夏 晴，李 藝，李 薇，胡惠靜，陳 云，阮競(jìng)雄

依前列醇，又名前列腺素I2(prostaglandin I2, PGI2)，為血管內(nèi)產(chǎn)生的一種天然前列腺素，是強(qiáng)效的血管擴(kuò)張藥及抗血小板聚集藥[1,2]。其抗血小板聚集的作用機(jī)制可能為本藥激活腺苷酸環(huán)化酶，而使血小板內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, AMP)濃度上升所致。臨床上用于治療不穩(wěn)定型心絞痛、心肌梗死、頑固性心力衰竭、外周血管痙攣性疾病及肺動(dòng)脈高壓[3,4]。前列地爾，又稱前列腺素E1(prostaglandin E1, PGE1)，可增加血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)的cAMP含量，發(fā)揮其擴(kuò)血管作用，具有恢復(fù)紅細(xì)胞變形能力、增加動(dòng)脈血流量、促進(jìn)側(cè)支循環(huán)、降低外周阻力、降低血液黏度的作用，同時(shí)可抑制血小板聚集[5，6]。臨床上以脂微球?yàn)樗幬镙d體的靜脈注射用前列地爾制劑，主要用于治療慢性動(dòng)脈閉塞癥(血栓閉塞性脈管炎、閉塞性動(dòng)脈硬化癥)引起的四肢潰瘍及微小血管循環(huán)障礙引起的四肢靜脈息痛，起到很好地?cái)U(kuò)血管抑制血小板聚集作用[7]，廣泛用于腦梗死[8]、糖尿病并發(fā)癥、耳鳴及慢性肝炎[9]，還可用于高血壓視網(wǎng)膜病變[10]。目前，研發(fā)拮抗ADP誘導(dǎo)血小板聚集的藥物已成為熱點(diǎn)問題，并取得了一定的研究成果[11]。本研究旨在探討依前列醇鈉、前列地爾對(duì)血小板聚集的影響程度及作用強(qiáng)弱，以便為其臨床應(yīng)用提供藥理理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 儀器 Sysmes XS-800i 全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(日本希森美康公司)； Helena Aggram 四通道血小板聚集儀(美國(guó)海倫娜公司)；Sartorius BS224S天平(德國(guó)賽多利斯公司)；高速冷凍離心機(jī)Sigma 3-30K(德國(guó)Sigma離心機(jī)股份有限公司)。

1.1.2 材料 SD雄性大鼠250～300 g，20只(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供)；依前列醇鈉(Caymanpharma s.r.o.，批號(hào)1605V011)；前列地爾(吉林英聯(lián)生物制藥股份有限公司，批號(hào)20150401)；甘氨酸(天藥藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)AGLY140707)；磷酸氫二鈉(湖南九典制藥，批號(hào)201601105)；磷酸二氫鈉(成都華邑藥業(yè)輔料，批號(hào)20120402)；3.2%枸櫞酸鈉抗凝管(w/v，西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供)；氫氧化鈉(天津市天力化學(xué)，批號(hào)20160708)；實(shí)驗(yàn)用水為純化水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 血小板混懸液的制備 SD雄性大鼠且最近2周內(nèi)未服用過影響血小板功能的藥物，10%水合氯醛麻醉后，腹腔靜脈取血置于加有3.2%枸櫞酸鈉的抗凝管中，800 r/min下離心10 min，吸取上層的富血小板血漿(PRP)，4000 r/min下離心10 min，吸取上層的貧血小板血漿(PPP)。用PPP稀釋PRP最終血小板數(shù)為400×109個(gè)/L，作為最終血小板混懸液待用。血小板聚集實(shí)驗(yàn)在采集血標(biāo)本后3 h內(nèi)進(jìn)行。

1.2.2 緩沖溶液配制 甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液(pH=10.4)：稱取1.5049 g甘氨酸、0.8018 g氫氧化鈉分別溶解在100 ml注射用水中，制得0.2 mol/L水溶液；量取25 ml上述甘氨酸水溶液加入19.3 ml上述氫氧化鈉水溶液混勻后，加入注射用水定容至100 ml得甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液。

磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.5)：稱取7.1640 g磷酸氫二鈉，2.7625 g磷酸二氫鈉分別溶解在100 ml注射用水中，制得0.2 mol/L水溶液；取84 ml上述磷酸氫二鈉水溶液加入16 ml上述磷酸二氫鈉水溶液混勻后即得。

1.2.3 藥液的配制 精密稱取5 mg依前列醇鈉置

于10 ml量瓶中，臨用時(shí)用甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液溶解定容，配制質(zhì)量濃度為500 μg/ml溶液待用；同理，精密稱取5 mg前列地爾置于10 ml量瓶中，用1.2.2項(xiàng)下配制的磷酸鹽緩沖液溶解定容，配制成質(zhì)量濃度為500 μg/ml溶液待用。然后分別用各自緩沖溶液稀釋至50、125、250、500和2500 ng/ml。

血小板聚集儀自帶ADP試劑，用1 ml蒸餾水復(fù)溶1瓶試劑，輕輕混合直至完全溶解至濃度為200 μM，復(fù)溶后試劑保存在2～6 ℃可穩(wěn)定1周，工作液應(yīng)在制備后3 h內(nèi)使用。使用時(shí)用蒸餾水稀釋至所需濃度。

1.2.4 最佳孵育時(shí)間的確定 血小板混懸液中分別加入依前列醇鈉500 ng/ml、前列地爾500 ng/ml，37 ℃下孵育不同時(shí)間(0、1、3、5、10、15 min)，在相同的ADP濃度(20 μM)誘導(dǎo)下測(cè)定5 min內(nèi)最大聚集率。

1.2.5 最佳ADP終濃度的確定 血小板混懸液中加入依前列醇鈉500 ng/ml、前列地爾500 ng/ml，37 ℃下孵育相同時(shí)間(由1.2.4確定)，在不同濃度的ADP誘導(dǎo)下(5、10、20、40 μM)測(cè)定5 min內(nèi)最大聚集率。

1.2.6 樣品處理 225 μl血小板混懸液中分別加入空白試劑(0，對(duì)照組)、50、125、250、500、2500 ng/ml的依前列醇鈉或前列地爾20 μl，37 ℃下孵育相同最佳時(shí)間后加入20 μl最佳濃度的ADP誘導(dǎo)，依次檢測(cè)各濃度5 min內(nèi)最大聚集率，計(jì)算血小板聚集抑制率，計(jì)算公式如下：

血小板聚集抑制率(%)=

2 結(jié) 果

2.1 不同孵育時(shí)間對(duì)血小板聚集的影響 隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集均呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢(shì)，直至5 min往后血小板聚集率變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異(P>0.05，表1)。

表1 大鼠兩種前列腺素(500 ng/ml)不同孵育時(shí)間的血小板聚集率

注：與前一時(shí)間點(diǎn)相比，①P<0.05

2.2 不同ADP終濃度對(duì)血小板聚集的影響 血小板混懸液中血小板數(shù)控制在400×109個(gè)/L，孵育最佳時(shí)間為5 min，加入20 μl不同濃度的ADP，隨著ADP濃度的增加血小板聚集率呈增加趨勢(shì)。20 μmol/L與10 μmol/L相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異(P<0.05)，與40 μmol/L相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表2 大鼠兩種前列腺素(500 ng/ml)不同ADP濃度的血小板聚集率

注：與5 μmol/L比較，①P<0.05；與10 μmol/L比較，②P<0.05

2.3 不同濃度的依前列醇鈉、前列地爾對(duì)血小板聚集的影響 依前列醇鈉和前列地爾隨著濃度的增加，血小板最大聚集率依次減小，與各自溶劑組相比均顯著降低。依前列醇鈉組血小板抑制率顯著高于前列地爾組，250 ng/ml的依前列醇鈉對(duì)血小板的抑制率已經(jīng)高達(dá)88.61%，而前列地爾僅有23.16%。2500 ng/ml的前列地爾血小板抑制率為65.09%，較250 ng/ml的依前列醇鈉血小板抑制率降低(表3)。

表3 大鼠不同濃度依前列醇鈉、前列地爾的血小板聚集率和抑制率

注：-表示無法計(jì)算；與無加藥組相比，①P<0.05；與前列地爾等同濃度相比，②P<0.05；與前列地爾等濃度相比，③P<0.05時(shí)t值和P值

3 討 論

血小板在不同患者、不同疾病和不同疾病階段中所起的作用不同，影響血小板聚集的因素很多，因此應(yīng)通過實(shí)驗(yàn)研究為開發(fā)新型的具有抗血小板作用的藥物是非常有必要的，而血小板聚集是血小板活化及其釋放反應(yīng)、膜糖蛋白受體等綜合因素的共同表現(xiàn)，其聚集率的檢測(cè)，已被廣泛應(yīng)用于血栓性疾病及出血的診斷、治療和療效評(píng)估[12]。

依前列醇鈉是花生四烯酸的代謝物，具有有效血管擴(kuò)張活性和血小板聚集抑制活性，是唯一一個(gè)進(jìn)入肺循環(huán)不被降解，可發(fā)揮全身作用的前列腺素類物質(zhì)[13]。前列地爾是前列腺素的一種，也具有擴(kuò)張血管和抑制血小板聚集的活性。本試驗(yàn)比較了兩者在體外抑制ADP誘導(dǎo)血小板聚集作用的強(qiáng)弱。

研究發(fā)現(xiàn)，依前列醇鈉很不穩(wěn)定，在人體血液環(huán)境中很快降解失活。依前列醇鈉在23 ℃、pH 7.2水溶液中半衰期僅為0.033 h，在堿性pH 8.9水溶液中半衰期為4.4 h、pH 9.3情況下半衰期可達(dá)到10.33 h，在pH 10.2～10.8依前列醇鈉最穩(wěn)定[14,15]，故本試驗(yàn)采用甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液(pH 10.4)作為依前列醇鈉溶劑。依據(jù)中國(guó)藥典有關(guān)前列地爾溶解性的記載，即前列地爾可溶解與pH 7.5磷酸鹽緩沖溶液中，故本實(shí)驗(yàn)采用磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖溶液(pH 7.5)作為前列地爾的溶劑。二磷酸腺苷 (ADP) 是第1個(gè)已知的低分子血小板弱聚集誘導(dǎo)劑，可誘導(dǎo)初級(jí)聚集和致密顆粒分泌[16]，通過作用于多種受體，增強(qiáng)自身及其他誘導(dǎo)劑對(duì)血小板的誘導(dǎo)作用并有助于血栓的穩(wěn)定[17]，本實(shí)驗(yàn)采用ADP作為血小板聚集誘導(dǎo)劑，在最佳孵育時(shí)間和最佳ADP濃度，依次分別加入不同濃度的依前列醇鈉和前列地爾測(cè)定5 min內(nèi)最大聚集率，并計(jì)算最大抑制率。

試驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠靜脈取血，制備得400×109個(gè)/L血小板混懸液，ADP最佳誘導(dǎo)濃度為20 μM，加入藥物最佳孵育時(shí)間5 min。依前列醇鈉50 ng/ml、前列地爾250 ng/ml以上濃度均可顯著抑制血小板聚集。依前列醇鈉具有較強(qiáng)的血小板聚集抑制率，500 ng/ml時(shí)最大抑制率可達(dá)93.90%。前列地爾也可抑制血小板聚集，但其作用強(qiáng)度遠(yuǎn)弱于依前列醇鈉，500 ng/ml時(shí)最大抑制率僅有28.10%，同等濃度下，依前列醇鈉抑制血小板聚集的作用要顯著強(qiáng)于前列地爾。這與體內(nèi)研究結(jié)果相吻合，即體內(nèi)研究表明依前列醇鈉是一種強(qiáng)有力的血小板抑制劑，其作用效果是前列地爾的20倍。

綜上所述，依前列醇鈉是一種作用強(qiáng)度遠(yuǎn)強(qiáng)于前列地爾的血小板聚集抑制劑，為依前列醇鈉用于治療血小板聚集引起的相關(guān)疾病奠定了理論基礎(chǔ)，也為治療血小板聚集相關(guān)疾病提供了一種更強(qiáng)有力的選擇。