周 宇 韓雁明 李改云 儲(chǔ)富祥

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院木材工業(yè)研究所 北京 100091)

中空納米球具有密度低、比表面積大、滲透性好和穩(wěn)定性高等特點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)和工業(yè)領(lǐng)域擁有廣闊的應(yīng)用前景(Sietal.， 2016； Xuetal.， 2016)。木質(zhì)素是一種價(jià)格低廉、產(chǎn)量巨大的可再生生物質(zhì)資源，結(jié)構(gòu)中含有甲氧基、羰基、羧基、酚羥基和脂族羥基等多種基團(tuán)，已成為生物基新材料開(kāi)發(fā)中的候選原材料(Duvaletal.， 2014； Laurichesseetal.， 2014； 熊福全等， 2016)； 同時(shí)，木質(zhì)素還具有良好的生物降解性、生物相容性和熱穩(wěn)定性，也是藥物傳遞所需潛在材料之一(Figueiredoetal.， 2017； Lietal.， 2016； 金克霞等， 2018)。酶解木質(zhì)素(enzymatic hydrolysis lignin，EHL)作為一種生物質(zhì)煉制的副產(chǎn)品，近些年隨著生物質(zhì)煉制行業(yè)的發(fā)展，產(chǎn)量逐年增加。研究表明，當(dāng)兩親性EHL溶解在選擇性溶劑中時(shí)，會(huì)產(chǎn)生微觀相分離而發(fā)生自組裝，形成核殼結(jié)構(gòu)的膠束(Hongetal.， 2015)，這為EHL的高值化應(yīng)用提供了一種簡(jiǎn)單可行的途徑。

目前，基于天然和合成聚合物的納米粒子已為改善抗癌藥物傳輸提供了一種有效路徑。作為藥物的承載體，納米粒子一般通過(guò)滲透率和滯留效應(yīng)增加藥物的溶解度，擴(kuò)展循環(huán)時(shí)間，增強(qiáng)腫瘤對(duì)藥物的吸收(Davisetal.， 2008； Samaletal.， 2012； Zhaoetal.， 2013)。阿霉素是一種廣泛應(yīng)用的抗腫瘤活性抗生素，但由于該藥物不能直接深入腫瘤組織且對(duì)心臟等器官具有很強(qiáng)的毒副作用，導(dǎo)致其治療效果有限(Carvalhoetal.， 2009； Gongetal.， 2017； Hussainetal.， 2013； McRaeetal.， 2014)。因此，在運(yùn)送阿霉素到腫瘤部位的過(guò)程中，如何降低其在非腫瘤部位的藥物暴露，是實(shí)現(xiàn)阿霉素有效利用需要解決的一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)，開(kāi)發(fā)將阿霉素運(yùn)載到腫瘤組織的有效納米載體已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一(Figueiredoetal.， 2016； Monthaetal.， 2016； Scheerenetal.， 2016)。

本研究以酶解木質(zhì)素為原材料，將其溶解在四氫呋喃(tetrahydrofuran，THF)中，通過(guò)自組裝制備納米木質(zhì)素中空粒子(lignin hollow nanoparticles，LHNPs)，探討木質(zhì)素初始質(zhì)量濃度對(duì)納米木質(zhì)素結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的影響，并利用納米木質(zhì)素包載抗癌藥物鹽酸阿霉素，研究載藥納米粒子的藥物釋放行為，以期為中空開(kāi)口聚合物納米粒子的結(jié)構(gòu)控制和藥物控釋等技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

酶解木質(zhì)素(EHL)購(gòu)于香港來(lái)禾生物技術(shù)有限公司(經(jīng)THF提純后，羥基含量為2.57 mmol·g-1； GPC測(cè)定的分子質(zhì)量為532，多分散系數(shù)為1.34)，四氫呋喃(THF，分析純)購(gòu)于北京化學(xué)試劑廠，鹽酸阿霉素(DOX.HCl)購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司。JEM-1400Plus透射電子顯微鏡，日本電子； S-4800掃描電子顯微鏡，日本Hitachi公司； Zetasizer Nano 激光粒度儀，英國(guó)Malvern公司； X射線粉末衍射儀，德國(guó)布魯克公司； Nicolet IS10紅外光譜儀，美國(guó)尼高力公司； UV-3600紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)，日本島津公司。

1.2 中空開(kāi)口木質(zhì)素納米球的制備

室溫下，取一定質(zhì)量EHL溶解在裝有10 mL THF的燒杯中，分別配制質(zhì)量濃度0.3、1和3 mg·mL-1的木質(zhì)素溶液。用磁力攪拌器以700 r·min-1的速度攪拌溶液，并用蠕動(dòng)泵以4 mL·min-1的速度向溶液中滴加去離子水。1 min后，溶液由清澈紅棕色變?yōu)闇啙狳S棕色乳濁液； 繼續(xù)滴加去離子水，乳濁液顏色逐漸變淺； 40 mL時(shí)，液體變?yōu)檩^淺的黃棕色，停止滴加去離子水。繼續(xù)攪拌12 h后將懸浮液轉(zhuǎn)移至透析袋(MWCO: 12000-14000，Spectrumlabs，USA)中透析，去除殘余的THF和游離的木質(zhì)素分子，透析24 h，中間換水2次。

1.3 鹽酸阿霉素的裝載和體外釋放

將DOX分散在木質(zhì)素溶液中(mDOX∶mEHL=1∶10)，超聲2 min后，以4 mL·min-1的速度滴加去離子水40 mL。此過(guò)程中，木質(zhì)素在自組裝成納米中空粒子的同時(shí)會(huì)將DOX包裹在LHNPs腔體內(nèi)，具體過(guò)程見(jiàn)圖1。24 h后，將懸浮液轉(zhuǎn)移至透析袋中透析24 h，去除TFH和其他游離的分子。最后在11 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心15 min，用紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定480 nm上清液的吸光度來(lái)測(cè)定DOX的載藥量。

圖1 DOX@LHNPs的制備過(guò)程Fig.1 Preparation process of DOX@LHNPs

圖2 不同EHL初始質(zhì)量濃度制備的LHNPs尺寸表征Fig.2 Size characterization of LHNPs prepared with different EHL mas concentrations

采用PBS(pH7.4，pH5.5)透析法研究DOX從納米球中的釋放行為。取5 mg DOX.HCl、10 mg 載藥木質(zhì)素球浸泡在50 mL PBS溶液中(37 ℃)，振蕩，在預(yù)定時(shí)間間隔內(nèi)，取5 mL培養(yǎng)基，加入相同量的新鮮PBS溶液。所取樣品在11 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心5 min，用紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定DOX的釋放量。DOX的載藥量(drag loading,DL)和包封率(entrapment efficiency,EE)計(jì)算公式如下：

DL(%)=mDOX/mDOX@LHNPs× 100%；

(1)

EE(%)=mDOX/mDOX，T×100%。

(2)

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解木質(zhì)素初始質(zhì)量濃度對(duì)LHNPs粒徑的影響

在研究EHL初始質(zhì)量濃度對(duì)LHNPs結(jié)構(gòu)和性能的影響時(shí)，去離子水滴加速度和磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速保持4 mL·min-1和700 r·min-1。由圖2A可知，隨著木質(zhì)素初始質(zhì)量濃度從0.3 mg·mL-1增加到3 mg·mL-1，納米顆粒直徑從552.6 nm減小到266.8 nm，且激光粒度儀測(cè)試懸浮液的PDI基本保持穩(wěn)定。從圖2B粒徑分布曲線可看出，3種粒子粒徑尺寸分布均勻，LHNPs0.3 mg·mL-1比其他2種粒子分布稍寬，表明EHL初始質(zhì)量濃度較低時(shí)，制備的納米中空粒子粒徑均勻性稍差。

2.2 酶解木質(zhì)素初始質(zhì)量濃度對(duì)LHNPs形狀結(jié)構(gòu)的影響

從不同EHL初始質(zhì)量濃度制備的LHNPs透射電鏡圖像(圖3)可看出，木質(zhì)素納米粒子呈球形中空結(jié)構(gòu)，表面開(kāi)孔，隨著EHL初始質(zhì)量濃度增加，粒子的直徑、表面積和孔隙體積均有所減小。這是因?yàn)镋HL初始質(zhì)量濃度越高，初期參加自組裝的EHL越多，導(dǎo)致殼層壁厚隨初始質(zhì)量濃度增加而增厚； 相反，當(dāng)初始質(zhì)量濃度較低時(shí)，初期參加自組裝的EHL較少，不能迅速形成穩(wěn)定完整的球形納米粒子，致使此種條件下制備的納米中空粒子殼體壁厚較薄，形狀分布不均勻。另外，試驗(yàn)結(jié)果還顯示，LHNPs的產(chǎn)率(LHNPs質(zhì)量和原EHL質(zhì)量的比值)隨初始質(zhì)量濃度增加而增大(yield0.3 mg·mL-1=33.5%，yield1 mg·mL-1=62.3%，yield3 mg·mL-1=76.8%)。這是因?yàn)榈头肿淤|(zhì)量的EHL不參加自組裝過(guò)程(Xiongetal.， 2017)，所以初始質(zhì)量濃度較低時(shí)，反應(yīng)體系中初期參加自組裝的EHL更少，導(dǎo)致木質(zhì)素納米粒子的產(chǎn)率降低。

2.3 酶解木質(zhì)素初始質(zhì)量濃度對(duì)LHNPs穩(wěn)定性的影響

為研究不同EHL初始質(zhì)量濃度對(duì)LHNPs穩(wěn)定性的影響，本研究跟蹤測(cè)量懸浮液中納米粒子隨時(shí)間的變化。從圖4可以看出，3種初始質(zhì)量濃度制備的納米粒子平均直徑在10天內(nèi)基本保持不變，粒度分散指數(shù)(PDI)在5天內(nèi)未發(fā)生明顯改變，5～10天內(nèi)稍微增大，但PDI小于0.3，這說(shuō)明木質(zhì)素納米粒子在10天內(nèi)具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性。平均粒徑和PDI在15天后增大，其中LHNPs0.3 mg·mL-1變化更為顯著。在LHNPs懸浮液體系中，粒子表面羥基和羧基提供的表面電荷使得納米粒子表面形成能夠使粒子保持穩(wěn)定分散的雙電層(Lievonenetal.， 2016)，但是LHNPs的不對(duì)稱結(jié)構(gòu)會(huì)影響其表面的雙電層，所以粒子在15天后平均直徑增大。由LHNPs0.3 mg·mL-1的TEM可以看出，其形狀更不規(guī)整，殼層較薄，而且開(kāi)口較大，所以LHNPs0.3 mg·mL-1的穩(wěn)定性較差。

圖3 不同EHL初始質(zhì)量濃度制備的LHNPs透射電鏡圖像以及對(duì)應(yīng)的比表面積和孔隙率Fig.3 TEM images of LHNPs prepared with different EHL mass concentrations and corresponding specific surface area and porosity

圖4 LHNPs懸浮液中粒子的粒徑和PDI隨時(shí)間的變化Fig.4 Change in the particles size and PDI of LHNPs after incubation at water over time

2.4 酶解木質(zhì)素初始質(zhì)量濃度對(duì)LHNPs包封和釋放阿霉素行為的影響

圖5 LHNPs對(duì)DOX的載藥量和封裝率以及不同pH PBS溶液中阿霉素的體外釋放曲線Fig.5 Drag loading and entrapment efficiency of LHNPs for DOX，and in vitro release curve of doxorubicin in different pH PBS solution1. 自由DOX Free drugs, pH5.5; 2. 自由DOX Free drugs, pH7.4; 3.DOX@LHNPs0.3 mg·mL-1, pH5.5; 4.DOX@LHNPs0.3 mg·mL-1, pH7.4; 5.DOX@LHNPs 1 mg·mL-1, pH5.5; 6.DOX@LHNPs 1 mg·mL-1 pH7.4; 7.DOX@LHNPs3 mg·mL-1, pH5.5; 8.DOX@LHNPs 3 mg·mL-1，pH7.4.

大分子中空?qǐng)F(tuán)聚粒子的結(jié)構(gòu)對(duì)其包封和緩釋性能具有重要影響(Lietal.， 2010)。通過(guò)控制EHL初始質(zhì)量濃度，可得到不同結(jié)構(gòu)的LHNPs，使得LHNPs具備成為一個(gè)選擇性載體平臺(tái)的潛力。LHNPs的載藥量(DL)和包封率(EE)如圖5A所示，可以看出，LHNPs0.3 mg·mL-1的載藥量明顯高于其他2種木質(zhì)素納米粒子，但其包封率不是最大的。這是因?yàn)檩^大的比表面積和孔隙率可提高中空納米粒子對(duì)DOX的包載能力，LHNPs0.3 mg·mL-1的制備過(guò)程產(chǎn)率太低，故其EE不高。為了模擬腫瘤微環(huán)境(pH5.5)和生理pH(pH 7.4)，對(duì)LHNPs@DOX在2種不同pH PBS溶液中的藥物釋放行為進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果如圖5B所示，可以看出，2種pH體系的DOX釋放行為是不同的。酸性(pH5.5)條件下，自由DOX、載藥粒子釋放DOX的速度均大于中性(pH7.4)條件下的藥物釋放速度。60 h后，酸性條件下3種粒子的DOX累積釋放量均超過(guò)55%，而中性條件下DOX的最高釋放量低于45%。另外，在2種pH體系中，同一時(shí)刻DOX@LHNPs0.3 mg·mL-1的累積釋放量最大，DOX@LHNPs3 mg·mL-1釋放穩(wěn)定性最好。這主要是由于LHNPs的殼層壁厚和表面開(kāi)口大小引起的，較厚的外殼、較小的表面開(kāi)口和規(guī)整的結(jié)構(gòu)，可以更好保護(hù)納米顆粒免受PBS的溶脹作用，減小粒子表面雙電層的破壞。與自由藥物的釋放曲線比較，載藥納米粒子具有對(duì)DOX的持續(xù)釋放效果。

2.5 載阿霉素LHNPs的形貌和尺寸

圖6A、B、C為EHL、LHNPs和DOX@LHNPs的SEM，插圖為對(duì)應(yīng)的TEM(根據(jù)納米球穩(wěn)定性、載藥量和釋放速率選取得最優(yōu)制備方案： EHL初始質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1，攪拌速度為700 r·min-1，水滴加速度為4 mL·min-1)。木質(zhì)素原料為粒徑幾微米到幾十微米的不規(guī)則塊狀結(jié)構(gòu)(圖6A)，LHNPs為表面有單一開(kāi)口的中空球形，TEM顯示球體內(nèi)部與殼體具有明顯反差，進(jìn)一步證明中空腔體的存在(圖6B)。包載DOX后，LHNPs結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變，DOX被包載在納米球空腔內(nèi)部，干燥后結(jié)晶成小塊狀結(jié)構(gòu)(圖6C)。與LHNPs紅外光譜相比，DOX@LHNPs上出現(xiàn)DOX特征峰(1 622 cm- 1，1 590 cm-1)(圖6D)，說(shuō)明LHNPs成功包載了DOX。除此之外，未發(fā)現(xiàn)新的吸收峰，也沒(méi)有舊的化學(xué)鍵消失，說(shuō)明DOX通過(guò)物理作用包埋在LHNPs內(nèi)。木質(zhì)素基中空納米球在水中的吸收峰為284 nm，而在THF中重新溶解后吸收峰紅移到280 nm(圖6E)，表明納米球制備過(guò)程中木質(zhì)素分子之間存在π-π相互作用。譜圖顯示，在去離子水和THF中重新溶解的納米球懸浮液分別在290 nm和282 nm處顯示吸收峰(圖6E)。此外，在482 nm處觀察到DOX的吸收峰。載藥納米球相對(duì)應(yīng)的吸收峰紅移不同于未載藥納米球，證實(shí)載藥納米球在自組裝制備過(guò)程中木質(zhì)素與阿霉素分子之間存在π-π相互作用。圖7為DOX的TEM和XRD，進(jìn)一步證明載藥LHNPs腔體內(nèi)的塊狀物質(zhì)為DOX的結(jié)晶體。

圖6 EHL(A)、LHNPs(B)和DOX @LHNPs(C)的SEM(插圖為對(duì)應(yīng)的TEM)以及LHNPs、DOX @LHNPs的紅外光譜和紫外可見(jiàn)光光譜(E)Fig.6 SEM images of EHL(A), LHNPs(B)and LHNPs@DOX(C)(the inset is the corresponding TEM images)，F(xiàn)TIR (D) and UV-Vis absorption spectra(E) of LHNPs and LHNPs@DOX

圖7 DOX干燥后的TEM(A)和XRD(B)Fig.7 TEM image(A) and XRD pattern(B)of DOX after drying

3 討論

木質(zhì)素是一種廣泛存在于植物體內(nèi)的無(wú)定形芳香性高聚物，分子結(jié)構(gòu)中含有苯環(huán)、甲氧基、酚羥基等結(jié)構(gòu)單元。作為兩親性聚合物，木質(zhì)素分子鏈上同時(shí)含有疏水和親水性基團(tuán)，可以在選擇性溶劑中發(fā)生微觀相分離并自組裝成具有疏溶劑性核和溶劑化殼的聚集體(Hongetal.， 2016)，其形成疏溶劑微區(qū)的推動(dòng)力主要有π-π作用、親疏水作用、氫鍵作用、溶劑效應(yīng)等(Hongetal.， 2015)。酶解木質(zhì)素作為一種生物質(zhì)煉制的副產(chǎn)品，因良好的生物降解性、生物相容性、pH和熱穩(wěn)定性等特性，已成為藥物控釋領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景的原料。

納米木質(zhì)素中空球形材料具有較大的比表面積和內(nèi)部空間、較低的密度以及良好的穩(wěn)定性和滲透性，粒子結(jié)構(gòu)的控制對(duì)其在多種領(lǐng)域的選擇應(yīng)用具有重要意義。納米木質(zhì)素中空粒子自組裝制備過(guò)程中，控制結(jié)構(gòu)的因素主要有木質(zhì)素初始質(zhì)量濃度、轉(zhuǎn)速和去離子水滴加速度，其中木質(zhì)素初始質(zhì)量濃度對(duì)粒子結(jié)構(gòu)的影響更顯著。通過(guò)控制初始質(zhì)量濃度制備不同結(jié)構(gòu)的納米木質(zhì)素粒子，能夠?yàn)椴煌I(lǐng)域的選擇利用有針對(duì)性地提供所需的粒子結(jié)構(gòu)。

DOX@LHNPs藥物釋放試驗(yàn)結(jié)果表明，相比自由DOX，LHNPs對(duì)藥物具有較好的控釋行為。酸性(pH5.5)條件下，DOX@ LHNPs釋放DOX的速度大于中性(pH7.4)條件下的藥物釋放速度，因此當(dāng)DOX@ LHNPs進(jìn)入細(xì)胞后，溶酶體的酸性環(huán)境會(huì)促進(jìn)DOX的釋放，達(dá)到更好的治療效果(Yuetal.， 2014)。

4 結(jié)論

1) 酶解木質(zhì)素可在四氫呋喃中發(fā)生微觀相分離，并自組裝成尺寸穩(wěn)定且表面具有單孔的中空球形納米粒子，能夠在水中穩(wěn)定保存10天以上。

2) 通過(guò)控制酶解木質(zhì)素初始質(zhì)量濃度，可調(diào)控中空納米粒子的直徑和殼層壁厚。初始質(zhì)量濃度低時(shí)，制備的木質(zhì)素球直徑較大，殼層較薄，比表面積和孔隙率較大。

3) LHNPs的比表面積和孔隙率越大，其載藥量越大，但結(jié)構(gòu)更規(guī)整、殼層壁更厚的納米中空載藥粒子對(duì)DOX的釋放更穩(wěn)定。