周印，劉夢陽，趙婧琦，王艷萍

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

食品行業(yè)正在向方便食品及健康食品兩個方面發(fā)展。由于益生菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生細菌素、胞外多糖、多酚類物質(zhì)、酶等多種功效成分，使得發(fā)酵果蔬制品具有改善營養(yǎng)健康、調(diào)節(jié)胃腸道功能、提高免疫能力、抑制有害菌和抗氧化等作用[1-2]；而且經(jīng)發(fā)酵的果蔬產(chǎn)品酸度增加、香氣十足而賦予發(fā)酵產(chǎn)品一些特有的風(fēng)味[3-4]，因此果蔬發(fā)酵制品是目前的研究熱點，亦受到廣大消費者的青睞，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。

影響發(fā)酵果蔬制品的品質(zhì)與功效存在兩個關(guān)鍵因素：原料以及發(fā)酵菌株的選擇[5]。發(fā)掘功能性菌株和優(yōu)化發(fā)酵工藝是對研發(fā)發(fā)酵果蔬制品的重要措施[6]。梨果營養(yǎng)全面，具有多種對人體有益的功能[7]。采用多菌種的協(xié)同發(fā)酵是對梨果的充分開發(fā)。目前，大眾消費者越來越關(guān)注食物的營養(yǎng)價值、健康價值，安全天然、無添加的果蔬發(fā)酵制品成為了消費者的最佳選擇。因此，質(zhì)優(yōu)價廉的發(fā)酵果蔬制品的研發(fā)成為一大發(fā)展趨勢。并且能夠真正實現(xiàn)果蔬資源的全面利用，推動果蔬發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梨漿：寧波供享農(nóng)業(yè)科技有限公司。菌種：植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）299、德氏保加利亞乳桿菌亞種 717（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）、嗜熱鏈球菌 176（Streptococcus thermophilus）：保藏于天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院食品生物技術(shù)實驗室。

MRS 培養(yǎng)基、脫脂乳粉（食品級）：雀巢有限公司；海藻糖（分析純）：中國上海試劑二廠；谷氨酸鈉、檸檬酸（分析純）：天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；乳酸（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；草酸（分析純）：天津市化學(xué)試劑一廠；蘋果酸（分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.2 試驗儀器試劑

Multiskan GO 型酶標儀：美國 Thermo 公司；LRH-250 生化培養(yǎng)箱：天津市達北實驗儀器廠；L710A 型高效液相色譜儀：日本島津公司；YC-015 型噴霧干燥機：上海雅程儀器設(shè)備有限公司；DELTA-320pH 計：法國 METTLER－TOLEDO 公司。

1.3 植物乳桿菌發(fā)酵劑的制備

1.3.1 工藝流程

植物乳桿菌發(fā)酵劑的制備工藝流程見圖1。

1）菌種活化：在無菌條件下，從-80 ℃冰箱中取出已純化好的菌樣，活化兩代后使用。

2）液體擴大培養(yǎng)，收集菌體：活化好的菌種，按4 %接菌量逐級擴大培養(yǎng)，最終在1 L MRS 液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，37 ℃，厭氧培養(yǎng)24 h 后，在8 000 r/min，4 ℃離心20 min，棄上清收集菌體。

3）活菌計數(shù)：采用梯度稀釋平板計數(shù)法[8]。

1.3.2 冷凍干燥保護劑優(yōu)化

選取海藻糖、谷氨酸鈉、乳糖3 種物質(zhì)與脫脂乳混合制備保護劑，為確定3 種物質(zhì)的添加量，進行三因素三水平的正交試驗，根據(jù)表1 設(shè)計的因素水平表進行分組試驗，收集菌粉并測定活菌數(shù)。

圖1 植物乳桿菌發(fā)酵劑制備工藝流程圖Fig.1 Process flow chart of preparation of Lactobacillus plantarum starter

表1 保護劑正交試驗因素水平表Table 1 Levels and factors in orthogonal test of protectant

1.3.3 菌體與保護劑配比確定

在以上最優(yōu)條件下，菌泥與保護劑的混合比例分別按：3∶1、1∶1、1∶3、1∶5、1∶10（g/mL）的比例混合，進行冷凍干燥。收集菌粉并測定活菌數(shù)。

1.4 乳酸菌發(fā)酵梨漿工藝研究

1.4.1 理化指標測定

1）pH 值的測定：在 25 ℃條件下，參考 GB 5413.34-2010《食品安全國家標準乳和乳制品酸度的測定》，使用pH 計測定。

2）可溶性固形物的測定：利用手持式折光儀檢測。

3）總酸的測定：參考GB/T12456-2008《食品安全國家標準食品中總酸的測定》，采用NaOH 常規(guī)滴定法。

1.4.2 感官評定的方法

發(fā)酵梨漿感官評分標準見表2。

感官綜合評分為4 個指標之和，即感官評分（100分）=色澤評分（25 分）+香氣評分（25 分）+口感評分（25 分）+組織狀態(tài)評分（25 分），整個感官評價需 10 位評價員進行評價，統(tǒng)計評價結(jié)果，進行分析[9]。

1.4.3 發(fā)酵梨漿工藝單因素試驗

1.4.3.1 發(fā)酵菌種的確定

取適量梨漿，85 ℃滅菌15 min、冷卻，按表3 進行接種，發(fā)酵72 h 后測定產(chǎn)品pH 值和酸度，并進行感官評分[10]。

表2 感官評分標準Table 2 The standard of sensory evaluation

表3 發(fā)酵菌株和接種量Table 3 The strains of fermentation and inoculum concentration

1.4.3.2 菌種比例對發(fā)酵梨漿工藝的影響

分別按照植物乳桿菌299∶保加利亞乳桿菌717∶嗜熱鏈球菌 176 體積比為 6∶1∶1、4∶1∶1、2∶1∶1、1∶1∶1、2∶3∶3 的比例進行接種，接種量為 8%、發(fā)酵溫度為37 ℃、發(fā)酵72 h 后分別測定產(chǎn)品的pH 值和酸度，并對其進行感官評定。

1.4.3.3 接種量對發(fā)酵梨漿工藝的影響

按照植物乳桿菌299∶保加利亞乳桿菌717∶嗜熱鏈球菌 176 體積比為 4∶1∶1 的比例進行接種，接種量分別為2%、4%、6%、8%、10%，發(fā)酵溫度為37 ℃，發(fā)酵72 h 后分別測定產(chǎn)品的pH 值和酸度，并對其進行感官評定。

1.4.4 發(fā)酵梨漿工藝的正交試驗

根據(jù)前期的試驗結(jié)果，對菌種比例、發(fā)酵溫度、接種量和發(fā)酵時間4 個因素進行正交試驗，以感官評分作為評價標準。試驗因素水平如表4 所示。

表4 發(fā)酵工藝因素水平表Table 4 Factors and their levels used in experiments of fermenting

1.5 乳酸菌發(fā)酵梨漿前后有機酸含量變化

采用高效液相色譜法對發(fā)酵前后有機酸含量進行測定[11]。

2 結(jié)果與討論

2.1 冷凍干燥保護劑的優(yōu)化

冷凍干燥試驗設(shè)計及結(jié)果見表5。

表5 保護劑優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Design and results of the optimum of protectant

根據(jù)表1 的三因素三水平正交設(shè)計。得到結(jié)果如表5，R 值越大代表對結(jié)果影響越大。因此，這3 個因素中海藻糖對結(jié)果的影響較大，對植物乳桿菌菌粉的保護效果最佳。將3 個因素排序，保護效果依次為：海藻糖＞谷氨酸鈉＞乳糖。通過比較均值，得到每個因素的最佳添加水平，最佳保護劑組成為：谷氨酸鈉2%、海藻糖5%、乳糖5%、脫脂乳10%。

2.2 菌體與保護劑添加量比例的影響

將保護劑與菌泥分別按一定的比例混合，進行冷凍干燥，測定樣品活菌數(shù)，結(jié)果如表6 所示。

表6 保護劑與菌泥比例的影響Table 6 The influence of proportion of protectant and cell

由表6可知，保護劑與菌泥為 3∶1（mL/g）時，樣品的活菌數(shù)最高，為8.48×109cfu/g，當保護劑過少時，無法保護全部菌體，在干燥過程中菌體死亡，因此，樣品中活菌數(shù)減少。當保護劑過多時，菌體樣品不足，所以活菌數(shù)略有下降。

綜上可知，在制備植物乳桿菌發(fā)酵劑時，冷凍干燥條件優(yōu)化為：保護劑組成：谷氨酸鈉2%、海藻糖5%、乳糖 5%、脫脂乳 10%、保護劑菌泥為 3∶1（mL/g）時，得到最終發(fā)酵劑，其活性為8.48×109cfu/g。

2.3 發(fā)酵梨漿菌種比例的確定

按照表3 發(fā)酵梨漿，結(jié)果如表7 所示。

表7 不同發(fā)酵劑對產(chǎn)品品質(zhì)的影響Table 7 Influences of different strains of fermentation on quality of products

根據(jù)表7可知，a、b、c 3 組單一菌株發(fā)酵的產(chǎn)品在感官得分方面較低，而d、e、f、g 4 組混合菌株發(fā)酵產(chǎn)品在感官得分方面較高，因此采用復(fù)合菌株的發(fā)酵。在復(fù)合菌株發(fā)酵的產(chǎn)品中，產(chǎn)品的pH 值以及酸度之間無顯著差異，根據(jù)感官評分，其中g(shù) 組得分最高，即植物乳桿菌299∶保加利亞乳桿菌717∶嗜熱鏈球菌 176 體積比為1∶1∶1。這3 株菌的產(chǎn)酸能力都比較強，同時菌株717 還具有產(chǎn)香的功能，菌株176 則具有加快其產(chǎn)酸速度的能力[12]。復(fù)合菌株的使用，能夠使發(fā)酵梨漿具有特有的香氣及口感。因此，經(jīng)過綜合考慮，最終確定發(fā)酵梨漿飲料所用菌種為植物乳桿菌299、菌株 717、菌株 176，3 種菌復(fù)配的組合。

2.4 發(fā)酵梨漿菌種比例的確定

每株乳酸菌的發(fā)酵特性不同，對產(chǎn)品風(fēng)味影響不同，因此，確定復(fù)合發(fā)酵中菌株的比例，能夠有助于產(chǎn)品口感的改善。菌株體積比例按照植物乳桿菌299∶保加利亞乳桿菌717∶嗜熱鏈球菌176 進行設(shè)計，對梨漿進行發(fā)酵。分別測定發(fā)酵72 h 后梨漿的pH 值和酸度，并對其進行感官評分，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 菌種比例對發(fā)酵梨漿工藝的影響Fig.2 Effect of strain proportion on fermented pear juice process

由圖2 可知，當植物乳桿菌所占的比例減少時，發(fā)酵梨漿pH 值升高，酸度降低，這是由植物乳桿菌生長速度快且產(chǎn)酸能力強的特點產(chǎn)生的結(jié)果[13]。保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌菌在發(fā)酵過程中，主要是起到增香的作用。綜合以上指標考量，最終確定發(fā)酵梨漿菌種體積比例為植物乳桿菌299∶保加利亞乳桿菌717∶嗜熱鏈球菌 176=4∶1∶1。

2.5 發(fā)酵梨漿接種量的確定

適當?shù)陌l(fā)酵菌株接種量有助于乳酸菌充分利用底物，對梨漿進行發(fā)酵。采取5 個不同的接種量對梨漿進行發(fā)酵，進行發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)檢測并對發(fā)酵后的梨漿進行感官評分，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 接種量對發(fā)酵梨漿工藝的影響Fig.3 Effect of inoculation amount on fermented pear juice process

由圖可知，在相同的時間中，接種量越大，發(fā)酵產(chǎn)物pH 值越小，酸度越高。當接種量過低時，產(chǎn)品風(fēng)味不足，口感不佳，感官評分低。當添加量為10%時，感官評分低于添加量為8%的感官評分，這是由于添加量過多，乳酸菌競爭底物發(fā)酵激烈，導(dǎo)致產(chǎn)品原有果香缺失，同時也會增加產(chǎn)品的成本。經(jīng)過綜合考量，選取8%的接種量發(fā)酵梨漿。

2.6 發(fā)酵梨漿正交試驗結(jié)果

根據(jù)前期單因素的試驗結(jié)果，進行正交優(yōu)化。對發(fā)酵梨漿的品質(zhì)有影響的發(fā)酵菌種比例、接種量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間4 個因素。利用SPSS 軟件進行L9（34）正交試驗設(shè)計。發(fā)酵結(jié)束后進行感官評分。試驗結(jié)果見表8、表9

表8 優(yōu)化梨漿發(fā)酵工藝正交試驗結(jié)果與分析Table 8 Orthogonal test results and analysis of optimized pear juice fermentation process

續(xù)表8 優(yōu)化梨漿發(fā)酵工藝正交試驗結(jié)果與分析Continue table 8 Orthogonal test results and analysis of optimized pear juice fermentation process

表9 發(fā)酵梨漿正交試驗結(jié)果方差分析Table 9 Analysis of variance of orthogonal test results of fermented pear juice

由表8 可知，在影響發(fā)酵梨漿品質(zhì)的4 種因素中，發(fā)酵溫度為最主要因素，接下來依次為：菌種比例，接種量及發(fā)酵時間。在每個因素中均為2 水平較好，即植物乳桿菌299∶保加利亞乳桿菌717∶嗜熱鏈球菌176=4∶1∶1（體積比），發(fā)酵溫度 37 ℃，接種量 8%，發(fā)酵時間 84 h。由表9可知，A'、B'、C'3 個因素各水平之間差異顯著，而D'因素3 水平之間差異不顯著?？紤]在減少發(fā)酵時間及成本的同時，感官評價差異較小。因此，選擇發(fā)酵時間為72 h。最終確定發(fā)酵工藝最佳組合為：A'2B'2C'2D'1。經(jīng)驗證，在最佳工藝組合的條件下，發(fā)酵梨漿的感官評分為93 分，高于A'2B'2C'2D'2組合。因此，發(fā)酵梨漿最佳工藝為：植物乳桿菌299∶保加利亞乳桿菌717∶嗜熱鏈球菌 176=4∶1∶1（體積比），發(fā)酵溫度 37 ℃，接種量8%，發(fā)酵時間72 h。

2.7 發(fā)酵前后梨漿中有機酸含量變化

有機酸的種類及含量與果蔬風(fēng)味有著密切聯(lián)系。在水果中，含量較為豐富的只有一兩種有機酸，其余有機酸為少量存在[14]。梨果品種不同有機酸組成及含量差異也較大[15-16]。經(jīng)微生物發(fā)酵，梨漿中有機酸發(fā)生改變，結(jié)果如表10 所示。

表10 有機酸分析結(jié)果Table 10 Organic acids contents of sample

由表可知，在發(fā)酵前，梨漿的酸味主要是由蘋果酸和檸檬酸共同作用產(chǎn)生的，而在發(fā)酵后，呈酸物質(zhì)發(fā)生改變。在發(fā)酵前，梨漿中蘋果酸，檸檬酸含量豐富，在3 種復(fù)合乳酸菌的發(fā)酵下，梨漿中有機酸含量發(fā)生變化。草酸、蘋果酸及檸檬酸含量下降，其中蘋果酸含量下降最多，由36.49 mg/100 g 下降至3.10 mg/100 g，草酸和檸檬酸基本不變。乳酸含量顯著增多，由1.65 mg/100 g上升為116.27 mg/100 g。出現(xiàn)這樣的這樣結(jié)果的原因有：1）乳酸菌利用梨漿中的糖類進行發(fā)酵，產(chǎn)生乳酸，使得發(fā)酵后乳酸含量上升。2）蘋果酸-乳酸（MLF）生化反應(yīng)，使得蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸[17-18]。3）伴隨MLF 過程，檸檬酸也能被乳酸菌分解，產(chǎn)生具有香氣的物質(zhì)[19-20]。

3 結(jié)論

本研究對實驗室自主分離的植物乳桿菌發(fā)酵劑的制備工藝進行了優(yōu)化，并復(fù)配保加利亞乳桿菌717和嗜熱鏈球菌176 對梨漿進行發(fā)酵，并優(yōu)化工藝，得到一款發(fā)酵梨漿飲料。

植物乳桿菌發(fā)酵劑制備工藝中保護劑配比為：谷氨酸鈉2%、海藻糖5%、乳糖5%，脫脂乳10%，保護劑添加量與菌泥為3∶1（mL/g），在上述條件下，得到菌粉發(fā)酵劑菌活為8.48×109cfu/g。最優(yōu)發(fā)酵梨漿工藝為：植物乳桿菌299∶保加利亞乳桿菌717∶嗜熱鏈球菌176=4∶1∶1（體積比），接種量為8%，發(fā)酵溫度為 37 ℃，發(fā)酵時間72 h。此條件下梨漿得到充分發(fā)酵，口感突出，風(fēng)味酸甜。發(fā)酵前后有機酸含量發(fā)生變化，發(fā)酵前梨漿中含量較為豐富的有機酸為：檸檬酸、蘋果酸、乳酸、草酸。其中蘋果酸、檸檬酸有優(yōu)勢有機酸，含量分別為：36.49、38.59 mg/100 g。經(jīng) 3 種復(fù)合乳酸菌發(fā)酵后，梨漿中有機酸含量發(fā)生變化，有機酸含量依次為：乳酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸。其中乳酸含量由1.65 mg/100 g 升高為 116.27 mg/100 g。