龔乃超，呂凱波

（武漢工商學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430065）

湖北海棠[學(xué)名：Malus hupehensis（Pamp.）Rehder]是薔薇科蘋果屬植物，喬木，生長(zhǎng)于海拔50 m～2 900 m的山坡或山谷叢林中，資源豐富。海棠葉含有多種生物活性物質(zhì)，如黃酮類、多酚類、多糖類、蛋白質(zhì)和多種人體必需的微量元素，且不含咖啡因，具有抗氧化[1]、降血糖[2]、降血脂[3]、雌激素樣作用[4]、保肝護(hù)肝[5]、抗菌消炎[6]，主要功能成分為以根皮苷為主的黃酮類化合物[7]。

根據(jù)《中華草本》及《新華本草綱目》的記載，海棠嫩葉作為茶葉飲用歷史悠久，俗名花紅茶或三皮罐，是湖北西部地區(qū)夏季廣為飲用的涼茶飲料，不僅深受當(dāng)?shù)厝讼矏?，還行銷全國，每年產(chǎn)銷百余噸，市場(chǎng)巨大，但是海棠葉加工工藝簡(jiǎn)單，海棠葉茶產(chǎn)品少，定位低，為了提高海棠葉的附加值，海棠葉茶飲料值得深入研究。

發(fā)酵飲料能改進(jìn)食物的保鮮程度、營養(yǎng)屬性（血糖指數(shù)下降、氨基酸含量增加、改善礦物質(zhì)的生物利用度等），改善產(chǎn)品感官屬性（風(fēng)味、色澤等），增加營養(yǎng)保健作用（發(fā)酵代謝可生成新物質(zhì)，以增加營養(yǎng)保健功效）。隨著飲料行業(yè)的發(fā)展，發(fā)酵飲料也得到高速發(fā)展，由于現(xiàn)代人對(duì)營養(yǎng)價(jià)值比較看重，人們更青睞帶有保健功能的飲料，積極開展發(fā)酵茶飲料的研究，不但可以充分利用酵母發(fā)酵飲料的優(yōu)點(diǎn)，也可以發(fā)揮出各種茶的不同價(jià)值的特點(diǎn)，還有各種營養(yǎng)保健功能，茶發(fā)酵飲料有很大的發(fā)展前景和巨大經(jīng)濟(jì)市場(chǎng)[8-10]。

本文以海棠葉為主要原料，發(fā)酵制成低酒精度的海棠葉發(fā)酵液，設(shè)計(jì)飲料的配方，再感官調(diào)配，制成海棠葉發(fā)酵型飲料，并測(cè)定其抗氧化活性物質(zhì)組成，穩(wěn)定性及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

湖北海棠葉：湖北荊門；安琪酵母菌：安琪酵母股份有限公司；白砂糖：市售；磷酸氫二鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、酒石酸鉀鈉、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、苯酚（分析純）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；沒食子酸（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；硫酸亞鐵（分析純）：天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-100B-D 振蕩培養(yǎng)箱：海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-2D 型超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；SK-1 快速混勻器：金壇市杰瑞爾電器有限公司；722E 型可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 海棠葉成分分析

1）灰分含量測(cè)定：熾灼法[11]。

2）水分含量測(cè)定：干燥法。

3）總黃酮含量測(cè)定：亞硝酸鈉-硝酸鋁法[12]。

4）多酚含量測(cè)定：酒石酸亞鐵法[12]。

5）總糖含量測(cè)定：蒽酮法[12]。

1.3.2 海棠葉發(fā)酵液制備

選擇新鮮海棠葉，用蒸餾水泡30 min 后洗凈，干燥備用。將凈葉粉碎過20 目篩，取1.5 g 海棠葉粉末用95℃～100℃熱水燙2min 后迅速冷卻至25 ℃，加入10 g白砂糖，加水 100 mL，與（90±5）℃水浴 30 min 來提取海棠葉中活性成分，提取后加水至100 mL，巴氏滅菌后接種0.1 g 酵母，于32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵48 h，發(fā)酵結(jié)束過濾得海棠葉發(fā)酵液[13]。

1.3.3 海棠葉發(fā)酵工藝優(yōu)化

通過發(fā)酵條件單因素試驗(yàn)，以感官評(píng)價(jià)為指標(biāo)，分別考察不同的發(fā)酵時(shí)間（24、48、72、96、120 h）、料液比[0.5∶100、1∶100、1.5∶100、2∶100、2.5∶100（g/mL）]、白砂糖添加量（6%、8%、10%、12%、14%）和酵母添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）對(duì)海棠葉發(fā)酵液感官的影響。

以發(fā)酵時(shí)間、料液比、白砂糖添加量和酵母添加量為考察因素，感官評(píng)價(jià)為指標(biāo)，設(shè)計(jì)四因素三水平的正交表，如表1 所示。進(jìn)行正交試驗(yàn)，得出最佳海棠葉最佳發(fā)酵工藝。

表1 海棠葉發(fā)酵工藝正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment of crabapple leaf fermentation process

1.3.4 海棠葉飲料配方研究

根據(jù)1.3.3 的試驗(yàn)結(jié)果，采用最佳發(fā)酵工藝制備發(fā)酵液，進(jìn)行飲料配方研究。通過飲料配方單因素試驗(yàn)，以感官評(píng)價(jià)為指標(biāo)，分別考察不同的糖添加量（2 %、3%、4%、5%、6%）、檸檬酸添加量（0.01%、0.02%、0.03 %、0.04 %、0.05 %）、β-環(huán)糊精添加量（0.02 %、0.04%、0.06%、0.8%、0.10%）對(duì)海棠葉發(fā)酵飲料感官的影響，調(diào)配好的海棠葉發(fā)酵飲料于4 ℃冷藏2 d 再進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

以白砂糖添加量、檸檬酸添加量和β-環(huán)糊精添加量為考察因素，感官評(píng)價(jià)為指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素三水平的正交試驗(yàn)，如表2 所示。得出最佳調(diào)配配方。

表2 海棠葉發(fā)酵飲料配方正交試驗(yàn)水平因素表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment of crabapple leaf fermented beverage formula

1.3.5 感官評(píng)價(jià)

根據(jù)海棠葉發(fā)酵液和飲料的色澤、氣味、口感和穩(wěn)定性等方面的，設(shè)計(jì)感官評(píng)價(jià)表，用來對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行評(píng)分，見表3。參與評(píng)價(jià)人員100 名，男女各半取其平均值作為最終結(jié)果。

表3 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Sensory evaluation criterion

續(xù)表3 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Continue table 3 Sensory evaluation criterion

2 結(jié)果與分析

2.1 海棠葉組成

按1.3.1 的方法測(cè)定海棠葉中灰分，水分，總黃酮，多酚和總糖含量，結(jié)果見表4。

表4 海棠葉成分分析Table 4 Composition analysis of crabapple leaf

2.2 海棠葉發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.2.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)海棠葉發(fā)酵液感官的影響

按1.3.3 的方法，得到發(fā)酵時(shí)間對(duì)海棠葉發(fā)酵液感官的影響結(jié)果，如圖1 所示。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液感官的影響Fig.1 Effects of fermentation time on sensory evaluation of fermentation broth

由圖1 可知，在發(fā)酵時(shí)間超過48 h 以后，感官變差，因?yàn)榘l(fā)酵會(huì)產(chǎn)生酒精和澀味，發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng)，酒味和澀味更重，對(duì)飲料感官影響較大，故發(fā)酵時(shí)間24 h～48 h 發(fā)酵液感官較好。

2.2.2 料液比對(duì)海棠葉發(fā)酵液感官的影響

按1.3.3 的方法，得到料液比對(duì)海棠葉發(fā)酵液感官的影響結(jié)果，如圖2 所示。

圖2 料液比對(duì)發(fā)酵液感官的影響Fig.2 Effects of material-liquid ratio on sensory evaluation of fermentation broth

由圖2 可知，海棠葉過少，缺少獨(dú)有的海棠葉香味，海棠葉過多，澀味較重，口感變差，故料液比在1∶100（g/mL）～2∶100（g/mL）之間發(fā)酵液感官較好。

2.2.3 白砂糖添加量對(duì)海棠葉發(fā)酵工藝的影響

按1.3.3 的方法，得到糖添加量對(duì)海棠葉發(fā)酵液感官的影響結(jié)果，如圖3 所示。

圖3 糖添加量對(duì)發(fā)酵液感官的影響Fig.3 Effects of added sugar on sensory evaluation of fermentation broth

由圖3 可知，由于大眾對(duì)甜飲料的喜愛，提高糖添加量，發(fā)酵液感官評(píng)分相應(yīng)提高，糖添加量大于12%之后，發(fā)酵液甜味過重，且酒精含量會(huì)提高，故最佳糖添加量為10%～14%。

2.2.4 酵母添加量對(duì)海棠葉發(fā)酵工藝的影響

按1.3.3 的方法，得到酵母添加量對(duì)海棠葉發(fā)酵液感官的影響結(jié)果，如圖4 所示。

由圖4 可知，酵母添加量大于0.15%之后，發(fā)酵液苦澀味，并有異味，故最佳酵母添加量為0.05%～0.15%。

2.2.5 海棠葉發(fā)酵工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表5 和表6。

由表5 和表6 可知，正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果和方差分析結(jié)果一致，影響因素主次為A＞B＞C＞D，但各因素影響并不顯著，即因素主次依次為發(fā)酵時(shí)間、料液比、糖添加量、酵母添加量，k 值最優(yōu)為A2B2C3D2，即發(fā)酵時(shí)間 48 h，料液比 1.5∶100（g/mL），糖添加量 11%，酵母添加量0.15%。

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，以k 值最優(yōu)條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，其結(jié)果高于試驗(yàn)最優(yōu)，與正交試驗(yàn)結(jié)果一致。

圖4 酵母添加量對(duì)發(fā)酵液感官的影響Fig.4 Effects of yeast addition on sensory evaluation of fermentation broth

表5 發(fā)酵工藝正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Orthogonal experimental results of fermentation process

表6 正交試驗(yàn)方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal experiment

2.3 海棠葉飲料配方研究結(jié)果

2.3.1 糖添加量對(duì)海棠葉飲料感官的影響

按1.3.4 的方法，得到糖添加量對(duì)海棠葉飲料感官的影響結(jié)果，如圖5 所示。

圖5 糖添加量對(duì)飲料感官的影響Fig.5 Effects of added sugar on sensory evaluation of fermented beverage

由圖5 可知，發(fā)酵后發(fā)酵液糖含量下降，適當(dāng)添加糖可減輕酒味和澀味。當(dāng)糖添加量在3 %～5 %之間，感官評(píng)分較高，繼續(xù)增加糖度則過于甜膩，感官評(píng)分下降。

2.3.2 檸檬酸添加量對(duì)海棠葉飲料感官的影響

按1.3.4 的方法，得到檸檬酸添加量對(duì)海棠葉飲料感官的影響結(jié)果，如圖6 所示。

圖6 檸檬酸添加量對(duì)飲料感官的影響Fig.6 Effects of citric acid addition on sensory evaluation of fermented beverage

檸檬酸可帶入酸味，由圖6 可知，適度的酸味可提升飲料的口感，但若酸味過重則讓人難以接受，也不符合茶飲料的口味，故檸檬酸添加量為0.01%～0.03%為宜。

2.3.3 β-環(huán)糊精添加量對(duì)感官的影響

按1.3.4 的方法，得到β-環(huán)糊精添加量對(duì)海棠葉飲料感官的影響結(jié)果，如圖7 所示。

β-環(huán)糊精用于去除飲料中的苦澀味和提高飲料穩(wěn)定性，β-環(huán)糊精添加過多，飲料顏色泛白，不符合茶水的色澤，感官評(píng)分降低。而β-環(huán)糊精添加過少，則會(huì)影響飲料的穩(wěn)定性，故最佳β-環(huán)糊精添加量為0.02%～0.06%。

2.3.4 海棠葉飲料配方正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表7 和表8。

圖7 β-環(huán)糊精添加量對(duì)飲料感官的影響Fig.7 Effect of β-cyclodextrin addition on sensory evaluation of fermented beverage

表7 飲料配方正交分析結(jié)果Table 7 Orthogonal analysis results of fermented beverage formula

表8 正交試驗(yàn)方差分析Table 8 Variance analysis of orthogonal experiment

由表7 和表8 可知，正交試驗(yàn)極差分析和方差分析結(jié)果一致，但各因素影響不顯著，結(jié)果表明影響因素主次為 C'＞A'＞B'，即影響因素主次依次為 β-環(huán)糊精添加量、糖添加量、檸檬酸，最佳飲料配方為A2B3C1與試驗(yàn)最優(yōu)一致，即白砂糖4%，檸檬酸0.03%，β-環(huán)糊精0.02%。

2.4 海棠葉飲料原料成本

飲料原料成本見表9。

表9 飲料原料成本Table 9 Raw material cost of fermented beverage

一瓶容量500 mL 的海棠葉飲料原料成本約為0.97 元，成本低廉。

3 結(jié)果與討論

經(jīng)試驗(yàn)得出海棠葉發(fā)酵的最適工藝為發(fā)酵時(shí)間48 h，料液比 1.5∶100（g/mL），糖添加量 11%，酵母添加量0.15%；海棠葉飲料的最佳配方為白砂糖4%，檸檬酸0.03%，β-環(huán)糊精0.02%，上述最佳條件發(fā)酵的飲料感官最佳。

本試驗(yàn)的發(fā)酵工藝較為簡(jiǎn)單，很大程度上保留了海棠葉中的有效成分，飲料可口，酸甜適宜，營養(yǎng)價(jià)值高，酒精風(fēng)味，適合大眾飲用，感官評(píng)價(jià)高。海棠葉容易獲取，價(jià)格低廉，是屬于平民化的一種茶飲料，還具有保健作用。市場(chǎng)對(duì)保健飲料接受度較高，目前尚無海棠葉有關(guān)保健飲料，且該產(chǎn)品為酒精風(fēng)味茶飲料，不同于傳統(tǒng)茶飲料，適合年輕人飲用。本文研究能提高海棠葉的附加值，每瓶500 mL 飲料原料成本不到1元，成本低廉，營養(yǎng)價(jià)值高，發(fā)酵海棠葉飲料有廣闊前景的。