韓 彪 李文清 郭素娟 陸 璐 解孝滿

(1. 北京林業(yè)大學(xué)省部共建森林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100083； 2. 山東省林木種質(zhì)資源中心 濟(jì)南 250102)

頑拗性種子(recalcitrant seed)主要是木本植物種子，一般體積較大，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但頑拗性種子在成熟時(shí)多保持較高含水量，對(duì)脫水和低溫敏感，其保存技術(shù)一直是種子保存研究的重要方向(Lietal.， 2009； 文彬， 2011； 李磊等； 2016)。頑拗性種子無(wú)法長(zhǎng)期保存的重要因素之一是脫水敏感性(Waltersetal., 2013; Xiaetal., 2014)，由于不同植物、同種植物不同種源種子的脫水耐受性都存在差異，傳統(tǒng)研究?jī)H依據(jù)萌發(fā)的“臨界含水量”進(jìn)行種子頑拗性評(píng)價(jià)的方法并不完善(Songetal., 2003)，出現(xiàn)了同種植物種子的結(jié)論迥然不同，甚至不同批次種子的結(jié)論也不同，如茶(Camelliasinensis)、小?？Х?Coffeaarabica)等都曾被劃分為不同種子類型(文彬， 2008)。因此，探索能夠客觀反映種子水分狀態(tài)和活力狀態(tài)的臨界含水量，針對(duì)不同類型種子研制適宜的保存技術(shù)，是頑拗性種子保存的重要研究方向。

板栗(Castaneamollissima)為殼斗科(Fagaceae)栗屬(Castanea)，是我國(guó)重要的木本糧食樹種，種植面積和產(chǎn)量均居世界第一(郭素娟等， 2018)。隨著板栗產(chǎn)量逐漸增大，其貯藏和保鮮能力不足問(wèn)題日益凸顯， 許多栗農(nóng)仍采取沙藏法、架藏法等傳統(tǒng)方法保存， 一些中小企業(yè)雖采用低溫貯藏技術(shù)，但由于貯前預(yù)處理、貯藏溫度、相對(duì)濕度等參數(shù)設(shè)置不夠科學(xué)，貯藏效果也不理想(易善軍， 2017)。胚軸是種子萌發(fā)的決定因素，是頑拗性種子超紙溫保存的核心材料，目前，已有一些關(guān)于板栗胚軸超低溫保存的報(bào)道(鄭郁善， 2002； Corredoiraetal., 2004)，但保存前臨界含水量未有研究，保存后種子萌發(fā)率不高。本研究基于差示掃描量熱技術(shù)(DSC)，分析頑拗性種子板栗胚軸的臨界含水量，探索板栗種子低溫保存技術(shù)和胚軸超低溫保存技術(shù)，以期為板栗等頑拗性種子設(shè)施保存提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2018年9月，從山東省濟(jì)南市西營(yíng)板栗合作社采集‘煙泉’品種板栗種子，用紗布擦拭干凈后自封袋密封包裝，2 ℃下保存，備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 胚軸脫水和含水量測(cè)定 選擇大小和質(zhì)量[(10±0.5) g]一致的種子,首先去除種皮，用解剖刀切取含有小塊子葉組織的胚軸，將胚軸放在開放的培養(yǎng)皿(直徑7 cm)中，然后置于盛有硅膠的干燥器內(nèi)，使用3個(gè)內(nèi)置風(fēng)扇增強(qiáng)干燥器內(nèi)空氣循環(huán)，快速干燥胚軸。初始含水量測(cè)定參考國(guó)際種子檢驗(yàn)協(xié)會(huì)(ISTA， 2018)方法，取10個(gè)新鮮胚軸稱取鮮質(zhì)量后置于烘箱中(溫度103 ℃，烘干17 h)脫水至恒質(zhì)量，稱取干質(zhì)量后計(jì)算含水量=(鮮質(zhì)量-干質(zhì)量)/鮮質(zhì)量×100%，重復(fù)3次。在硅膠密閉條件下使胚軸快速失水至50%、40%、30%、25%、20%、15%和10%等梯度含水量，均以新鮮胚軸初始含水量作為對(duì)照。

1.2.2 胚軸萌發(fā) 參考并改進(jìn)Corredoira(2004)對(duì)歐洲板栗(C.sativa)胚軸的萌發(fā)方法，采用恢復(fù)培養(yǎng)基和萌發(fā)培養(yǎng)基進(jìn)行板栗胚軸萌發(fā)，即將胚軸消毒后，首先接種在恢復(fù)培養(yǎng)基上24 h(改良的MS培養(yǎng)基，硝酸鹽減半，0.5 mg·L-16-BA，30 g·L-1蔗糖，1 mL·L-1，5 g·L-1瓊脂，pH 5.6)，然后轉(zhuǎn)接至萌發(fā)培養(yǎng)基上(瓊脂調(diào)整為6 g·L-1，其他成分同恢復(fù)培養(yǎng)基)。黑暗條件下培養(yǎng)2周，轉(zhuǎn)移到環(huán)境溫度為25 ℃的12 h/12 h光周期環(huán)境中培養(yǎng)2周，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。胚軸萌發(fā)20個(gè)1組，重復(fù)3次。

1.2.3 基于DSC的熱力學(xué)分析 使用美國(guó)TA公司D250系列差示掃描量熱儀，對(duì)不同含水量胚軸進(jìn)行熱力學(xué)測(cè)定，以液氮制冷。DSC測(cè)定參考Al等(2015)方法，將不同含水量胚軸樣品置于鋁盤內(nèi)密封，在微量天平上稱質(zhì)量； DSC分析條件為30 ℃ 保持1 min，以10 ℃·min-1降溫至-150 ℃后保持2 min，再以10 ℃·min-1升溫至30 ℃?；贒SC軟件監(jiān)測(cè)不同含水量胚軸在冷卻結(jié)晶和加熱熔融階段的熱力學(xué)數(shù)據(jù)，分析結(jié)晶起始溫度、峰值溫度和熱焓，根據(jù)不同含水量胚軸熱焓變化計(jì)算脫水臨界含水量。每個(gè)含水量梯度3次重復(fù)。

1.2.4 種子低溫保存 將采集的板栗種子用紗布擦拭干凈后密封保存在自封袋中，置于冰箱保鮮層。根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)，保存溫度設(shè)為2 ℃，定期擦拭自封袋內(nèi)產(chǎn)生的凝結(jié)水，每月測(cè)定種子發(fā)芽率，連續(xù)5個(gè)月。由于板栗種子存在休眠現(xiàn)象，因此采用組織塊萌發(fā)方式，即在黑暗條件下培養(yǎng)2周后，轉(zhuǎn)移到環(huán)境溫度為25 ℃的12 h/12 h光周期環(huán)境中培養(yǎng)2周，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。種子萌發(fā)10個(gè)1組，重復(fù)3次。

1.2.5 胚軸超低溫保存 采用直接冷凍法、程序冷凍法、玻璃化冷凍法和程序玻璃化冷凍法，對(duì)不同含水量板栗胚軸進(jìn)行超低溫保存測(cè)定。

直接冷凍法： 將胚軸放入凍存管，直接投入液氮中保存。程序冷凍法： 將胚軸放入凍存管，置于-80 ℃冰箱24 h，取出后迅速投入液氮中保存。玻璃化冷凍法： 將胚軸放入加有玻璃化冷凍保護(hù)劑PVS2(30%甘油+15%乙二醇+15%二甲亞砜+0.4 mol·L-1蔗糖)的凍存管內(nèi)1 h，之后迅速投入液氮中保存。程序玻璃化冷凍法： 先將胚軸放入加有玻璃化冷凍保護(hù)劑PVS2的凍存管內(nèi)1 h，然后置于-80 ℃冰箱24 h，最后投入液氮中保存。各種冷凍方法均在液氮中保存24 h。

解凍程序： 取出液氮保存24 h的胚軸，將凍存管置于40 ℃水浴中解凍5 min，含有PVS2的胚軸用無(wú)菌水洗滌3次，每次5 min。所有胚軸進(jìn)行萌發(fā)測(cè)定，以未經(jīng)液氮保存的不同含水量胚軸萌發(fā)為對(duì)照(CK)，每組20個(gè)胚軸，重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel和ANOVA對(duì)胚軸萌發(fā)和DSC數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，使用差示掃描量熱儀(DSC)TRIOS V4軟件(TA，USA)對(duì)熱力學(xué)曲線數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同含水量胚軸萌發(fā)情況

由圖1可知，當(dāng)胚軸含水量從初始的61%降至25%時(shí)，胚軸萌發(fā)率未明顯下降； 當(dāng)含水量降至20%時(shí)，萌發(fā)率降至82.1%，與鮮樣相比下降18.8%，說(shuō)明板栗胚軸活力開始下降的臨界含水量在20%～25%之間； 當(dāng)含水量降至10%時(shí)，萌發(fā)率降至25.6%，大部分胚軸失去萌發(fā)能力，與正常種子脫水至含水量10%以下不影響萌發(fā)率的現(xiàn)象成鮮明對(duì)比。

圖1 不同含水量胚軸的萌發(fā)率Fig.1 Germination rate of embryo axis at different moisture content

2.2 熱力學(xué)特征分析

DSC熱分析顯示，隨著胚軸含水量降低，結(jié)晶起始溫度、峰值溫度和熱焓均呈規(guī)律性下降趨勢(shì)，二者呈顯著正相關(guān) (相關(guān)系數(shù)分別為r1=0.86、r2=0.83、r3=0.99)(圖2、表1)。此外，冷卻結(jié)晶階段峰值溫度低于加熱熔融階段，說(shuō)明不同含水量胚軸降溫過(guò)程中形成結(jié)晶的溫度低于升溫過(guò)程中結(jié)晶融解的溫度，胚軸在放熱和吸熱過(guò)程中存在結(jié)晶溫度差異。

由表1可知，在冷卻結(jié)晶階段，未經(jīng)脫水的胚軸結(jié)晶起始溫度為-10.6 ℃，峰值溫度為-12.0 ℃，熱焓為170.2 J·g-1dw，對(duì)應(yīng)的胚軸含水量為61%。當(dāng)含水量降至25%時(shí)，結(jié)晶起始溫度降至-37.2 ℃，峰值溫度降為-44.1 ℃，熱焓僅為5.0 J·g-1dw，這說(shuō)明在脫水過(guò)程中可結(jié)晶水含量急劇下降，結(jié)晶溫度顯著降低，因此，胚軸含水量在一定范圍內(nèi)越低時(shí)產(chǎn)生的結(jié)晶傷害風(fēng)險(xiǎn)越小，越有利于種子的低溫保存。 當(dāng)胚軸含水量降至20%及以下時(shí)，沒有結(jié)晶峰產(chǎn)生。加熱熔融階段熱力學(xué)特征也符合這一規(guī)律。

圖2 不同含水量胚軸熱分析Fig.2 Thermograms of embryo axes at different moisture content

胚軸含水量Embryo axis moisture content(%)冷卻結(jié)晶階段Cooling crystallisation加熱熔融階段Heating melting起始溫度Onset temperature/℃峰值溫度Peak temperature/℃熱焓Enthalpy/(J·g-1 dw)起始溫度Onset temperature/℃峰值溫度Peak temperature/℃熱焓Enthalpy/(J·g-1 dw)61(對(duì)照Control)-10.6±1.0a-12.0±1.0a170.2±11.3a-5.6±0.4a0±0.4a165.9±11.2a50-12.9±1.2b-14.7±1.5b114.8±13.6b-9.4±0.9b-2.5±0.7b120.2±11.9b40-16.1±2.4bc-17.2±3.3b61.4±13.9c-15.9±1.6c-5.7±2.2b68.1±12.2c30-20.9±0.3c-23.5±1.6c36.2±10.9c-21.7±4.3c-8.7±0.9c43.0±7.9d25-37.2±0c-44.1±0c5.0±0d-24.9±1.2d-16.5±2.7d13.4±11.8e20無(wú)結(jié)晶峰No peak無(wú)結(jié)晶峰No peak無(wú)結(jié)晶峰No peak無(wú)結(jié)晶峰No peak無(wú)結(jié)晶峰No peak無(wú)結(jié)晶峰No peak15無(wú)結(jié)晶峰No peak無(wú)結(jié)晶峰No peak無(wú)結(jié)晶峰No peak無(wú)結(jié)晶峰No peak無(wú)結(jié)晶峰No peak無(wú)結(jié)晶峰No peak10無(wú)結(jié)晶峰No peak無(wú)結(jié)晶峰No peak無(wú)結(jié)晶峰No peak無(wú)結(jié)晶峰No peak無(wú)結(jié)晶峰No peak無(wú)結(jié)晶峰No peak

圖3 不同含水量胚軸冷卻結(jié)晶(A)和加熱熔融(B)階段的熱焓Fig.3 The enthalpy of cooling crystallisation (A) and heating melting (B) of embryonic axes at different moisture content

2.3 臨界含水量

種子(胚)低溫保存的主要傷害來(lái)自于細(xì)胞內(nèi)外自由水結(jié)晶(冰晶)對(duì)細(xì)胞膜的破壞(Hamiltonetal., 2009; Aletal., 2015)，因此在低溫條件下保存板栗胚軸時(shí)應(yīng)盡量避免產(chǎn)生結(jié)晶傷害。本研究以冷卻結(jié)晶(圖3A)和加熱熔融(圖3B)階段的胚軸含水量為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的熱焓為縱坐標(biāo)，建立熱焓圖，其中趨勢(shì)線與X軸交叉點(diǎn)即為結(jié)晶臨界含水量。在冷卻結(jié)晶階段臨界含水量為23.9%，在加熱熔融階段臨界含水量為21.6%，二者非常接近，且均處于含水量20%～25%區(qū)間。由于自由水結(jié)晶傷害主要來(lái)自冷卻結(jié)晶階段，因此推斷‘煙泉’品種板栗的臨界含水量為23.9%。

2.4 種子低溫保存

根據(jù)DSC數(shù)據(jù)推測(cè)，將新鮮種子保存在產(chǎn)生冷卻結(jié)晶溫度之上的低溫環(huán)境中，不會(huì)影響種子活力。如圖4所示，在2 ℃低溫環(huán)境下，保存6個(gè)月的板栗種子萌發(fā)率達(dá)93.3%。種子萌發(fā)率、胚根和胚芽長(zhǎng)度沒有顯著差異(P>0.9)。在此溫度下將板栗種子保存至第2年春天進(jìn)行播種繁育，可有效解決頑拗性種子板栗的短期保存問(wèn)題。

2.5 胚軸超低溫保存

根據(jù)不同含水量胚軸的萌發(fā)結(jié)果和DSC熱力學(xué)數(shù)據(jù)，對(duì)不同含水量胚軸進(jìn)行液氮超低溫保存，其萌發(fā)率見表2。對(duì)于不同方法超低溫保存的胚軸，當(dāng)含水量在20%及以上時(shí)，所有方法均沒有萌發(fā)，說(shuō)明此時(shí)胚軸在超低溫保存過(guò)程中受到了嚴(yán)重冰凍傷害。當(dāng)含水量低于20%時(shí)，超低溫保存的胚軸部分萌發(fā)，在4種超低溫保存方法中，直接冷凍法和程序冷凍法的萌發(fā)率較低，一般低于10%； 玻璃化冷凍法和程序玻璃化冷凍法的萌發(fā)率相對(duì)較高，在15%～25%之間，說(shuō)明采用玻璃化冷凍保護(hù)液PVS2處理可提高胚軸超低溫保存后的成活率。由于含水量較低時(shí)(20%以下)胚軸會(huì)遭受脫水傷害，含水量較高時(shí)(20%以上)胚軸會(huì)遭受冷凍傷害，所以尋找一個(gè)合適的平衡點(diǎn)，并結(jié)合改進(jìn)保存技術(shù)，是板栗種子和胚軸成功保存的關(guān)鍵。

圖4 低溫保存板栗種子萌發(fā)情況Fig.4 Germination of chestnut seed at low temperature storage

表2 不同含水量胚軸超低溫保存的萌發(fā)率Tab.2 Germination rate of embryo axes after cryopreservation at different moisture content

3 討論

頑拗性種子保存難度大，其主要原因是其脫水敏感性，無(wú)法像正常性種子那樣耐受脫水，種子(胚)含水量是決定頑拗性種子生活力及保存壽命的關(guān)鍵因素 (Xiaetal., 2012; Jinetal., 2018)。殼斗科植物種子是溫帶地區(qū)常見的頑拗性種子，Xia等(2014)比較中國(guó)和美國(guó)4種櫟(Quercus)類頑拗性胚軸耐逆性影響因素，認(rèn)為胚芽比胚根在切除部位、脫水耐性和低溫耐性方面更加敏感。陶月良等(2004)研究板栗種子成熟前后脫水敏感性與可溶性糖、蛋白質(zhì)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)子葉和胚軸的可溶性蛋白譜帶存在較大差異，子葉含有較多的熱穩(wěn)定蛋白。宗梅等(2010)研究不同發(fā)育階段板栗種子的脫水敏感性，結(jié)果表明，板栗開花后90天種子中淀粉降解，可溶性糖含量增加，胚軸中可溶性蛋白也大量降解，推斷種子已轉(zhuǎn)入萌發(fā)狀態(tài)，由此認(rèn)為脫水敏感性與細(xì)胞膜透性并不完全相關(guān)。然而，Chen等(2018)對(duì)板栗、豌豆(Pisum)等多種頑拗性種子和正常種子對(duì)比分析后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞膜中磷脂酶Dα1介導(dǎo)的磷脂酸缺失是脫水誘導(dǎo)種子活力喪失的決定因素?？梢姡壳把芯拷Y(jié)果還未形成一個(gè)成熟的理論體系闡釋頑拗性種子脫水敏感性機(jī)制，而研究重點(diǎn)又多集中于種子發(fā)育階段和機(jī)制研究，對(duì)頑拗性種子臨界含水量探索較少且觀念不一，因此，需在種子萌發(fā)基礎(chǔ)上，結(jié)合DSC等技術(shù)手段，優(yōu)化臨界含水量的測(cè)定方法。

差示掃描量熱技術(shù)(DSC)是分析種子和胚軸水分熱力學(xué)變化的有效工具。種子或胚軸脫水過(guò)程中有 結(jié)晶起始溫度、結(jié)晶峰和未凍結(jié)含水量3個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，結(jié)晶峰的形成意味著胚軸組織冰晶傷害(Horetal., 2005; Nadarajanetal., 2008; Aletal., 2015)。本研究基于DSC，結(jié)合種子脫水萌發(fā)情況，測(cè)定‘煙泉’品種板栗胚軸的臨界含水量為23.9%，故在沒有特殊保護(hù)措施情況下，應(yīng)避免將胚軸脫水至該含水量以下，以免產(chǎn)生脫水傷害。同時(shí)，熱力學(xué)特征表顯示，未經(jīng)處理的板栗胚軸，冷卻結(jié)晶平均起始溫度為-10.6 ℃，理論上保存溫度高于該溫度就不會(huì)形成冰晶傷害，但是由于-10.6 ℃為平均值，不同個(gè)體之間冷卻結(jié)晶起始溫度可能存在差異，為了避免對(duì)不同個(gè)體的冷凍傷害，且方便生產(chǎn)實(shí)踐應(yīng)用(普通冰箱冷藏室)，本研究將板栗用自封袋密封保存在2 ℃環(huán)境中，定期擦拭凝結(jié)水，低溫保存6個(gè)月的種子萌發(fā)率和種苗性狀基本無(wú)變化，種子生活力不受影響，為短期保存板栗種子提供了可能，該方法簡(jiǎn)單易行，可用于生產(chǎn)中板栗春季播種育苗的種子保存。利用DSC技術(shù)可測(cè)定頑拗性種子臨界含水量，確定種子最適保存溫度和保存含水量，該方法準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便，可考慮作為頑拗性種子臨界含水量的測(cè)定方法。

超低溫是頑拗性種子保存的可行途徑，對(duì)于栗屬植物超低溫保存研究也有一些報(bào)道。Pence(1999)對(duì)7屬18種溫帶頑拗性種子進(jìn)行超低溫保存，發(fā)現(xiàn)栗、山核桃(Carya)、櫟這3個(gè)屬植物可獲得完全愈傷組織。鄭郁善等(2002)對(duì)比不同冷凍處理和解凍處理流程對(duì)板栗胚軸生活力的影響，得出各種解凍方式之間差異較小，含水量20%的胚軸萌發(fā)率最高為25%。Corredoira等(2004)對(duì)歐洲板栗合子胚和體胚進(jìn)行超低溫保存研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)合子胚含水量20%～24%時(shí)成活率較好，達(dá)63%。本研究采用4種冷凍方式對(duì)板栗胚軸進(jìn)行超低溫保存，顯示使用玻璃化冷凍法的胚軸萌發(fā)率明顯高于直接冷凍法，說(shuō)明玻璃化冷凍法更適合板栗胚軸保存。另外，無(wú)論是歐洲板栗、中國(guó)板栗還是中國(guó)板栗的不同品種之間，其超低溫保存條件都存在一定差異，且超低溫保存后恢復(fù)培養(yǎng)成苗率均存在較大幅度下降，說(shuō)明目前的超低溫保存方法還不能長(zhǎng)期有效保存板栗資源，仍需進(jìn)一步探索完善?；贒SC的種子低溫保存，可作為現(xiàn)階段板栗等頑拗性種子短期保存和生產(chǎn)應(yīng)用的有效途徑。

4 結(jié)論

板栗胚軸含水量降至20%及以下會(huì)對(duì)胚軸萌發(fā)活力產(chǎn)生影響，屬于典型頑拗性種子?；诓钍緬呙枇繜峒夹g(shù)，結(jié)合不同含水量胚軸萌發(fā)情況，可有效確定板栗等頑拗性種子的臨界含水量，‘煙泉’品種板栗胚軸的臨界含水量為23.9%。板栗種子在2 ℃低溫密封保存條件下可有效保存6個(gè)月以上，其萌發(fā)率、胚根和胚芽長(zhǎng)度無(wú)顯著變化。加入冷凍保護(hù)劑PVS2可提高板栗胚軸超低溫保存后的萌發(fā)率。