術 超，管甲亮，李 喆，劉 禹，王學鋒，武文漫

（1.上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院檢驗科，上海 200025；2.青島大學附屬醫(yī)院急診內科，山東 青島 266071）

狼瘡抗凝物是一種能直接與磷脂或其復合物相結合的異質性免疫球蛋白，是抗磷脂抗體的一種，可見于多種自身免疫性疾病[1]。狼瘡抗凝物持續(xù)陽性的患者被認為有較高的血栓形成和復發(fā)風險。狼瘡抗凝物的實驗室檢測包括篩查試驗、混合試驗、確證試驗等，基于共同途徑原理的稀釋蝰蛇毒時間（diluted Russell viper venom time，dRVVT）法和基于內源途徑及共同途徑的活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）法是目前臨床實驗室最常采用的2 種檢測方法[2]。同時，美國臨床和實驗室標準化協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）指出，當篩查結果不明確時，混合試驗可以幫助鑒別診斷凝血因子缺陷及其抑制物的存在，可提高實驗診斷的準確率[2-3]。本研究擬探索確證試驗dRVVT 標準化比值與混合試驗檢測結果間的相關性及方法學特點。

資料與方法

一、資料

在2015 年9 月至2019 年9 月期間，收集在上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院連續(xù)就診的31 例凝血功能異常（APTT 篩選試驗結果大于正常參考上限38.7 s）、狼瘡抗凝物篩查及確證試驗陽性患者的臨床資料。在31 例患者中，男性10 例，女性21 例；年齡為15～74 歲，中位年齡為53 歲，呈偏態(tài)分布。所有患者就診時均無血栓及出血的臨床表現(xiàn)，且在采血前2 周內未使用肝素、華法林、阿司匹林等抗凝藥物。本研究經上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院倫理委員會審核批準。

二、方法

1.標本采集：用109 mmol/L 枸櫞酸鈉抗凝管（枸櫞酸鈉與血液比例為1∶9）采集外周靜脈血2.7 mL，并充分混勻，標本應無溶血、凝固、乳糜等現(xiàn)象。行3 000 r/min 離心10 min 后，分離乏血小板血漿，樣本采集后2 h 內完成測定。

2.狼瘡抗凝物篩選試驗：應用Sysmex CS 5100全自動凝血分析儀及其配套試劑，基于凝固法測得APTT（以低濃度磷脂為激活劑）作為狼瘡抗凝物的篩選實驗。如果APTT 明顯延長（大于正常參考值上限38.7 s)，則根據CLSI 關于狼瘡抗凝物的實驗室檢測指南進行狼瘡抗凝物的確證試驗。

3.狼瘡抗凝物確證試驗：采用ACL TOP-700（美國Werfen Instrumentation Laboratory 公司）全自動凝血分析儀及其配套試劑測得dRVVT 標準化比值，以該值的大小表示狼瘡抗凝物的陽性程度[2]。以上試驗均嚴格按照儀器和試劑的說明書進行操作。篩查及確證試驗dRVVT 的公式及參考范圍如下。dRVVT 篩選比值=患者dRVVT 篩選時間（s）/dRVVT 篩選正常均值（s）；dRVVT 確證比值=患者dRVVT 確證時間（s）/dRVVT 確證正常均值（s）；dRVVT 標準化比值=dRVVT 篩選比值/dRVVT 確證比值。篩選試驗采用低磷脂濃度試劑，確證試驗采用高磷脂濃度試劑，dRVVT 標準化比值的最佳臨界值為1.2。

4.混合試驗：當dRVVT 標準化比值大于1.2 時，高度提示狼瘡抗凝物陽性，則進一步行混合試驗，也被稱為糾正試驗。國際血栓與止血學會推薦檢測病人血漿（病漿）、正常血漿、1∶1 混合血漿（正常人與病漿），使用結果的比值Rosner 指數（也稱循環(huán)抗凝指數）來進行評價[2,4]。dRVVT 確證試驗與混合試驗均出現(xiàn)陽性結果時，可判定為狼瘡抗凝物陽性。

混合試驗的判斷標準如下。Rosner 指數（R）=（1∶1 混合血漿APTT 秒數-正常人血漿APTT 秒數）/病漿APTT 秒數×100%；R1=（即刻1∶1 混合血漿APTT 秒數-正常人血漿APTT 秒數）/病漿APTT 秒數×100%；R2=（孵育2 h 后1∶1 混合血漿APTT 秒數-正常人血漿APTT 秒數）/病漿APTT 秒數×100%（正常人血漿指20 人份正常人血漿制備正常人混合血漿；R1、R2>11 為抑制劑型、R1、R2<11 為因子缺乏型）。

三、統(tǒng)計學處理

應用SPSS 26.0 軟件、Excel 軟件進行數據的統(tǒng)計學描述、正態(tài)性檢驗以及相關性分析（P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義），應用Graphpad Prism 8.0 繪圖軟件繪制統(tǒng)計結果。非正態(tài)分布的計量資料以中位數及圖形表示其分布及離散程度。

結 果

一、實驗室檢測結果

31 例患者的狼瘡抗凝物篩選試驗APTT 值為42.5～91.0 s，均值為57.8 s；確證試驗dRVVT 標準化比值為1.3～3.22，均值為2.28。正常人血漿的APTT 值為25.0～27.7 s，均值為26.4 s；1∶1 混合血漿即刻APTT 值為29.5～69.3 s，均值為46.8 s；1∶1混合血漿2 h APTT 值為29.9～75.2 s，均值為49.34 s。Rosner 指數（即刻，R1）為7.30～50.52，均值為33.81；Rosner 指數（2 h，R2）為8.60～61.72，為均值33.21，其具體分布見圖1。

二、檢測結果的相關性分析

繪制31 例患者dRVVT 標準化比值分別與病漿APTT 值、R1、R2 間關系的散點圖（見圖2），可以看出dRVVT 標準化比值分別與病漿APTT 值、R1 及R2值之間存在正相關性。進一步應用Pearson 相關性分析，計算其各自相關系數，具體結果見表1。dRVVT 標準化比值與病漿APTT 值、R1 及R2 值間顯著相關，相關系數r 值在0.54～0.62 之間，且P 值均小于0.05。

圖1 混合試驗4 種血漿APTT 值及Rosner指數R1、R2 的分布情況

表1 dRVVT 標準化比值與混合試驗結果間的相關性分析

討 論

一、狼瘡抗凝物的病理機制

狼瘡抗凝物由一組抗磷脂或抗磷脂結合蛋白的自身抗體所組成，與抗心磷脂抗體和抗β2糖蛋白I 抗體密切相關。在體外凝血功能試驗中，狼瘡抗凝物通過與凝血因子競爭性結合磷脂表面來抑制凝血反應，導致凝血反應時間延長。最早狼瘡抗凝物是在具有出血傾向的系統(tǒng)系紅斑狼瘡患者中被發(fā)現(xiàn)，但其發(fā)生與系統(tǒng)性自身免疫疾病并不完全相關。同時，與正常人群相比，絕大多數狼瘡抗凝物陽性患者的出血風險并未增加，反而更容易罹患血栓性疾病[5]。雖然狼瘡抗凝物的存在導致體外凝血試驗所測定的凝血反應活性下降，但其在體內對同樣發(fā)生于磷脂表面的抗凝反應也產生抑制作用，能夠減緩活化蛋白C 對活化的凝血因子Ⅴ的滅活，阻礙抗凝血酶與凝血酶形成復合物，同時促進血小板的激活和活化[6]。因此，狼瘡抗凝物可影響凝血與抗凝反應之間的平衡，促進體內血液高凝，產生了血栓形成的獲得性危險因素?？沽字C合征的患者由于存在狼瘡抗凝物等抗磷脂抗體的病理作用，從而導致了動靜脈血栓及復發(fā)性流產等臨床表現(xiàn)[7]。

二、狼瘡抗凝物的實驗室檢測

狼瘡抗凝物的檢測是臨床診斷抗磷脂綜合征的關鍵[8]。依賴磷脂的凝血試驗，如APTT 法和dRVVT 法是國際上最常用的2 種檢測方法。狼瘡抗凝物的存在會導致APTT（內源性途徑及共同途徑）和dRVVT（共同途徑）試驗中的凝血時間延長，因此被廣泛作為狼瘡抗凝物的篩查試驗[2,9]。在試驗體系內添加高濃度磷脂成分以使患者延長的凝血時間縮短的確證試驗，則是實驗室診斷狼瘡抗凝物的重要環(huán)節(jié)[10]。同時，為了與凝血因子缺陷所致的APTT延長相鑒別，特別是先天性凝血因子缺陷造成的凝血時間延長進行鑒別，通常還需要進行混合試驗，即將患者血漿與正常人血漿1∶1 混合，觀察延長的凝血時間是否可被糾正[3,11]。國際血栓與止血學會在其2009 指南中推薦，狼瘡抗凝物的檢測順序為篩選試驗、混合試驗、確證試驗；而2014 年CLSI 關于狼瘡抗凝物檢測指南——CLSI 2014（H60）文件（以下簡稱CLSI 指南）則建議檢測流程為篩選試驗、確證試驗、混合試驗。但在臨床實踐中，對混合試驗在狼瘡抗凝物診斷中的必要性尚存在爭論[12]。CLSI 指南中明確提出，狼瘡抗凝物的復合試驗應包括混合糾正試驗，但并非必要，應根據患者已有檢測結果和臨床癥狀來決定是否需要作進一步試驗以明確診斷[3]。

圖2 dRVVT 標準化比值分別與APTT(病漿)、R1、R2 關系的散點圖

綜上，本研究結果顯示，dRVVT 確證試驗與混合試驗的結果間具有顯著相關性，但并非嚴格的線性相關?；谠砩系牟顒e，本研究認為2 種檢測方法在狼瘡抗凝物檢測中仍具有相對的獨立性，并不可完全替代。兩者相結合的復合實驗可以提高狼瘡抗凝物的陽性率和準確率[13-14]?？傊诠餐緩絛RVVT 法的篩選、確證試驗是國際上檢測狼瘡抗凝物較常用的方法之一，但對于弱陽性的患者或結果難以解釋時，需要結合混合試驗結果，以幫助鑒別由于凝血因子缺乏及其抗體所造成的APTT檢測結果延長。雖然本研究顯示，確證試驗與混合試驗結果間具有較強的相關性，但在實驗室人力、物力允許的情況下，仍建議將二者相結合進行分析，從而提高狼瘡抗凝物的檢出率，降低誤診率和漏診率。