)間。在早期研究基礎(chǔ)上，本文探討了Genipin的量對(duì)BMP-2釋放規(guī)律的影響。結(jié)果表明，交聯(lián)劑量為3%的復(fù)合支架組緩釋量最大，緩釋效果最佳。復(fù)合支架中BMP-2釋放情況如圖4所示。在釋放前13天，當(dāng)Genipin用量為2%時(shí),復(fù)合材料中BMP-2釋放率高于Genipin用量為1%、3%的復(fù)合材料中的BMP-2。釋放中后期，Genipin量為3%一組的復(fù)合支架釋放BMP-2量明顯高于含Genipin量為1%、2%的兩組復(fù)合支架，在34d內(nèi)釋放總量達(dá)到34%±4%，其累積釋放與釋放時(shí)間呈現(xiàn)線性增長(zhǎng)，無(wú)暴釋現(xiàn)象發(fā)生。

圖4 BMP-2累計(jì)釋放曲線圖

2.3 細(xì)胞在支架上生長(zhǎng)

將MC3T3-E1細(xì)胞種植到復(fù)合支架上來(lái)考察負(fù)載BMP-2的復(fù)合支架對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。MC3T3-E1細(xì)胞-支架復(fù)合培養(yǎng)1d后，通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察，可見(jiàn)細(xì)胞在NAM/DBM(圖5(a))、β-TCP(圖5(b))上呈圓形貼附于材料表面生長(zhǎng)。在NAM/DBM材料表面，粘附的細(xì)胞數(shù)量多，部分細(xì)胞形態(tài)開始改變，并分泌出少量基質(zhì)，在β-TCP材料表面，粘附細(xì)胞數(shù)量較少，細(xì)胞大部分長(zhǎng)出觸角。NAM凝膠具有良好的生物相容性和親水性，細(xì)胞易于粘附在其表面。另外，NAM凝膠支架具備多空網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有利于細(xì)胞向內(nèi)生長(zhǎng)[15]。MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)第1、3、5、7 d用正置熒光顯微鏡觀察其在材料表面生長(zhǎng)情況?；罴?xì)胞(綠色)填充于支架孔隙，未見(jiàn)死細(xì)胞(紅色)。培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，材料表面細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)逐漸變好，總體呈現(xiàn)較好的增值趨勢(shì)。在第7天時(shí)，細(xì)胞在NAM/DBM(圖6d)、β-TCP(圖6(h))支架上大部分都鋪展開呈梭形，生長(zhǎng)情況最佳。

圖5 細(xì)胞-支架復(fù)合培養(yǎng)1d掃描電鏡觀察

MC3T3-E1細(xì)胞在不同材料上1、3、5、7 d天后用CCK-8試劑盒驗(yàn)證細(xì)胞在支架材料上的情況。從圖7可以看出隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各組的吸光度值都逐漸增高。在第3、5、7天負(fù)載BMP-2因子的支架材料細(xì)胞活性顯著高于DBM和β-TCP組。結(jié)合圖5證明負(fù)載BMP-2的脫細(xì)胞神經(jīng)凝膠對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，NAM/BMP-2/DBM支架可以促進(jìn)細(xì)胞增殖, NAM/BMP-2/DBM支架材料對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用，是一種有效負(fù)載BMP-2的方法。

圖6 MC3T3-E1細(xì)胞-支架復(fù)合培養(yǎng)1、3、5、7d 死/活細(xì)胞染色(正置熒光顯微鏡)

ALP活性表達(dá)是成骨細(xì)胞分化的一個(gè)特征，高ALP活性有利于成骨作用。用ALP試劑盒檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞在不同材料上培養(yǎng)3、7、14d后ALP活性值。在第14天，負(fù)載BMP-2的支架和β-TCP上的細(xì)胞顯示出最大的ALP活性。在第7、14天，負(fù)載BMP-2的支架上細(xì)胞ALP活性顯著高于β-TCP，表明NAM/BMP-2/DBM 支架具有良好促成骨分化作用。

圖7 支架材料CCK-8活性

圖8 ALP活性

3 結(jié) 論

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)研究，可得出以下結(jié)論：

(1)神經(jīng)脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠復(fù)合脫鈣骨材料具有良好的三維網(wǎng)狀孔隙結(jié)構(gòu)，孔徑約152～529 μm ,互相連通，有利于骨組織長(zhǎng)入；

(2)神經(jīng)脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠復(fù)合脫鈣骨材料可緩釋BMP-2，京尼平含量為3%時(shí)，可持續(xù)釋放至少34 d，累積釋放量為34%，期間無(wú)暴釋現(xiàn)象發(fā)生，表明以京尼平為交聯(lián)劑制備神經(jīng)脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠復(fù)合脫鈣骨可有效地復(fù)合BMP-2并且具有緩釋BMP-2的功能。

(3)神經(jīng)脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠復(fù)合脫鈣骨材料無(wú)細(xì)胞毒性，MC3T3-E1細(xì)胞在材料上生長(zhǎng)狀況良好，隨著時(shí)間增長(zhǎng)不斷增殖，表明神經(jīng)脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠復(fù)合脫鈣骨材料具有良好的生物相容性；

(4)神經(jīng)脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠復(fù)合脫鈣骨材料的ALP活性在第7、14天顯著高于β-TCP組，表明其具有較高的成骨活性。

(5)綜合神經(jīng)脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠復(fù)合脫鈣骨材料的微觀結(jié)構(gòu)、藥物緩釋作用、生物相容性和成骨分化活性各方面的評(píng)價(jià)，神經(jīng)脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠復(fù)合脫鈣骨材料有望成為一種理想的骨修復(fù)材料。