韓蕓嬌，肖霄，張彬，張媛媛

（石家莊學(xué)院化工學(xué)院，河北 石家莊 050035）

空氣等離子體屬于低溫等離子體的范疇，是在活化放電時(shí)激發(fā)形成的等離子體。放電裝置為電火花發(fā)射器，它的工作原理是利用高壓變壓器把220 V 交流電壓升高至2 500 V～3 000 V，使發(fā)射器兩電極間發(fā)生火花放電，產(chǎn)生高頻電，高頻電流饋送至串聯(lián)的諧振電路中，再經(jīng)高頻變壓器升壓到180 kV～210 kV，最后在尖端電極上放射出強(qiáng)力火花。在大氣壓室溫環(huán)境下，電火花發(fā)射器作用于周?chē)目諝?，電火花發(fā)生器在空氣中發(fā)射火花弧光（肉眼可見(jiàn)紫色光），產(chǎn)生較為復(fù)雜的等離子體[1]。等離子體產(chǎn)生時(shí)間短，活性粒子對(duì)樣品作用后快速消失，使得等離子體具有作用效率高，操作方便，安全無(wú)污染等特點(diǎn)，這些特性拓寬了等離子體的應(yīng)用領(lǐng)域。應(yīng)用領(lǐng)域主要包括：改變高分子材料表面性質(zhì)[2]、工業(yè)三廢的處理[3-4]、微生物滅菌誘變[5-6]等。等離子體形成過(guò)程中可以產(chǎn)生紫外線，能量粒子和帶電粒子[7]，使其可在醫(yī)用材料的表面滅菌、菌膜的清理、生化武器的消除等方面發(fā)揮作用。

目前，關(guān)于等離子體的生物效應(yīng)的研究集中于細(xì)胞膜上的多糖和蛋白質(zhì)的降解[8]，對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的致命的破壞[9]，并最終致使細(xì)胞裂解，內(nèi)溶物溶出等。本試驗(yàn)從生物學(xué)角度研究了空氣等離子體對(duì)面包酵母的作用效應(yīng)。酵母是一種真核生物，細(xì)胞壁主要由D-葡聚糖和D-甘露聚糖兩類(lèi)多糖組成，相較于細(xì)菌它的細(xì)胞壁更加堅(jiān)硬。通過(guò)生物學(xué)效應(yīng)的研究，為等離子體殺菌[10-12]及后續(xù)試驗(yàn)等離子體微生物誘變[13]等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

面包酵母3G-28 實(shí)驗(yàn)室保藏；酵母膏（生化試劑）、蛋白胨（生化試劑）、瓊脂粉（生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖（分析純）：西隴化工股份有限公司；吉姆薩染液（分析純）：北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛血清白蛋白（生化試劑）：北京索萊寶科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250（分析純）：北京博奧拓達(dá)科技有限公司；鹽酸（分析純）、乙醇（分析純）、磷酸（分析純）：北京化工廠。

恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9052）：天津順諾股份有限公司；搖床（MX-YZ）：金壇市梅香儀器有限公司；超凈臺(tái)（SW-CJ-1Cu）：鄭州宏朗有限公司；紫外分光光度計(jì)（UV-6100BS）：上海美普達(dá)股份有限公司；高溫滅菌鍋（LX-B100L）：合肥華泰有限公司；電火花發(fā)射及檢測(cè)器：三魚(yú)電氣設(shè)備有限公司；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市杰瑞爾電器有限公司；3K15 高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)Sigma 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌體的培養(yǎng)

用接種環(huán)挑取一環(huán)實(shí)驗(yàn)室保藏的斜面酵母菌種3G-28，無(wú)菌條件下接種于酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中[14-17]，置于恒溫?fù)u床，30 ℃，150 r/min 培養(yǎng) 36 h，再于 4 ℃冰箱中靜置 3 h[18]，離心（3 000 r/min，10 min），無(wú)菌水清洗后，稀釋?zhuān)鶆蛲坎荚诠腆w培養(yǎng)基上，放入培養(yǎng)箱中靜置，30 ℃培養(yǎng)24 h。挑取平板上單菌落接種于斜面培養(yǎng)基中，30 ℃，培養(yǎng)24 h 后，置于4 ℃冰箱中保存，每月定期傳代保存。

1.2.2 空氣等離子體處理方式

取適當(dāng)稀釋后的菌液5 mL 置于內(nèi)徑為71 mm 的培養(yǎng)皿中，液體深度為2 mm，將培養(yǎng)皿放置于電火花發(fā)射裝置下方，調(diào)整發(fā)射端與液面距離為1 cm，控制空氣等離子體處理樣品的時(shí)間分別為 0、1、2、3、4、5 min（操作過(guò)程中肉眼可見(jiàn)紫色光線）。

1.2.3 空氣等離子體對(duì)面包酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

適當(dāng)稀釋經(jīng)過(guò)空氣等離子體作用后的菌懸液，取100 μL 均勻涂布在平板上，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，菌落計(jì)數(shù)并計(jì)算不同處理時(shí)間后菌液細(xì)胞的存活率，每個(gè)處理時(shí)間做3 組平行試驗(yàn)。

1.2.4 菌液pH 值和溫度的測(cè)定

用pH 計(jì)和溫度計(jì)測(cè)定經(jīng)空氣等離子體處理過(guò)的菌懸液的pH 值和溫度，每個(gè)條件做3 組平行試驗(yàn)。

1.2.5 菌液pH 值對(duì)酵母細(xì)胞存活率影響的測(cè)定

用稀鹽酸調(diào)節(jié)菌液pH 值至3.05（空氣等離子體處理5 min 后的pH 值），與未調(diào)節(jié)pH 值的菌液分別經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋后，均勻涂布在固體培養(yǎng)基上，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，計(jì)算菌落數(shù)。

1.2.6 細(xì)胞染色及生長(zhǎng)狀態(tài)的觀察

吉姆薩染液的配制方法：稱取1 g 吉姆薩染料，加入66 mL 甘油，混合均勻，置于60 ℃恒溫水浴鍋中溶解2 h，取出冷卻，加入66 mL 甲醇，混合均勻作為吉姆薩原液，使用前將原液用磷酸緩沖鹽溶液稀釋十倍即可使用。

分別取適量經(jīng)不同時(shí)間處理后的菌液涂于載玻片上，自然風(fēng)干，用吉姆薩染液染色2 min，無(wú)菌水沖去多余染液，置于顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況。適當(dāng)稀釋不同時(shí)間處理后的菌液，涂布平板，置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并觀察酵母菌的生長(zhǎng)情況。

1.2.7 面包酵母胞外蛋白含量的測(cè)定

將經(jīng)過(guò)不同時(shí)間處理的菌懸液離心（3 000 r/min，10 min），取出上清液，測(cè)定酵母細(xì)胞外蛋白含量，測(cè)定方法為考馬斯亮藍(lán)法[19-21]。

考馬斯亮藍(lán)法是測(cè)定微量蛋白濃度時(shí)的常用方法，該方法快速靈敏且定量測(cè)定。原理是在酸性溶液中，考馬斯亮藍(lán)G-250 與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)能夠改變?nèi)玖献畲笪辗宓牟ㄩL(zhǎng)，從465 nm 變成595 nm，溶液的顏色發(fā)生變化（紅色變藍(lán)色），進(jìn)而測(cè)定波長(zhǎng)為595 nm 處時(shí)光吸收的值，就可以計(jì)算求得其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。

1.2.7.1 試劑的配制

標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用0.15 mol/L NaCl 溶液配制1 mg/mL 牛血清白蛋白溶液。

考馬斯亮藍(lán)試劑：稱取考馬斯亮藍(lán)G-250 100 mg溶于50 mL 乙醇（95%）中，再加入100 mL 磷酸（85%），混和均勻后加入去離子水稀釋?zhuān)? 000 mL，配好的溶液置于避光處過(guò)夜，濾紙過(guò)濾后使用。

1.2.7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液 10、20、30、40、50、60 μL 分別置于潔凈試管中，加水至1 mL，再加入5 mL 考馬斯亮藍(lán)試劑，混和均勻后靜置5 min，在波長(zhǎng)為595 nm 處測(cè)定吸光值，3 組平行試驗(yàn)。

1.2.7.3 樣品的測(cè)定

取適量待測(cè)樣品，按1.2.7.2 中方法處理，使測(cè)得樣品的吸光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，以求得不同處理時(shí)間的胞外蛋白含量。

1.2.8 面包酵母胞外核酸含量的測(cè)定

將經(jīng)過(guò)空氣等離子體作用不同時(shí)間的菌懸液離心（8 000 r/min，10 min），取出上清液，用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定不同波長(zhǎng)下（260 nm 和280 nm）的吸光度值。核苷酸濃度計(jì)算公式如下[22]：

核苷酸/（μg/mL）=（11.87A260-10.4A280）×100/9

2 結(jié)果和分析

2.1 空氣等離子體對(duì)面包酵母3G-28細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

量取5 mL 菌液置于電火花發(fā)射裝置下方，作用不同時(shí)間，試驗(yàn)結(jié)果如圖1 所示。

圖1 空氣等離子體處理面包酵母3G-28 細(xì)胞的存活曲線Fig.1 Survival curve of 3G-28 treated with the air plasma

空氣等離子體能夠?qū)湍讣?xì)胞造成損傷并致其死亡，細(xì)胞的存活率隨作用時(shí)間增加呈下降趨勢(shì)。3 min時(shí)，酵母細(xì)胞的存活率為37.355%；4 min 以后存活率下降速率趨于平緩，5 min 時(shí)，存活率為29.797%。

2.2 空氣等離子體對(duì)3G-28酵母菌懸液pH值和溫度的影響

空氣等離子體對(duì)BY-3 酵母菌懸液溫度和pH 值的影響見(jiàn)圖2。

圖2 空氣等離子體對(duì)3G-28 酵母菌懸液溫度和pH 值的影響Fig.2 Effects of the air plasma on temperature and pH value of 3G-28

由圖2 可知，空氣等離子體的作用能夠使菌液的溫度和pH 值發(fā)生變化。作用5 min 后，菌液溫度由25.0 ℃升至31.1 ℃，上升5.1 ℃，此溫度范圍亦屬于酵母3G-28 的生長(zhǎng)溫度范圍。同時(shí)，被處理后菌液的pH值隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，2 min 之前，pH 值下降較為明顯，隨后pH 值降低較為緩慢，5 min 時(shí)，由最初的5.25 降低至3.05。

2.3 菌液pH值對(duì)酵母3G-28細(xì)胞存活率的影響

pH 值對(duì)BY-3 細(xì)胞存活率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 pH 值對(duì)3G-28 細(xì)胞存活率的影響Fig.3 Effects of pH on surviving number of 3G-28

由圖3 可知，當(dāng)菌液的pH 值分別為3.05 和5.25時(shí)，酵母細(xì)胞的存活情況基本一致。說(shuō)明在等離子體作用過(guò)程中，pH 值的下降并不是導(dǎo)致酵母細(xì)胞死亡的主要原因。

2.4 空氣等離子體面包酵母3G-28細(xì)胞染色及生長(zhǎng)狀態(tài)的影響

處理后細(xì)胞染色觀察見(jiàn)圖4。

圖4 處理后細(xì)胞染色觀察Fig.4 Microscopic examination of stained BY-3 cells after the plasma treatment

由圖4 所示，細(xì)胞的染色包括化學(xué)的親和作用和物理的吸附作用，不同的細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)成分不同，通透性也存在差異，這就使得細(xì)胞對(duì)不同染料所表現(xiàn)出的親和吸附能力有所不同，染色程度存在差異。試驗(yàn)使用相同的染色方法對(duì)空氣等離子體作用前后的面包酵母3G-28 的細(xì)胞進(jìn)行染色，在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)經(jīng)空氣等離子體作用后細(xì)胞染色會(huì)加深。處理5 min后的酵母3G-28 的細(xì)胞染色程度明顯大于處理1 min后的細(xì)胞染色程度。表明空氣等離子體的作用對(duì)酵母的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)造成了破壞，使得細(xì)胞通透性發(fā)生了變化，通透性增加能夠使染料進(jìn)入細(xì)胞更加容易。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)空氣等離子體作用后，部分細(xì)胞呈現(xiàn)出一定的生長(zhǎng)延遲現(xiàn)象，生長(zhǎng)速度相較于對(duì)照組較慢。

2.5 空氣等離子體對(duì)面包酵母3G-28胞外蛋白的影響

蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖5。

圖5 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard protein curve for routine protein assay

蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5 所示，蛋白質(zhì)濃度在10 μg/mL～60 μg/mL 的范圍內(nèi)時(shí)，A595nm與蛋白質(zhì)濃度的線性關(guān)系良好，y=0.008 7x+0.029 1，R2=0.995 0?？諝獾入x子體作用菌液不同時(shí)間所求得的面包酵母3G-28 的胞外蛋白含量如圖6 所示。

圖6 空氣等離子體對(duì)胞外蛋白含量的影響Fig.6 Change in extracellular protein concentration of 3G-28 after the plasma treatment

由圖6 可知，隨作用時(shí)間的增加，胞外蛋白含量明顯增加，作用2 min 時(shí)，胞外蛋白含量增長(zhǎng)緩慢，3 min后增速明顯加快。作用5 min 時(shí)，胞外蛋白含量達(dá)到35.21 μg/mL，與未經(jīng)作用的3G-28 菌液相比，胞外蛋白含量增多了近1.5 倍，變化顯著。

2.6 空氣等離子體對(duì)酵母3G-28細(xì)胞胞外核酸的影響

空氣等離子體對(duì)BY-3 細(xì)胞胞外核酸的影響見(jiàn)圖7。

圖7 空氣等離子體對(duì)3G-28 細(xì)胞胞外核酸的影響Fig.7 Change in extracellular nucleic acid concentration of 3G-28 after the plasma treatment

由圖7 可以看出，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，酵母3G-28 的細(xì)胞胞外核酸逐漸含量增加，5 min 時(shí)胞外核酸含量達(dá)到3.64 μg/mL，是原始菌液胞外核酸含量的2倍左右。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究空氣等離子體對(duì)酵母3G-28 細(xì)胞的部分生物學(xué)效應(yīng)的影響，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：

1）在空氣等離子體作用下，酵母菌液的溫度和pH值均發(fā)生變化，作用5min，菌液溫度由25.0 ℃升至31.1 ℃，pH 值由 5.25 降低至 3.05，2 min 后，pH 值下降較為緩慢，但溫度和pH 值的變化并不影響菌落的生長(zhǎng)情況；

2）作用5 min 時(shí)，酵母3G-28 細(xì)胞的胞外蛋白和核酸含量均增加，胞外蛋白含量為35.21 μg/mL，較初始值增加了1.5 倍，同時(shí)胞外核酸含量達(dá)到3.64 μg/mL，是原始菌液胞外核酸含量的2 倍左右；酵母3G-28 細(xì)胞的存活率隨作用時(shí)間增加呈下降趨勢(shì)，5 min 時(shí)，存活率為29.797%。

3）顯微鏡下觀察酵母3G-28 的染色細(xì)胞，隨空氣等離子體處理時(shí)間增加，染色逐漸加深。

空氣等離子體能夠?qū)湍讣?xì)胞造成損傷并致其死亡，空氣等離子在試驗(yàn)過(guò)程中可產(chǎn)生活性氧，會(huì)在一定程度上對(duì)菌體細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜造成破壞，使細(xì)胞內(nèi)溶物溶出，如蛋白質(zhì)和核苷酸。由此認(rèn)為，空氣等離子體對(duì)酵母細(xì)胞的直接和間接作用產(chǎn)生的活性氧可能是使得酵母3G-28 細(xì)胞損傷和死亡的主要原因。