徐 靜，苗 騰，周云成，鄧寒冰，宋 平，張聿博

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 信息與電氣工程學(xué)院，沈陽 110161）

玉米在全世界熱帶和溫帶地區(qū)種植廣泛，是目前世界上分布最廣泛、最高產(chǎn)的谷類糧食作物之一，同時也是重要的食品、醫(yī)藥、畜牧業(yè)的優(yōu)質(zhì)飼料。我國不僅是世界玉米的主要生產(chǎn)國，也是玉米的主要消費(fèi)國，自20世紀(jì)70年代后期，中國的玉米主產(chǎn)區(qū)呈現(xiàn)不斷擴(kuò)張的趨勢，使玉米從第三大糧食作物晉升為第一大糧食作物[1]。隨著玉米種植面積的不斷擴(kuò)大，加之環(huán)境、氣候因素的影響，玉米病害成了影響玉米生長的重要因素。農(nóng)作物病害分為非侵染性病害和侵染性病害兩種，其中侵染性病害是由生物因素引發(fā)的病害，主要有真菌、細(xì)菌、病毒等病原物。玉米彎孢葉斑病又稱為黑霉病、擬眼斑病，是由新月彎孢菌[Curvularia lunata(Wakker)Boedijin]引發(fā)的葉部真菌病害，是20世紀(jì)90年代中后期我國東北和華北玉米產(chǎn)區(qū)新流行的一種重要病害[2]，是我國繼玉米大、小斑病后又一嚴(yán)重的災(zāi)變性病害[3]。侵染性病害的發(fā)病需要經(jīng)侵入期、潛育期和發(fā)病期3個階段。在孢子侵入寄主到未呈現(xiàn)明顯癥狀的潛育期是病害發(fā)生的早期階段，如果能夠及時檢測到病害的發(fā)生，適當(dāng)施藥，可以有效控制病害的進(jìn)一步發(fā)展，對減少用藥和環(huán)境污染、提高作物品質(zhì)具有重要的意義。

高光譜成像技術(shù)是一種常用的無損檢測技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品內(nèi)外部品質(zhì)檢測[4-6]，蔬菜農(nóng)藥殘留[7]等領(lǐng)域，品類涉及蔬果[8-14]、畜禽肉[15-17]、禽蛋[18]等。近年來，有學(xué)者將該技術(shù)用于植物病蟲害檢測的研究并取得了一定的進(jìn)展。蘆兵等[19]對采集的樣本高光譜數(shù)據(jù)，使用連續(xù)投影算法優(yōu)選特征波段，采用一階到三階矩和紋理LBP算子提取樣本圖像的顏色、紋理特征，通過支持向量機(jī)預(yù)測模型對生菜炭疽病、菌核病、白粉病的不同發(fā)病時期進(jìn)行分類研究。雷雨等[20]基于高光譜成像系統(tǒng)，采集受條銹菌侵染的小麥葉片的高光譜數(shù)據(jù)。利用掩膜處理提取葉片的高光譜數(shù)據(jù)，基于主成分分析采用最大類間方差法分割病斑區(qū)域，根據(jù)病斑區(qū)域面積比例進(jìn)行小麥條銹病病害分級的研究。馮偉等[21]利用高光譜估測在白粉病脅迫下小麥冠層葉綠素的密度，確定NDAI(α，β)是估測病害小麥冠層葉綠素密度的可靠指標(biāo)。鄭志雄等[22]結(jié)合定性分析和定量估算，通過分析葉瘟病斑區(qū)域與正常葉片部位的光譜特征，對差異較大的光譜進(jìn)行二維散點(diǎn)圖分析，提取病斑高光譜圖像，利用主成分分析和最大類間方差法，結(jié)合延伸率和受害率對水稻葉瘟病病害程度進(jìn)行分級。田有文等[23]利用獲取的黃瓜霜霉病、白粉病病葉的高光譜圖像數(shù)據(jù)，選取特征波長下的圖像，提取黃瓜病葉的色度矩紋理向量，采用支持向量機(jī)分類方法對黃瓜病害進(jìn)行分類。李波等[24]通過對水稻葉片的光譜特征分析，選用可見波段和短波紅外波段，采用主成分分析技術(shù)獲得主分量光譜，結(jié)合概率神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對水稻稻干尖線蟲病和稻縱卷葉螟進(jìn)行識別。本研究以接種玉米彎孢葉斑菌的玉米葉片為研究對象，基于高光譜成像技術(shù)開展玉米葉部侵染性病害玉米彎孢葉斑病早期檢測的研究。利用高光譜成像采集系統(tǒng)，獲取接種病菌后連續(xù)5d的玉米葉片的高光譜圖像，通過接種葉片與正常未接種葉片對比分析，確定檢測受病菌侵染葉片的特征波段，并利用優(yōu)選出的特征波段建立玉米彎孢葉斑病的支持向量機(jī)檢測模型。研究結(jié)果為實(shí)現(xiàn)玉米病害的快速、無損、早期檢測提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究以玉米葉片為試驗(yàn)對象，供試玉米品種為增玉1572，由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)特種玉米研究所提供。供試的菌株為新月彎孢菌，由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)分子與生理植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。玉米樣品于2018年6月16日在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)科研基地玉米試驗(yàn)田播種，每行播種25粒，每列播種20粒，行距60cm，株距30cm，均勻播種，每株處于日照充足，通風(fēng)良好，溫濕度相同環(huán)境下生長。2018年8月初玉米長到拔節(jié)期，接種玉米彎孢葉斑病病菌開展試驗(yàn)。選擇每株第8片葉片進(jìn)行接種，共接種250株，120株作為對照不接種。接種時將已培養(yǎng)10d的新月彎孢菌，用滅菌的內(nèi)徑6mm打孔器切取菌餅，將菌絲一面貼于玉米葉片表面，并用記號筆作出標(biāo)記。接種后每天用小噴壺對玉米葉片進(jìn)行人工補(bǔ)水。玉米彎孢葉斑病發(fā)病速度快，大約在5～7d就可完成一次侵染周期，在溫濕度適宜的情況下，3d就可見細(xì)小褪綠葉斑，因此在接種后1，2，3，4，5d，每天采集接種葉片30片，正常未接種葉片10片。

1.2 高光譜成像系統(tǒng)

本研究利用高光譜成像系統(tǒng)采集高光譜圖像數(shù)據(jù)（圖1）。系統(tǒng)由成像光譜儀（ImSpector V10E）、EMCCD相機(jī)（IGV-B1410M）、鹵素光源（IT 3900，1500W）、聚光鏡、移動載物平臺和計(jì)算機(jī)等組成。系統(tǒng)采集光譜波長范圍400～1000nm，共512個波段，光譜分辨率為2．8nm。為了提高采集精度，避免環(huán)境光的影響，整套系統(tǒng)放置在一個密閉的暗箱中。

1.3 高光譜圖像采集

為了保證采集光譜信息的準(zhǔn)確性，每次將1片玉米葉片樣本平整的放于黑色的載物臺上，共采集接種葉片150片，未接種葉片50片，總計(jì)200個樣本。在采集高光譜圖像數(shù)據(jù)前，需要根據(jù)鏡頭高度、焦距及光源的亮度，調(diào)整高光譜攝像頭的曝光時間及載物臺移動速度，以保證圖像的清晰度。經(jīng)過反復(fù)修正，最終確定曝光時間7．4ms，物距 430mm，位移臺移動速度 2．85mm·s-1。數(shù)據(jù)采集時，玉米葉片隨著載物臺勻速移動，高光譜攝像頭和圖像光譜儀獲取葉片在各個波長處的每個像素的光譜信息及各個波段下的圖像數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本研究數(shù)據(jù)采集軟件為ISUZU OPTICS公司的Spectral-image， 數(shù)據(jù)處理采用 ENVI5．1 （Research System Inc．，Boulder，Colo．，USA）、Matlab2012a （The Math-Works Inc．，Natick，USA）、SPSS21．0（IBM，Chicago，USA）、Excel2013（Microsoft，USA）軟件開發(fā)平臺。

圖1 高光譜成像系統(tǒng)Figure 1 hyperspectral imaging system

2 結(jié)果與分析

2.1 反射光譜校正

為了消除光強(qiáng)分布弱的波段圖像噪聲及暗電流的影響，在高光譜圖像采集前，需要對圖像進(jìn)行反射光譜校正。首先掃描有相對高反射率參考白板采集反射率為100%的全白標(biāo)定圖像IW，然后蓋上鏡頭蓋采集反射率為0的全黑標(biāo)定圖像ID，接著將玉米葉片放在載物臺上采集樣品的光譜圖像IS。最后根據(jù)式（1）計(jì)算在波段i處校正后的反射率R。

2.2 玉米彎孢葉斑病特征波段選擇

2.2.1 感興趣區(qū)域選擇 感興趣區(qū)域（region of interest，ROI）選擇樣本的部分區(qū)域。其中對接種病菌的葉片選擇接種部位作為ROI，對正常未接種葉片選取10個大小為50×50像素區(qū)域作為ROI，計(jì)算平均光譜作為正常未接種葉片的平均光譜，對于出斑葉片選擇斑區(qū)作為ROI。

2.2.2 光譜特征 本試驗(yàn)中，玉米葉片在接種后的3d內(nèi)，葉片表面未見異常，在接種4d后，被接種了玉米彎孢葉斑菌的葉片就開始出現(xiàn)細(xì)小褪綠葉斑，7d后所有接種葉片均出現(xiàn)葉斑，并開始向其他植株擴(kuò)散。圖2為接種葉片斑區(qū)，接種葉片未出斑，正常未接種葉片的平均光譜對比。

由圖2可知，光譜曲線在440～520nm和560～680nm波段范圍內(nèi)，接種出斑葉片平均光譜反射率高于接種未出斑葉片和正常未接種葉片。在520～560nm波段范圍內(nèi)，接種出斑葉片的平均光譜反射率高于接種未出斑葉片但低于正常未接種葉片。在720～1000nm波段范圍內(nèi)，接種病菌葉片平均光譜反射率低于正常未接種葉片。

2.2.3 光譜預(yù)處理 由圖2原始平均光譜反射率的對比，將440～520，520～560，560～680，720～1000nm 作為特征波段的選取區(qū)域。同時，為了提高光譜的分辨率，對原始光譜進(jìn)行導(dǎo)數(shù)處理，本研究對原始光譜進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù)處理，得到原始光譜的一階導(dǎo)數(shù)光譜（圖3）。由圖3可知，在520～535nm和710～740nm波段區(qū)間的兩個反射峰，接種病菌葉片與正常未接種葉片的一階導(dǎo)數(shù)光譜的峰值存在差異。

圖2 葉片平均光譜特征Figure 2 Average spectral curves

將接種病菌葉片與正常未接種葉片的平均光譜求取差值再給出其對應(yīng)的絕對值，可以得到接種病菌葉片與正常未接種葉片平均光譜的絕對差值曲線（圖4）。由圖4可知，在440～840nm波段范圍內(nèi)，550nm附近有一峰值，755nm附近有一個最高點(diǎn)，480nm附近有一個最低點(diǎn)。

圖3 接種病菌葉片與正常未接種葉片的一階導(dǎo)數(shù)光譜Figure 3 First-order derivative curves of leaves following inoculation and healthy

圖4 接種病菌葉片與正常未接種葉片平均光譜絕對差值曲線Figure 4 Absolute difference curves of reflectance between leaves following inoculation and healthy

通過上述對于接種病菌葉片與正常未接種葉片的光譜預(yù)處理，確定玉米彎孢葉斑病早期檢測的特征波段選取區(qū)。原始光譜分析得到特征選取區(qū)為 440～520，520～560，560～680，720～1000nm，原始光譜的一階導(dǎo)數(shù)光譜分析得到特征選取區(qū)為520～535nm和710～740nm，平均光譜絕對差值特征波段為480，550，755nm。

2.2.4 接種葉片顯微觀察 通過對采集的玉米葉片高光譜數(shù)據(jù)光譜特征的分析，可以看出在接種病菌葉片表面未見明顯病害侵染癥狀的早期，接種病菌葉片與正常未接種葉片平均光譜存在差異。為了確定差異是受病菌侵染造成的，就要明確葉片接種是否成功。因此，當(dāng)樣本葉片高光譜數(shù)據(jù)采集結(jié)束后，利用金相顯微鏡系統(tǒng)對葉片進(jìn)行顯微觀察，通過顯微觀察的結(jié)果判斷接種是否成功，顯微觀察結(jié)果如圖5。通過對接種彎孢葉斑菌的玉米葉片樣本顯微觀察，觀察到病菌從萌動到菌絲侵入氣孔，通過顯微鏡的檢測確認(rèn)接種玉米葉片樣本全部接種成功，從而利用高光譜圖像采集系統(tǒng)所采集的玉米葉片，其光譜數(shù)據(jù)可用于玉米病害的早期檢測研究。

圖5 接種病菌葉片顯微觀察Figure 5 Microscopic observation of leaves following inoculation

2.2.5 光譜特征波段提取 經(jīng)過對原始光譜、原始光譜的一階導(dǎo)數(shù)分析，確定了440～520，520～535，560～680，710～740nm為玉米彎孢葉斑病早期檢測的特征波段選取區(qū)。但高光譜數(shù)據(jù)波段較多，相鄰波段具有較大的相關(guān)性，因此需要在特征波段選取區(qū)中進(jìn)一步提取更具代表性的特征波段。

通過SPSS進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和相關(guān)性分析，將置信區(qū)間設(shè)為95%，在4個特征波段選取區(qū)中確定12個波段作為特征波段，與平均光譜絕對差值確定的3個波段，將15個波段作為確定玉米彎孢葉斑病早期檢測的特征波段，結(jié)果如表1。

表1 玉米彎孢葉斑病早期檢測特征波段Table 1 Feature bands of Curvularia lunata

2.3 玉米彎孢葉斑病早期檢測結(jié)果

借助Matlab軟件，構(gòu)建玉米彎孢葉斑病支持向量機(jī)檢測模型。本研究主要針對葉片表面未見明顯葉斑的葉片進(jìn)行檢測，因此對于采集的接種后1，2，3d玉米葉片的高光譜數(shù)據(jù)作為數(shù)據(jù)來源，利用ENVI選取每天接種葉片180個ROI，正常未接種葉片100個ROI，共280個ROI，其中接種葉片120個ROI和正常未接種葉片60個ROI用于訓(xùn)練，接種葉片60個ROI和正常未接種葉片40個ROI用于測試。利用特征波段作為支持向量機(jī)的輸入矢量，選擇線性核函數(shù)、多項(xiàng)式核函數(shù)、徑向基核函數(shù)3種不同核函數(shù)。支持向量機(jī)中學(xué)習(xí)參數(shù)C選取10，松弛因子ξ選取0．001，多項(xiàng)式核函數(shù)中多項(xiàng)式次數(shù)選取3，徑向基核函數(shù)中高斯核帶寬σ選取16。通過3種支持向量機(jī)核函數(shù)檢測結(jié)果，線性核函數(shù)在接種第3d，測試集準(zhǔn)確率達(dá)到88．75%，測試結(jié)果如表2。

表2 玉米彎孢葉斑病早期檢測測試結(jié)果Table 2 Test results of Curvularia lunata

通過對不同時間點(diǎn)采集的樣本進(jìn)行支持向量建模分析，發(fā)現(xiàn)隨著接種時間的不斷增加，接種準(zhǔn)確率在不斷提高。表明基于優(yōu)選的特征波段進(jìn)行玉米彎孢葉斑病早期檢測是可行的。

3 討論與結(jié)論

近年來，高光譜成像技術(shù)被廣泛用于農(nóng)作物的病害檢測。馮雷等[25]利用高光譜成像系統(tǒng)采集在380～1031nm波長范圍內(nèi)茄子葉片的高光譜圖像信息，通過PCA進(jìn)行數(shù)據(jù)降維，優(yōu)選出3個特征波段下的特征圖像，提取均值、方差、同質(zhì)性等8個基于灰度共生矩陣的紋理特征變量，利用SPA提取13個特征變量，基于LS-SVM建立茄子葉片灰霉病早期識別模型，結(jié)果表明高光譜成像技術(shù)可以用于茄子葉片灰霉病的早期檢測。袁建清等[26]基于高光譜成像技術(shù)開展大田試驗(yàn)，通過獲取的健康、缺氮、輕微染病和重度染病的水稻葉片反射光譜，建立基于偏最小二乘判別分析和主成分—支持向量機(jī)水稻葉瘟病識別模型。試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換的偏最小二乘判別分析模型識別結(jié)果最佳。高光譜成像技術(shù)可以利用光譜分析技術(shù)，有效提取病害特征波段，同時還可以應(yīng)用圖像處理技術(shù)提取圖像特征，綜合光譜技術(shù)和圖像技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，可以提供一種更加全面準(zhǔn)確的無損檢測病害的方法。但目前，研究大多是針對農(nóng)作物出現(xiàn)明顯癥狀的發(fā)病期的檢測，對于無明顯癥狀的病害早期的研究相對不多。

本研究結(jié)果表明，高光譜圖像聚集了豐富的光譜信息和圖像信息，但相鄰波段有很強(qiáng)的信息相關(guān)性，存在大量冗余信息，提取特征波段對研究對象進(jìn)行檢測有很重要作用。根據(jù)采集的接種葉片和正常未接種葉片的光譜差異分析，通過相關(guān)性分析及顯著性檢驗(yàn)優(yōu)選出特征波段，基于特征波段構(gòu)建支持向量機(jī)檢測模型，實(shí)現(xiàn)田間環(huán)境下玉米彎孢葉斑病的早期檢測。依據(jù)玉米彎孢葉斑病侵染過程的組織學(xué)觀察研究[27]，提出按時間點(diǎn)采集葉片高光譜信息，從時間維度上監(jiān)測病害發(fā)病過程。通過接種葉片和正常葉片在特征波段的光譜差異，在不同時間點(diǎn)對樣本進(jìn)行測試，在接種葉片表面未有明顯病癥的早期，病葉識別準(zhǔn)確率達(dá)到88．75%。該研究結(jié)果可為玉米彎孢葉斑病早期檢測提供一定的研究基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)玉米彎孢葉斑病快速、無損、自動檢測，為玉米病害的早期檢測提供新的思路。