李小玉，劉敬，，楊懋勛，趙斌

（1.中山火炬職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 中山 528436；2.國家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心中山健康產(chǎn)品分中心，廣東 中山 528436；3.珠海大橫琴科技發(fā)展有限公司，廣東 珠海 519000；4.珠?；羝战鹚贯t(yī)藥研究院股份有限公司，廣東 珠海 519000）

燕窩是金絲燕吐出的絲狀膠狀物，多產(chǎn)自印度尼西亞、泰國、馬來群島、澳大利亞及中國，具有很高的營養(yǎng)價值和藥用價值。燕窩一般由水、脂質(zhì)、唾液酸、蛋白質(zhì)、糖類化合物、氨基酸、纖維、無機(jī)物質(zhì)等組成，不同種類燕窩其組成不盡相同。隨著燕窩市場不斷擴(kuò)大，燕窩的摻偽鑒別已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)[1-4]。目前，燕窩的鑒別研究主要有圖譜鑒別、DNA 鑒別、核磁共振鑒別、顯微鑒別，但不管是哪一種方法均存在某種缺陷和不足[4-8]。由于燕窩化學(xué)組成復(fù)雜，通過分離活性物再進(jìn)行儀器分析鑒定的方法往往需要復(fù)雜的前處理過程。

目前，利用電化學(xué)振蕩反應(yīng)獲取中藥材指紋圖譜，常用作中藥材的鑒別。其中以溴酸鹽為代表的別洛索夫-扎鮑廷斯基化學(xué)振蕩反應(yīng)（Belousov-Zhabotinskii osciliating reaction，B-Z）體系最為常見，體系由BrO3--Org-M+-H+-丙二酸組成，其中Org 為有機(jī)底物，M+為金屬離子催化劑，通常是Ce4+/Ce3+、Mn3+/Mn2+、Fe（Phen）33+/Fe（Phen）32+等[9-10]。

試驗以BrO3--Ce2+-H+-丙二酸為振蕩體系，燕窩水解液為耗散底物，在恒定溫度、攪拌速度的條件下得到具有特征波形的電化學(xué)指紋圖譜，并利用指紋圖譜特征參數(shù)鑒別燕窩及其偽品。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

OrigaFlex500 型化學(xué)工作站：法國歐力加公司；232 型甘汞參比電極、DJS-1C 型鉑黑電導(dǎo)電極：上海精密科學(xué)儀器有限公司；150mL 玻璃反應(yīng)器、DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：河南矛華儀器有限公司。

硫酸：廣州萬從化工有限公司；硫酸鈰銨、丙二酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；溴酸鈉：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；所用試劑均為分析純，所用溶液均以二次蒸餾水配制。白燕碎、血燕碎、黃燕碎：新加坡龍標(biāo)燕窩私人有限公司；魚膠：中智大藥房連鎖有限公司；海藻酸鈉：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 測定方法

1.2.1 燕窩前處理

燕窩烘干研磨，過120 目篩得到燕窩粉末。稱取0.112 0 g 燕窩粉置于玻璃試管，加入5.00 mL 1.0 mol/L硫酸于烘箱中40 ℃下水解12 h，過濾得到燕窩水解液。偽品處理過程同燕窩。

1.2.2 B-Z 振蕩反應(yīng)

將5.00 mL 燕窩水解液、5.00 mL 2.0 mol/L 硫酸、10.00 mL 1.8 mol/L 丙二酸、10.00 mL 0.016 mol/L 硫酸鈰銨，置于150 mL 玻璃反應(yīng)容器內(nèi)，搖勻，蓋好帶注射孔和電極的反應(yīng)器蓋。在35 ℃，攪拌速度500 r/min 條件下，加入10.00 mL 1.0 mol/L 溴酸鉀，同時以甘汞為參比電極，Pt 黑電極為工作電極，用電化學(xué)工作站記錄電化學(xué)振蕩體系的電位（E）隨時間（t）的變化曲線。

1.3 電化學(xué)指紋圖譜

電化學(xué)振蕩指紋圖譜是以中藥為底物，通過調(diào)整化學(xué)振蕩體系中各種化學(xué)物質(zhì)濃度和化學(xué)反應(yīng)條件，使其呈現(xiàn)出特征振蕩波形，這種振蕩波形是振蕩體系中所有物質(zhì)共同相互作用的結(jié)果。若固定振蕩體系中各化學(xué)物質(zhì)的濃度，而只改變底物的種類和濃度，則獲得的振蕩波形就是該中藥的特征波形[11-14]。典型的振蕩反應(yīng)曲線如圖1 所示，可分為3 個部分：誘導(dǎo)曲線、振蕩曲線、停振曲線。

圖1 電化學(xué)指紋圖譜及其特征參數(shù)Fig.1 The electrochemical fingerprint and its characteristic parameters

選取5 個典型的參數(shù)對指紋圖譜進(jìn)行評價。1）誘導(dǎo)時間t0，從加入溴酸鉀開始到振蕩開始的時間。2）振蕩周期tp，完成一次振蕩循環(huán)所需要的時間，振蕩壽命除以峰數(shù)。3）振蕩壽命td，從振蕩開始到振蕩結(jié)束的時間。4）最高電位Emax，誘導(dǎo)曲線的電位最高值。5）停振電位Emin，體系振蕩剛好停止時所對應(yīng)的電位。利用這些特征參數(shù)可以用來定性定量鑒別和評價中藥。

1.4 方法重現(xiàn)性及特異性

對同一種燕窩樣品進(jìn)行3 次平行測定，繪制指紋圖譜考察方法的重現(xiàn)性。測定不同種類燕窩及其偽品材料，繪制指紋圖譜考察測量方法的特異性。

1.5 數(shù)據(jù)處理

計算指紋圖譜各特征參數(shù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差來評價同一種類燕窩電化學(xué)指紋圖譜的重現(xiàn)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 振蕩反應(yīng)測定條件的優(yōu)化

2.1.1 振蕩反應(yīng)溫度的確定

燕窩添加量為0.112 0 g，在攪拌速度為500 r/min的條件下，測定不同溫度下燕窩水解液的B-Z 電化學(xué)振蕩指紋圖譜，圖譜見圖2，相應(yīng)特征參數(shù)見表1。

由圖2 可知，33 ℃～38 ℃條件下均可得到穩(wěn)定的電化學(xué)指紋圖譜。溫度對誘導(dǎo)時間、最高電位及停振電位影響不大，而對振蕩周期、振蕩壽命影響較大。誘導(dǎo)時間變化不大，可能是由于對燕窩進(jìn)行了水解處理，燕窩活性成分的浸出、擴(kuò)散相對容易，故振蕩反應(yīng)誘導(dǎo)期短。

圖2 溫度對燕窩振蕩圖譜形態(tài)的影響Fig.2 Effect of temperature on the oscillation pattern of bird's nest

表1 溫度對燕窩振蕩圖譜特征參數(shù)的影響Table 1 Effect of temperature on characteristic parameters of bird's nest oscillation map

由表1 可知，隨溫度的升高，燕窩指紋圖譜振蕩周期、振蕩壽命都明顯減小，這是由于溫度升高則振蕩化學(xué)反應(yīng)活化能降低，反應(yīng)的速率加快，使振蕩周期和振蕩壽命都明顯縮小。我們確定最佳溫度為35 ℃。

2.1.2 攪拌速度的確定

攪拌速度會影響活性成分參與振蕩反應(yīng)的進(jìn)程。在 500、800、1 100、1 400 r/min 不同攪拌速度下，測定黃燕水解液的B-Z 電化學(xué)振蕩指紋圖譜，對指紋圖譜特征參數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果見圖3。

圖3 攪拌速度對燕窩振蕩圖譜特征參數(shù)的影響Fig.3 Effect of stirring speed on characteristic parameters of bird's nest oscillation pattern

由圖3 可知，攪拌速度對誘導(dǎo)時間（縮短30 s）、振蕩周期、振蕩壽命等參數(shù)沒有實質(zhì)性影響，只要能為振蕩反應(yīng)提供物質(zhì)擴(kuò)散條件即可。此外，攪拌速度過高易帶帶入空氣到反應(yīng)溶液中，指紋圖譜出現(xiàn)雜峰，甚至得不到穩(wěn)定指紋圖譜。

2.1.3 燕窩添加量的確定

Marcone M F[4]研究表明白燕窩和血燕窩中含有分子量為 20×103～90×103的 5 種糖蛋白。燕窩中還含有絲氨酸、蘇氨酸、天門冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和纈氨酸等，其中白燕窩苯丙氨酸和酪氨酸含量較大[5]。燕窩添加量的不同，則水解液所含不同化學(xué)的物質(zhì)對振蕩體系中氧化還原反應(yīng)的促進(jìn)及抑制作用也會有所差異。

稱取一定量黃燕，加入5.00 mL 硫酸中得到燕窩水解液，全部轉(zhuǎn)移至35.00 mL 振蕩反應(yīng)溶液中，測定不同燕窩添加量條件下的電化學(xué)振蕩指紋圖譜，并比較分析圖譜特征參數(shù)，結(jié)果見表2。

表2 燕窩濃度對燕窩振蕩圖譜特征參數(shù)的影響Table 2 Effect of bird's nest Concentration on the characteristic parameters of bird's nest oscillation map

由表2 可知，在試驗條件范圍內(nèi)，電化學(xué)指紋圖譜誘導(dǎo)時間變化極小。振蕩周期和振蕩壽命變化較大，均隨著燕窩添加量的增加而減小，這是因為燕窩添加量越大，活性組分濃度增加導(dǎo)致在誘導(dǎo)期和振蕩期的振蕩反應(yīng)速率增加，振蕩周期和振蕩壽命自然減小。然而，底物濃度過大則易使振蕩周期太小，不易觀察，因此我們選擇較佳燕窩添加量為0.112 0 g。

2.1.4 燕窩水解時間的確定

燕窩質(zhì)地堅硬，其中各活性成分的釋放比普通中草藥困難，按前述方法對燕窩進(jìn)行預(yù)處理，處理時間分別為4、8、12、16 h，考察水解反應(yīng)時間對振蕩指紋圖譜特征參數(shù)的影響，結(jié)果見表4。

表4 燕窩原料在不同水解時間下的振蕩圖譜信息比較Table 4 Comparisons of oscillating map Information of bird's nest raw materials under different hydrolysis time

由表4 可知，燕窩水解時間對電化學(xué)指紋圖譜誘導(dǎo)時間、振蕩周期和壽命有一定的影響，對最高電位和停振電位幾乎無影響，考慮試驗時間，我們確定較優(yōu)水解時間為8 h。

2.2 不同種類燕窩及其偽品指紋圖譜

燕窩偽品用原材料有海藻酸鈉、魚膠粉、瓊脂、銀耳等。因此，我們選擇黃燕、白燕、血燕、魚膠和海藻酸鈉進(jìn)行電化學(xué)指紋圖譜測試和分析，結(jié)果見圖4。

圖4 不同種類燕窩及偽品指紋圖譜Fig.4 Fingerprint of different bird's nests and counterfeits

由圖4 可知，不同品種的燕窩及偽品材料表現(xiàn)各不相同，海藻酸鈉未出現(xiàn)振蕩圖譜，魚膠雖出現(xiàn)振蕩圖譜，但誘導(dǎo)時間明顯變長，峰形與燕窩也有較大差別。黃燕、白燕、血燕的指紋圖譜誘導(dǎo)時間基本一致，但圖譜峰形、振蕩周期、振蕩壽命有明顯差異，結(jié)果見表5。

表5 不同種類燕窩及其偽品的振蕩圖譜特征參數(shù)Table 5 Characteristic parameters of oscillation maps of different bird's nests and counterfeits

由表5 可知，不同種類的燕窩因化學(xué)組成不同，指紋圖譜的振蕩周期和振蕩壽命有所不同，而誘導(dǎo)時間、最高電位、停振電位相差無幾。

2.3 燕窩電化學(xué)指紋圖譜的重現(xiàn)性

在溫度為35 ℃、轉(zhuǎn)速為500 r/min 的條件下，以黃燕水解液為底物，測定3 次以考察方法的重現(xiàn)性，結(jié)果見表6。

表6 燕窩電化學(xué)指紋圖譜的穩(wěn)定性Table 6 Stability of electrochemical fingerprint of bird's nest

由表6 可知，在相同試驗條件下，電化學(xué)指紋圖譜中5 個參數(shù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5.00%，電化學(xué)指紋圖譜具有良好的重現(xiàn)性。這是由于同一種燕窩，其化學(xué)成分及含量相同，振蕩反應(yīng)過程類似，相應(yīng)指紋圖譜的一致性好。

3 結(jié)論

1）將燕窩簡單水解后置于BrO3--Ce2+-H+-丙二酸體系中進(jìn)行B-Z 振蕩反應(yīng)，在溫度為35 ℃、攪拌速度為500 r/min 的條件下，可獲取相應(yīng)燕窩品種的指紋圖譜及相關(guān)特征參數(shù)，是一種準(zhǔn)確、簡便、低成本的鑒別方法。

2）每一種燕窩及常見偽品材料的電化學(xué)指紋圖譜各不相同，圖譜具有指紋特征、重現(xiàn)性好。峰形、誘導(dǎo)時間、振蕩周期、振蕩壽命、最高電位、停振電位等圖譜特征參數(shù)可作為燕窩及其偽品鑒別的依據(jù)。