張 琪，額日赫木，王夢茹，張 芳，宋小青，郜 剛

(山西師范大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，山西 臨汾 041004)

馬鈴薯(Solanumtuberosum，L)是世界上四大糧食作物之一，富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素等多種營養(yǎng)素，深受消費(fèi)者和食品企業(yè)的青睞[1]。馬鈴薯在鮮切過程中極易發(fā)生酶促褐變，導(dǎo)致其感官品質(zhì)和營養(yǎng)價值大幅降低[2]。研究表明，PPO是鮮切馬鈴薯發(fā)生酶促褐變最主要的酶類，它可以催化酚類底物產(chǎn)生有色醌，醌再進(jìn)一步聚合形成黑色素物質(zhì)[3-4]。此外，POD在有H2O2存在時，也可通過催化酚類底物發(fā)生氧化，形成褐色產(chǎn)物[5]。因此，控制PPO和POD活性對保證鮮切馬鈴薯品質(zhì)意義重大。

化學(xué)護(hù)色劑是鮮切果蔬護(hù)色處理的主要方法之一，常用的護(hù)色劑有檸檬酸[6-7]、半胱氨酸[8]、酸性硫酸鈉[9]、抗壞血酸衍生物[10]等。曲酸作為一種安全無毒的天然護(hù)色劑，在抑制鮮切果蔬PPO、POD活性方面具有顯著效果[11]。它通過與底物的競爭性抑制、螯合酶活性中心銅離子和還原醌類化合物等多機(jī)制共同作用來抑制酶促褐變的發(fā)生。Shah等[12]研究表明，在20 d的貯藏期內(nèi)，采用6 mmol/L的曲酸可以降低荔枝PPO和POD活性，并延緩了其果皮褐變。王擎等[13]以馬鈴薯和蓮藕為材料，研究了不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)曲酸處理的鮮切樣品的色澤和相關(guān)酶活性在模擬貨架期(4℃)內(nèi)的變化，結(jié)果表明，曲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.3%和0.5%時，鮮切馬鈴薯和蓮藕的色澤得到了較好的保護(hù)，同時PPO、POD和PAL活性也得到了有效抑制。

近年，物理技術(shù)的發(fā)展為鮮切果蔬防褐變研究提供了新的思路。如氣調(diào)保鮮[14]、超聲波[15-16]、超高壓[17-18]、紫外線[19]等方法都得到了廣泛應(yīng)用。浸漬是食品加工中一種常用的加工方式，它通過滲透作用，將浸漬液中的溶質(zhì)遷移到食品物料內(nèi)部。真空浸漬技術(shù)(VI)是將真空技術(shù)引入到浸漬工藝中的一項(xiàng)新技術(shù)，在食品工業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用基礎(chǔ)[20-21]。真空過程中，物料組織間隙內(nèi)的氣體會發(fā)生膨脹，并逐漸被排出。浸漬過程中，在壓力差驅(qū)動下促使外部浸漬液滲透到組織間隙。VI與傳統(tǒng)的浸漬工藝相比具有用時短、操作簡單和對食品組織結(jié)構(gòu)及營養(yǎng)物質(zhì)的破壞作用小等優(yōu)勢。如Perez-Cabrera等[22]通過VI與褐變抑制劑結(jié)合對梨的防褐變研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)浸漬處理鮮切梨在4℃下可保存20 d，且樣品的褐變程度較小。表明VI可與褐變抑制劑相結(jié)合用于果蔬防褐變處理,但此方法應(yīng)用于馬鈴薯的的研究還未有報道。故本研究以鮮切馬鈴薯為對象，擬采用VI輔助曲酸抑制其PPO和POD活性。首先通過單因素試驗(yàn)考察VI條件對PPO和POD活性的抑制效果；在此基礎(chǔ)上，分別以PPO和POD活性為評價指標(biāo)，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計和響應(yīng)面(RSM)分析方法確定最佳VI工藝條件，以期為抑制鮮切馬鈴薯在加工和貯藏過程中的褐變提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

克新1號馬鈴薯，市售，產(chǎn)自內(nèi)蒙古；鄰苯二酚，分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司；曲酸，食品級，廣東味多美食品配料有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，均為分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；愈創(chuàng)木酚，分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；過氧化氫 30%，分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；無水乙醇，分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PC-3塑料真空干燥器，上海越磁電子科技有限公司；2XZ-1真空泵，上海萬經(jīng)泵業(yè)制造有限公司；752紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；H1805R臺式高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；LC-Q01切片機(jī)，佛山市順德區(qū)韓泰電器有限公司；PHS-25數(shù)顯pH計，上海化科實(shí)驗(yàn)器材有限公司。

1.3 方法

1.3.1試料褐變抑制處理方法

馬鈴薯經(jīng)過清洗、去皮，切片(0.3 cm)，置于含有300 ml曲酸溶液的燒杯中，再將其置于VI裝置內(nèi)進(jìn)行處理。VI裝置主要由真空泵和密閉容器(雙閥門PC干燥器)組成，系統(tǒng)恒定的真空度約為15.11×10-3mPa。真空處理：啟動真空泵，密閉容器中樣品和浸漬液的空氣被逐漸排出。浸漬處理：關(guān)閉真空泵，打開密閉容器閥門，使系統(tǒng)恢復(fù)大氣壓狀態(tài)，曲酸溶液(浸漬液)在壓差的驅(qū)動下逐漸向樣品組織間隙內(nèi)滲透。

1.3.2粗酶液的提取及PPO和POD活性的測定

參照Tribst等[23]的研究提取粗酶液，稍作改動。將馬鈴薯片切割成小塊，稱取5 g樣品加入30 ml預(yù)冷的磷酸緩沖液(0.1 mol/L,pH6.8,4℃)研磨、過濾，在10 000 r/min、4℃下離心15 min，上清液即為粗酶液，進(jìn)行PPO和POD活性測定。

PPO活性參照Zhang等[24]的方法進(jìn)行檢測，有改動。分別取2 ml的磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH6.8)，1 ml 0.02 mol/L的鄰苯二酚，混勻，在30℃下預(yù)熱5 min，加入1 ml粗酶液，在410 nm處測定其吸光值，每隔30 s記錄1次，共記錄3 min。一個酶活性單位(U)定義為：測定條件下，每分鐘引起吸光值改變0.001所需的酶量(ml)。

，

(1)

式中，EA為酶活性，U/ml；△OD410為反應(yīng)時間內(nèi)吸光值的變化；t為反應(yīng)時間，min；D為稀釋倍數(shù)。

POD活性參照王禮群等[25]的方法進(jìn)行檢測，有改動。取1 ml愈創(chuàng)木酚、2 ml H2O2和1 ml的磷酸緩沖溶液于試管中，再加入1 ml粗酶液，搖勻，在470 nm處測定吸光值，每隔30 s記錄1次，共記錄3 min。一個酶活性單位(U)定義為：測定條件下，每分鐘引起吸光值改變0.001所需的酶量(ml)。

，

(2)

式中，EA為酶活性，U/ml；△OD470為反應(yīng)時間內(nèi)吸光值的變化；t為反應(yīng)時間，min；D為稀釋倍數(shù)。

1.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計

單因素試驗(yàn)中，選擇真空時間、浸漬時間、曲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為VI處理的3個主要條件，見表1。

表1 單因素試驗(yàn)設(shè)計

按表1設(shè)計試驗(yàn)，分別考察3個因素對鮮切馬鈴薯PPO和POD活性的影響，以此來篩選出最佳VI處理?xiàng)l件。

1.5 RSM優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 8.0 統(tǒng)計分析軟件中Box-Behnken中心組試驗(yàn)設(shè)計原理，以真空時間(X1)，浸漬時間(X2)和曲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X3)為自變量，分別以鮮切馬鈴薯PPO和POD活性為響應(yīng)值(Y1，Y2)，設(shè)計三因素三水平RSM試驗(yàn)。各因素和水平見表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示，單因素試驗(yàn)利用IBM SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用鄧肯氏多重范圍比較法進(jìn)行顯著性分析，利用Origin 2018軟件進(jìn)行作圖。Design Expert 8.0軟件設(shè)計響應(yīng)面試驗(yàn)方案并進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1真空時間對鮮切馬鈴薯PPO和POD活性的影響

真空時間對鮮切馬鈴薯PPO和POD活性的影響見圖1。

圖1 真空時間對鮮切馬鈴薯PPO和POD活性的影響

如圖1所示，隨著真空時間的延長，鮮切馬鈴薯的PPO和POD活性均呈平緩下降趨勢。在真空時間為12～15 min時，其PPO和POD活性較低，且無顯著性差異(P<0.05)，分別為471.2～476.268 U/ml和126.35～133.632 U/ml。與對照組(0 min)相比，PPO和POD活性分別下降了40.38%和34.05%。隨著真空時間的延長，有利于外部曲酸浸漬液向馬鈴薯內(nèi)部滲透，從而提高浸漬效率。Hironaka等[26]用10%的抗壞血酸溶液對馬鈴薯進(jìn)行VI處理(真空度9.33 kPa，真空時間0～60 min，浸漬時間3 h)，結(jié)果表明，隨著真空時間的延長，馬鈴薯塊莖抗壞血酸的含量也在逐漸增加，且真空處理60 min時的抗壞血酸含量是普通馬鈴薯的21倍，說明真空時間的延長有利于更多的浸漬液滲透到原料組織間隙。但延長到一定時間時，物料間隙內(nèi)的空氣被排出，最終達(dá)到恒定值，表明此時馬鈴薯的有效空隙率已達(dá)到了最大值[27]，即進(jìn)入其細(xì)胞間隙的曲酸溶液達(dá)到了最大值。因此，真空12 min后PPO和POD活性逐漸穩(wěn)定，且沒有出現(xiàn)明顯下降趨勢。故最佳的真空處理時間為12～15 min。

2.1.2浸漬時間對鮮切馬鈴薯PPO和POD活性的影響

浸漬時間對鮮切馬鈴薯PPO和POD活性的影響見圖2。

圖2 浸漬時間對鮮切馬鈴薯PPO和POD活性的影響

如圖2所示，隨著浸漬時間的延長，鮮切馬鈴薯PPO和POD活性均呈緩慢下降趨勢；當(dāng)浸漬時間為8～10 min時，其PPO和POD活性較低，且無顯著性差異(P<0.05)，分別為542.132～561.134 U/ml和133.95～149.784 U/ml。與對照組(0 min)相比，PPO和POD活性分別降低了31.41%和32.21%。浸漬時間是影響浸漬效果的主要因素之一，在壓力差的驅(qū)動下，物料外部的浸漬液逐漸向物料組織滲透，并經(jīng)過一定時間后達(dá)到飽和(物料內(nèi)外壓力差達(dá)到平衡)[27]，而在本研究中，浸漬時間達(dá)到8 min時，曲酸溶液的滲透量可能達(dá)到了最大值。因此，浸漬8 min后，曲酸溶液的滲透量不再增加，因此鮮切馬鈴薯PPO和POD活性也不會發(fā)生變化。故最佳浸漬時間應(yīng)為8～10 min。

2.1.3曲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對鮮切馬鈴薯PPO和POD活性的影響

曲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對鮮切馬鈴薯PPO和POD活性的影響見圖3。

如圖3所示，在曲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0～0.5%時，鮮切馬鈴薯PPO和POD活性均呈緩慢下降趨勢。當(dāng)增大至0.75%～1.25%時，其PPO和POD活性較低，且無顯著性差異(P<0.05)，分別為580.134～604.2 U/ml、127.934～135.218 U/ml。與對照組(0%)相比，PPO和POD活性分別降低了26.72%和29.37%。在VI過程中，如果其他條件恒定時，物料的浸漬效率隨著浸漬液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增加。因此，在曲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0～0.5%時，隨著曲酸溶液滲透量的逐漸增加，鮮切馬鈴薯PPO和POD活性呈下降趨勢。但浸漬液濃度過高可能會阻礙溶質(zhì)向物料組織內(nèi)的傳質(zhì)，從而降低傳質(zhì)效率[27]，因此曲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.75%～1.25%時，其在樣品組織間隙內(nèi)的滲透可能達(dá)到了飽和，故鮮切馬鈴薯PPO和POD活性不再變化。所以最佳曲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.75%～1.25%。

圖3 曲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對鮮切馬鈴薯PPO和POD活性的影響

綜上所述，在VI輔助作用下，曲酸能夠顯著抑制鮮切馬鈴薯PPO、POD活性。隨著真空時間、浸漬時間、曲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，其PPO、POD活性得到了有效抑制。從節(jié)約成本和時間的方面考慮，最佳的VI處理?xiàng)l件分別確定為：真空時間12 min，浸漬時間8 min，曲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.75%。

2.2 響應(yīng)面分析

2.2.1PPO響應(yīng)面分析

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計方案及結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計方案及結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計方案及ANOVA分析方法進(jìn)行二次回歸分析，得到各因素變量與響應(yīng)值Y1的回歸方程為：

Y1=408.76+4.26X1+43.63X2-31.96X3+

33.85X1X2+33.67X1X3-7.09X2X3+

80.59X12+11.17X22+66.32X32。

對回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。

表4 回歸方程系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)

注：* 表示差異顯著，P< 0.05；**表示差異極顯著，P< 0.01；— 表示差異不顯著。

等高線的形狀反應(yīng)了各因素之間交互效應(yīng)的大小，圓形表示兩因素交互作用不明顯，橢圓形表示交互作用顯著。如圖4所示，當(dāng)浸漬時間不變時，隨著真空時間的增加，PPO活性先下降后上升；當(dāng)真空時間不變時，隨著浸漬時間的增加，PPO活性保持上升，變化較為緩慢。由圖5可知，當(dāng)浸漬時間不變時(8 min)，真空時間和曲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的交互作用較為顯著。當(dāng)真空時間不變時，PPO活性隨著曲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加先下降后上升。反之也有同樣的規(guī)律。如圖6所示，當(dāng)浸漬時間不變，隨著曲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，PPO活性先下降再上升，但變化程度都相對比較平緩，說明浸漬時間和曲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的交互作用對鮮切馬鈴薯PPO活性作用不大。

圖4 真空時間和浸漬時間對鮮切馬鈴薯PPO活性的作用圖

圖5 真空時間和曲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對鮮切馬鈴薯PPO活性的作用圖

圖6 浸漬時間和曲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對鮮切馬鈴薯PPO活性的作用圖

通過回歸模型進(jìn)行數(shù)學(xué)分析，得到抑制鮮切馬鈴薯PPO活性的最佳VI條件：真空時間為11.70 min，浸漬時間為7.40 min，曲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.76%。在此條件下，PPO的理論預(yù)測值為403.369 U/ml。綜合實(shí)際條件，適當(dāng)改變理論條件：真空時間為12 min，浸漬時間為7.5 min，曲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.76%。采用VI條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的實(shí)際PPO活性為412.26 U/ml，與理論值比較，相對誤差在2.2%左右，證明理論值和實(shí)際值的擬合較好。因此采用RSM優(yōu)化得到的VI條件，在實(shí)際應(yīng)用中是可行的。

2.2.2POD響應(yīng)面分析

試驗(yàn)結(jié)果如表5所示，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計方案及ANOVA分析方法進(jìn)行二次回歸分析，得到各因素變量與響應(yīng)值Y2的回歸方程為：

Y2=97.53-10.67X1+6.65X2+1.75X3-

10.00X1X2-9.21X1X3-3.54X2X3+

28.59X12+10.30X22+14.75X32。

對回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表6。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計方案及結(jié)果

表6 回歸方程系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)

注：*表示差異顯著，P<0.05；**表示差異極顯著，P<0.01；—表示差異不顯著。

如圖7所示，當(dāng)曲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)不變時(0.75%)，真空時間與浸漬時間的交互作用明顯。當(dāng)真空時間一定時，隨著浸漬時間的增加，POD活性先下降后上升。反之，當(dāng)浸漬時間一定時，隨著真空時間的增加，POD活性先降低后上升。圖8表示當(dāng)浸漬時間為8 min時，真空時間和曲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對POD活性的影響。真空時間不變時，POD活性隨著曲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加先下降后上升。反之也有同樣的規(guī)律。當(dāng)真空時間為12 min時，浸漬時間和曲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的交互作用見圖9，此時POD活性隨著兩個因素值的增加而緩慢降低，達(dá)到最小值以后又緩慢上升。

圖7 真空時間和浸漬時間對鮮切馬鈴薯POD活性的作用圖

圖8 真空時間和曲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對鮮切馬鈴薯POD活性的作用圖

圖9 浸漬時間和曲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對鮮切馬鈴薯POD活性的作用圖

通過回歸模型進(jìn)行數(shù)學(xué)分析，得到抑制鮮切馬鈴薯POD活性的最佳VI條件：真空時間為12.26 min，浸漬時間為7.73 min，曲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.75%。在此條件下，POD的理論預(yù)測值為95.898 U/ml。綜合實(shí)際條件，適當(dāng)改變理論條件：真空時間為12 min，浸漬時間為8 min，曲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.75%。采用VI條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的實(shí)際POD活性為97.75 U/ml，與理論值比較，相對誤差在1.93%左右，證明理論值和實(shí)際值的擬合較好。因此采用RSM優(yōu)化得到的VI條件在實(shí)際應(yīng)用中是可行的。

3 結(jié)論

根據(jù)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)對鮮切馬鈴薯PPO和POD活性的抑制條件進(jìn)行研究，考察了真空時間、浸漬時間和曲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對鮮切馬鈴薯PPO和POD活性的交互作用。結(jié)果表明：真空時間、浸漬時間、曲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對鮮切馬鈴薯PPO活性均有著顯著影響，各因素對PPO影響次序?yàn)椋航n時間>曲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)>真空時間對POD影響次序?yàn)椋赫婵諘r間>浸漬時間>曲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。選取PPO的最佳VI條件參數(shù)為：真空時間為12 min，浸漬時間為7.5 min，曲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.76%；POD的最佳VI條件參數(shù)為：真空時間為12 min，浸漬時間為8 min，曲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.75%。結(jié)合驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果，說明本試驗(yàn)研究的最佳條件參數(shù)有實(shí)際參考價值。