呂興 呂高虹 葉冠

摘 要 目的：觀察胃復(fù)春改善幽門(mén)螺桿菌（Hp）致人胃黏膜上皮細(xì)胞（GES-1）惡性轉(zhuǎn)化的作用機(jī)制。方法：采用Hp感染GES-1細(xì)胞建立感染模型，隨后加入含不同濃度胃復(fù)春的血清進(jìn)行干預(yù)。MTT法考察GES-1細(xì)胞的增殖能力，Transwell法觀察GES-1細(xì)胞的浸潤(rùn)能力，Western bolting法檢測(cè)細(xì)胞中CDX2、COX-2、GC-C、CagA及KLF4表達(dá)水平。結(jié)果：胃復(fù)春可有效抑制GES-1細(xì)胞的增殖與侵襲能力，同時(shí)下調(diào)細(xì)胞中CDX2、COX-2、GC-C及CagA的表達(dá)，上調(diào)KLF4的表達(dá)。結(jié)論：胃復(fù)春可通過(guò)介導(dǎo)CagA/KLF4信號(hào)通路抑制胃黏膜上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，削弱其增殖與侵襲能力，減少細(xì)胞中CDX2、COX-2及GC-C的含量，有效改善GES-1細(xì)胞的腸化生進(jìn)程，從而發(fā)揮其治療胃癌癌前病變的作用。

關(guān)鍵詞 胃復(fù)春 幽門(mén)螺桿菌 人胃黏膜上皮細(xì)胞 腸化生 CagA/KLF4信號(hào)通路

中圖分類(lèi)號(hào)：R286； R735.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2020）07-0058-04

Protective effects of Weifuchun on malignant transformation of human gastric mucosal epithelial cells induced by Helicobacter pylori*

LYU Xing1**， LYU Gaohong2， YE Guan1***（1. Central Research Institute， Shanghai Pharmaceutical Holding Co.， Ltd.， Shanghai 201203， China； 2. School of Pharmacy， Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China）

ABSTRACT Objective： To investigate the mechanism of Weifuchun in the treatment of the malignant transformation of human gastric mucosal epithelial cells （GES-1） induced by Helicobacter pylori （Hp）. Methods： Hp was added into GES-1 cells culture containing different concentrations of Weifuchun to establish the infection models. The GES-1 cell proliferation was determined by MTT assay. The GES-1 cell invasion was observed by transwell chamber assay and the expression levels of CDX2， COX-2， GC-C， CagA and KLF4 were detected by Western blotting. Results： Weifuchun could effectively inhibit the proliferation and invasion of GES-1 cells， down-regulate the expression of CDX2， COX-2， GC-C and CagA， and up-regulate the expression of KLF4. Conclusion： Weifuchun can inhibit the malignant transformation of GES-1 cells by mediating the CagA/KLF4 signaling pathway， suppress their proliferation and invasion ability and can also reverse the gastric intestinal metaplasia of GES-1 cells by reducing the CDX2， COX-2 and GC-C levels so as to finally treat the gastric precancerous lesions.

KEy WORDS Weifuchun； Helicobacter pylori； human gastric mucosal epithelial cells； gastric intestinal metaplasia； CagA/KLF4 signaling pathway

胃癌（gastric cancer， GC）是一種高發(fā)病率、高死亡率的疾病，其發(fā)病率在全球常見(jiàn)的惡性腫瘤中高居第4位，死亡率亦高達(dá)第2位[1]。“ 正常胃黏膜→淺表性胃炎→慢性萎縮性胃炎→腸上皮化生→異性增生→胃癌”是較為公認(rèn)的胃癌病變的發(fā)展模式[2]，其中腸上皮化生（intestinal metaplasia， IM）被認(rèn)為是胃癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中重要的癌前病變[3]。同時(shí)，已有研究證實(shí)健康人群其胃癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)不到胃黏膜腸化生患者的10%[4]，因此通過(guò)逆轉(zhuǎn)胃黏膜腸化生是逆轉(zhuǎn)胃癌發(fā)生的重要舉措。然而幽門(mén)螺桿菌（Helicobacter pylori， Hp）作為胃癌發(fā)生過(guò)程中的啟發(fā)因子，感染機(jī)體后可產(chǎn)生較高水平的尿素酶、黏液酶、脂酶及脂多糖等致病因子，通過(guò)趨化、黏附，定植于胃黏膜，破壞胃黏膜完整性繼而誘發(fā)慢性胃炎，推動(dòng)胃癌的病變進(jìn)程[5-6]。中國(guó)作為Hp感染的首要國(guó)家，其感染率高達(dá)50%～80%[7]，而大部分患者經(jīng)過(guò)臨床常規(guī)治療后出現(xiàn)感染復(fù)發(fā)[8]，因此迫切需要挖掘更有效、安全的治療藥物，這將對(duì)阻斷慢性胃炎發(fā)展、抑制胃癌發(fā)生產(chǎn)生重大意義。

中醫(yī)藥在胃癌前病變方面顯示出積極的防治作用[9-10]，而胃復(fù)春片作為國(guó)家中藥保護(hù)品種，具有健脾益氣，活血解毒等功效，已被批準(zhǔn)用于胃癌前病變的治療。藥理研究發(fā)現(xiàn)，胃復(fù)春具有抑制幽門(mén)螺桿菌，改善胃黏膜萎縮等作用活性，在對(duì)病變中出現(xiàn)不典型增生及腸上皮化生的臨床病理改善方面其產(chǎn)生的有效率高達(dá)到66.0%[11-12]，由此明確了胃復(fù)春在胃癌癌前病變治療中的重要價(jià)值。目前關(guān)于胃復(fù)春的研究主要側(cè)重于臨床方向，同時(shí)其在防治胃癌癌前病變的機(jī)制研究尚不充分。為進(jìn)一步探索胃復(fù)春防治胃癌癌前病變的作用及機(jī)制，本課題擬采用Hp感染GES-1細(xì)胞，建立細(xì)胞病變模型，通過(guò)分子生物學(xué)手段闡釋胃復(fù)春的治療機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與菌株

人胃黏膜上皮細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；幽門(mén)螺桿菌（NCTC11637）購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心。

1.2 主要試劑與儀器

胃復(fù)春片（國(guó)藥準(zhǔn)字Z20040003，杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司）；MTT（批號(hào)S33649，美國(guó)Sigma公司）；CDX2、COX-2、KLF4及β-Tubulin抗體（美國(guó)Cell signaling Technology公司）；GC-C及Cag A抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；全蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（南京凱基生物公司）；BCA、ECL試劑盒、Orma371型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱及細(xì)菌三氣培養(yǎng)箱（美國(guó) Thermo Fisher公司）；Transwell小室（美國(guó)Corning公司）；SDS-PAGE電泳系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；Western blot轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)、Gel Doc凝膠成像儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；Synergy HT酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTeK公司）；ALLEGRA X-15R高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman Coulter公司；Olympus AX70顯微照相系統(tǒng)（日本Olympus公司）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞、菌株培養(yǎng)及細(xì)胞感染模型的建立

取GES-1細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，接種在DMEM培養(yǎng)基（10% FBS+1% P/S）中，并置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)傳代培養(yǎng)。取Hp活菌（2×107 CFU/ml），將其中100 μl均勻涂抹于布氏改良選擇性平板培養(yǎng)基上，并置于85% N2、10% CO2及5% O2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按常規(guī)細(xì)胞造模法[13]，在無(wú)抗生素條件下細(xì)菌-細(xì)胞為200∶1的比例共培養(yǎng)。

1.3.2 含藥血清制備

根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》中人-大鼠用藥量及體表面積計(jì)算得大鼠的等效劑量為27.22 g/（kg·d），大鼠每日采取5倍量給藥，持續(xù)7 d。末次給藥1 h后腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈取血，37 ℃靜置1 h，置入配有TLA-120.1轉(zhuǎn)子的高速冷凍離心機(jī)中進(jìn)行離心分離血清（1 000 r/min，5 min，4 ℃），置56 ℃，30 min滅活處理，過(guò)濾、分裝、保存。

1.3.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率

待GES-1細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)加入含不同濃度胃復(fù)春（0、5%、10%、20%）的血清，1 h后加入Hp菌液進(jìn)行感染。23 h后加入MTT液（5 g/L）20 μl并繼續(xù)培養(yǎng)。4 h后棄上清，每孔再加入150 μl DMSO振蕩10 min 溶解，用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度A。按增殖率= （處理組A/空白對(duì)照組A）×100%計(jì)算細(xì)胞增殖率（%）。

1.3.4 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲力

采用Matrigel（1∶8稀釋?zhuān)?duì)Transwell小室底部膜的上室面進(jìn)行鋪膠，凝膠后在上室中加入1×105個(gè)GES-1細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，隨后加入含不同濃度胃復(fù)春（0、5%、10%、20%）的血清，1 h后加入Hp菌液進(jìn)行感染。 23 h后取出小室，4%多聚甲醛固定、風(fēng)干。0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察、記數(shù)。按侵襲率= （處理組細(xì)胞數(shù)/空白對(duì)照組細(xì)胞數(shù)）×100%計(jì)算細(xì)胞侵襲率（%）。

1.3.5 免疫印跡法檢測(cè)

待GES-1細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)加入含不同濃度胃復(fù)春（0、1、5、25 μg/ml）的血清，1 h后加入Hp菌液進(jìn)行感染。23 h后收集細(xì)胞并裂解，取20 μg蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳、電轉(zhuǎn)移、5% BSA封閉。加CDX2、COX-2、GC-C、CagA、KLF4及β-Tubulin一抗4 ℃過(guò)夜孵育， HRP標(biāo)記的二抗孵育。ECL化學(xué)發(fā)光、顯影。

1.3.6 數(shù)理統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果

2.1 胃復(fù)春對(duì)Hp感染后GES-1細(xì)胞增殖能力的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組中GES-1細(xì)胞增殖率顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，在含10%胃復(fù)春的血清中培養(yǎng)時(shí)可明顯抑制GES-1細(xì)胞的增殖（P<0.05），在含20%胃復(fù)春的血清中培養(yǎng)則可顯著抑制細(xì)胞的增殖（P<0.01，圖1）。

2.2 胃復(fù)春對(duì)Hp感染后GES-1細(xì)胞侵襲能力的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組中GES-1細(xì)胞侵襲能力顯著提升（P<0.01）；與模型組比較，在含5%胃復(fù)春的血清中培養(yǎng)時(shí)可明顯抑制GES-1細(xì)胞的侵襲（P< 0.05），而在含10%及20%胃復(fù)春的血清中培養(yǎng)時(shí)則可顯著抑制細(xì)胞的侵襲，且呈濃度依賴(lài)性（P<0.01，圖2）。

2.3 胃復(fù)春對(duì)Hp感染后GES-1細(xì)胞中腸化生標(biāo)志物表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組GES-1細(xì)胞中腸化生標(biāo)志物（COX-2、GC-C及CDX2）的表達(dá)水平顯著上調(diào)（P<0.01）。與模型組比較，在含5%胃復(fù)春的血清中培養(yǎng)時(shí)明顯抑制COX-2、GC-C及CDX2的表達(dá)（P<0.05）；在含10%胃復(fù)春的血清中培養(yǎng)時(shí)可顯著減少COX-2及GC-C的表達(dá)（P<0.01），明顯下調(diào)CDX2的表達(dá)（P<0.05）；而在含20%胃復(fù)春的血清中培養(yǎng)時(shí)則可顯著降低COX-2、GC-C及CDX2的表達(dá)水平（P<0.01，圖3）。

2.4 胃復(fù)春對(duì)Hp感染后GES-1細(xì)胞中CagA/KLF4信號(hào)通路的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組GES-1細(xì)胞中CagA的表達(dá)水平顯著上調(diào)（P<0.01），而KLF4的表達(dá)水平顯著下調(diào)（P<0.01）。在CagA表達(dá)方面：與模型組比較，在含10%及20%胃復(fù)春的血清中培養(yǎng)時(shí)可顯著抑制CagA的表達(dá)（P<0.01）；在KLF4表達(dá)方面：與模型組比較，在含5%胃復(fù)春的血清中培養(yǎng)時(shí)可明顯促進(jìn)KLF4的表達(dá)（P<0.05），在含10%及20%胃復(fù)春的血清中培養(yǎng)時(shí)可顯著上調(diào)KLF4的表達(dá)，且存在一定的劑量效應(yīng)關(guān)系（P<0.01，圖4）。

3 討論

已有研究發(fā)現(xiàn)，CagA蛋白在Hp感染誘發(fā)胃癌的進(jìn)程中占據(jù)重要角色[14]，Hp可將大量CagA蛋白從特異性Ⅳ型分泌系統(tǒng)導(dǎo)入胃黏膜上皮細(xì)胞，激活細(xì)胞內(nèi)各類(lèi)致癌信號(hào)，通過(guò)加劇細(xì)胞增殖、遷移及形態(tài)學(xué)改變，推動(dòng)胃癌的發(fā)生、發(fā)展[15]。而KLF4是GagA信號(hào)通路中重要的抑癌因子，具有抑制細(xì)胞過(guò)度增殖，防止細(xì)胞異常分化等作用，可有效抑制GES-1細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化及惡性行為學(xué)改變[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃復(fù)春可通過(guò)干擾Hp感染后GES-1細(xì)胞內(nèi)CagA/KLF4信號(hào)傳導(dǎo)，抑制細(xì)胞增殖及侵襲，從而有效防止GES-1細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。腸上皮化生是胃黏膜上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的重要途徑，Hp感染則是其重要的誘導(dǎo)因素[17]，CDX2、COX-2及CG-C作為重要的生物標(biāo)志物參與了腸上皮化生的病變進(jìn)程。本研究表明，胃復(fù)春可明顯下調(diào)CDX2、COX-2及CG-C的表達(dá)水平，逆轉(zhuǎn)GES-1細(xì)胞的腸上皮化生進(jìn)程，繼而發(fā)揮其改善胃癌癌前病變的作用。綜上所述，胃復(fù)春片可通過(guò)干預(yù)Hp感染的GES-1細(xì)胞內(nèi)CagA/KLF4信號(hào)通路，有效逆轉(zhuǎn)GES-1細(xì)胞的腸化生進(jìn)程，削弱細(xì)胞增殖與侵襲能力，從而發(fā)揮其治療胃癌癌前病變的作用。通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)可為胃復(fù)春片在臨床胃癌癌前病變的應(yīng)用治療過(guò)程中夯實(shí)明確的科學(xué)依據(jù)。

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