溫英梅，趙振東，王潔

本研究?jī)r(jià)值：

（1）原發(fā)性肉堿缺乏癥（PCD）的發(fā)病情況存在種族差異，臨床報(bào)道的發(fā)生率各不相同，埃及PCD發(fā)生率約為1∶250 000，美國(guó)PCD發(fā)生率約為1∶142 000，中國(guó)廣西桂中地區(qū)PCD發(fā)生率約為1∶3 090，而海南省黎族人群PCD發(fā)病情況尚未見(jiàn)報(bào)。

（2）本研究采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行新生兒PCD的篩查，發(fā)現(xiàn)海南省黎族新生兒PCD發(fā)生率較高（1/2 295），且基因突變類(lèi)型為c.51C＞G、c.760C＞T、c.338G＞A、c.428C＞T、c.1340A＞T、c.825G＞A、c.4442C＞T、c.1400C＞G，為出生人口篩查豐富數(shù)據(jù)，對(duì)避免黎族出生人口缺陷具有重要意義。

原發(fā)性肉堿缺乏癥（PCD）是一種由SLC22A5基因突變導(dǎo)致脂肪酸β氧化缺陷的常染色體隱性遺傳?。?］，該病存在種族差異［2］，臨床報(bào)道的發(fā)生率各不相同，埃及PCD發(fā)生率約為1∶250 000［3］，美國(guó)PCD發(fā)生率約為1∶142 000［4］，中國(guó)廣西桂中地區(qū)PCD發(fā)生率約為1∶3 090［5］，北大西洋的法羅群島PCD發(fā)生率最高約 1∶30［6］。PCD 是一種潛在致死性疾?。?-8］，通過(guò)補(bǔ)充肉堿做好預(yù)防可以有效避免不良預(yù)后的發(fā)生，因此在新生兒期開(kāi)展PCD篩查尤為必要。目前海南省黎族人群PCD發(fā)病情況尚未見(jiàn)報(bào)道，因此本研究將海南省黎族新生兒PCD篩查及基因分析情況報(bào)道如下，旨在為黎族人群該病的診治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 借助海南省新生兒篩查網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)，收集2016-08-01至2019-07-31在海南省出生的黎族新生兒22 950例，其中男11 968例，女10 982例。均采取知情同意原則，選取自愿參加新生兒多種遺傳代謝病篩查研究，并簽署《海南省新生兒多種遺傳代謝病知情同意書(shū)》的出生3～28 d的新生兒。

1.2 樣本采集及相關(guān)要求 采集新生兒足跟血滴于新生兒篩查樣本采集卡上制成903&濾紙干血片。樣本要求：按照中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（WS 376.3—2013）［9］要求，血斑直徑≥5 mm，血斑數(shù)量3～4個(gè)，均勻滲透。晾干后立即檢測(cè)，不能立即檢測(cè)則密封于封口袋，置于2～8 ℃冰箱保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 儀器：Waters串聯(lián)質(zhì)譜儀（TQD）、艾本森孵育振蕩器（MicBio-Ⅳ型）、混勻器（Vortex Mixer XW-80A）以及自動(dòng)打孔機(jī)（2081Panthera-PuncherTM9）。試劑：非衍生化多種氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮測(cè)定試劑盒（PerkinElmer，Inc.公司提供）。

1.4 方法

1.4.1 試驗(yàn)步驟 嚴(yán)格按照非衍生化多種氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行試驗(yàn)操作，將自動(dòng)打孔機(jī)打下的直徑為3 mm血樣進(jìn)行萃取后，使用串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)樣本中游離肉堿（C0）及酰基肉堿（C2、C3、C16、C18等指標(biāo)）水平。

1.4.2 篩查結(jié)果確認(rèn) 本科室每年參加國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心串聯(lián)質(zhì)譜室間質(zhì)量評(píng)價(jià)活動(dòng)，成績(jī)均合格。室內(nèi)質(zhì)控：每一塊板均做高值、低值兩個(gè)濃度水平檢測(cè)，質(zhì)控值在有效范圍內(nèi)方進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，并送檢測(cè)報(bào)告至遺傳代謝病專(zhuān)科醫(yī)生審核。遺傳代謝病專(zhuān)科醫(yī)生根據(jù)臨床癥狀和專(zhuān)業(yè)知識(shí)進(jìn)行檢測(cè)報(bào)告的臨床解讀、判斷。

1.4.3 PCD的篩查判斷依據(jù) 根據(jù)試劑盒提供的新生兒C0 參考范圍：10.0～48.2 μmol/L，C0＜10.0 μmol/L 視為可疑患兒，為避免母源性影響，需母嬰同時(shí)召回復(fù)查串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，C0仍低者外送血標(biāo)本進(jìn)行SLC22A5基因測(cè)序。PCD基因確診依據(jù)：檢測(cè)到SLC22A5基因突變。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

目前共計(jì)篩查22 950例黎族新生兒，初篩C0減低14例，初篩異常發(fā)生率為1/1 639（14/22 950），其中男7例（1/1 710），女7例（1/1 569）。不同性別黎族新生兒PCD初篩異常發(fā)生率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.026，P=0.872）。母嬰同時(shí)召回14例，經(jīng)復(fù)查后排除4例，10例新生兒及父母雙方重采靜脈血外送進(jìn)行SLC22A5基因測(cè)序。結(jié)果顯示，10例黎族新生兒均確診為PCD，黎族新生兒PCD發(fā)生率為1/2 295（10/22 950），其中7例為雜合突變，3例為純合突變；男5例（1/2 394），女5例（1/2 196）。不同性別黎族新生兒PCD發(fā)生率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.019，P=0.892）。共檢出8種突變類(lèi)型：5例c.51C＞G基因突變、5例c.760C＞T基因突變、2例c.338G＞A基因突變和1例c.428C＞T基因突變、1例c.1340A＞T基因突變、1例c.825G＞A基因突變、1例c.4442C＞T基因突變、1例c.1400C＞G基因突變（見(jiàn)表1、圖1～2）。

3 討論

PCD可于任意年齡發(fā)病，多數(shù)1個(gè)月～7歲發(fā)病，平均在2歲左右；PCD臨床表現(xiàn)差異較大，主要有肌無(wú)力、心室肥厚、心功能不全、肝功能異常、低酮性低血糖、高血氨以及代謝性酸中毒等［10］，而且患兒疾病早期未被發(fā)現(xiàn)可能會(huì)引起生長(zhǎng)發(fā)育遲緩［11］，該病被認(rèn)為是一種潛在致死性疾病，及時(shí)醫(yī)治或有效預(yù)防可以避免發(fā)生危及生命的情況［12］。因此，在新生兒群體中進(jìn)行大規(guī)模PCD篩查，做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是保障生命健康安全和提高人口素質(zhì)的關(guān)鍵。

表1 10例PCD黎族新生兒的基因突變分析Table 1 Analysis of gene mutations in 10 Li neonates with PCD

圖1 串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)PCD患者C0的離子質(zhì)譜圖Figure 1 Tandem mass spectrometry for detecting CO ion in patients with PCD

圖2 基因測(cè)序PCD患兒c.760C＞T基因突變型純合子和c.51C＞G基因突變型雜合子家族測(cè)序圖譜Figure 2 Family sequencing map of homozygous c.760C＞T mutations and heterozygous c.51C＞G mutations

長(zhǎng)鏈脂肪酸β氧化中作為親水分子的肉堿發(fā)揮了重要作用，肉堿（3-hyrdoxy-4-正三甲氨基丁酸）是一種氨基酸化合物，是細(xì)胞代謝所必需的，為氧化磷酸化級(jí)聯(lián)提供了基質(zhì)，主要來(lái)源于肉類(lèi)和奶制品等飲食，99.5%的全身肉堿在細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存，0.5%作為C0在血漿中循環(huán)。肉堿會(huì)結(jié)合酰基殘基進(jìn)行脂肪酸代謝。該機(jī)制對(duì)于代謝或者去除異常有機(jī)酸具有重要意義，因此解釋了異常有機(jī)酸的蓄積導(dǎo)致肉毒堿缺乏癥的原因。串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)根據(jù)離子間質(zhì)荷比不同區(qū)分不同的肉毒堿，由于肉毒堿與不同?；鶜埢g結(jié)合會(huì)產(chǎn)生不同?；鈮A，因此C0水平是診斷 PCD 的依據(jù)，也是判斷臨床治療PCD療效的重要指標(biāo)［13］。串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)可以精細(xì)區(qū)分每種?；鈮A水平，根據(jù)代謝理論判斷標(biāo)識(shí)性?；鈮A代謝，從而達(dá)到診斷像PCD等脂肪酸代謝障礙的遺傳代謝性疾病。目前國(guó)內(nèi)對(duì)PCD的報(bào)道十分有限，鑒于該病具有種族差異性，海南省本就屬貧困偏遠(yuǎn)地區(qū)，而黎族人群居住區(qū)域又屬于困中之困，在目前全國(guó)大力發(fā)展精準(zhǔn)扶貧的前提下，在海南省選擇黎族人群開(kāi)展新生兒PCD篩查和診斷，有利于黎族同胞的生命安全和為臨床診治PCD提供診斷依據(jù)，在新生兒期進(jìn)行篩查又能防止因病致貧，進(jìn)而起到醫(yī)療精準(zhǔn)扶貧的作用。

本次調(diào)查結(jié)果顯示，海南省黎族新生兒PCD的發(fā)生率較高，為1/2 295。關(guān)于PCD的發(fā)生率，國(guó)內(nèi)青島［14］、徐州［15］和廣西桂中地區(qū)［5］也見(jiàn)部分報(bào)道，發(fā)生率為1∶55 636～1∶3 090，從本次調(diào)查可以看出海南省黎族新生兒PCD發(fā)生率（1/2 295）為最高。從性別角度統(tǒng)計(jì)PCD發(fā)生率和初篩異常情況，均未見(jiàn)有性別差異，這符合常染色體遺傳規(guī)律。PCD的致病基因已被證實(shí)為SLC22A5，定位在染色體5q31.1，有10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子［16］，目前已發(fā)現(xiàn)至少存在183種突變，大多數(shù)突變集中于外顯子1、4、8，占所有突變的77.6%，其中c.1400C＞G（p.S467C）、c.760C＞T（p.R254X）、c.51C＞G（p.F17L）突變是新生兒PCD最常見(jiàn)的基因突變位點(diǎn)［17］。本次在10例PCD黎族新生兒中檢出8種基因突變：5例c.51C＞G基因突變、5例c.760C＞T基因突變、2例c.338G＞A基因突變和c.428C＞T、c.1340A＞T、c.825G＞A、c.4442C＞T、c.1400C＞G基因突變各1例。從本次所檢出的突變位點(diǎn)來(lái)看，c.51C＞G基因突變和c.760C＞T基因突變占主要比例，這符合中國(guó)人群PCD常見(jiàn)突變位點(diǎn)［18］。本次收集的22 950例黎族新生兒PCD篩查結(jié)果證實(shí)了黎族新生兒中PCD患兒基因突變位點(diǎn)與漢族人群相似，用較大樣本量數(shù)據(jù)否定了趙振東等［19］對(duì)黎族PCD患兒突變位點(diǎn)的推斷，筆者認(rèn)為隨著樣本量的不斷擴(kuò)大所得到的PCD發(fā)生率與基因突變位點(diǎn)才能更準(zhǔn)確地代表黎族人群的數(shù)據(jù)，但仍有待不斷累計(jì)大樣本數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明。c.338G＞A基因突變是一種極為少見(jiàn)的PCD基因突變類(lèi)型，目前報(bào)道很少［20］。該位點(diǎn)在保留了部分肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)活性的前提下影響了肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（OCTN2）的糖基化和成熟作用，經(jīng)多次隨訪，患者家屬表示至今未出現(xiàn)任何臨床癥狀。海南省地處祖國(guó)最南端，因海峽隔阻，交通不便，特別是受當(dāng)?shù)仫L(fēng)俗和經(jīng)濟(jì)限制，黎族人群相對(duì)封閉，族內(nèi)通婚多見(jiàn)，由此推測(cè)這可能增加了遺傳性代謝病的發(fā)生概率。原衛(wèi)生部2009年頒發(fā)實(shí)施的《新生兒篩查管理辦法》規(guī)定新生兒疾病篩查只有苯丙酮尿癥（PKU）和先天性甲狀腺功能低下癥（CH）兩個(gè)病種，筆者認(rèn)為從目前海南省黎族人群PCD發(fā)生率來(lái)看，在海南省其遠(yuǎn)高于以上兩個(gè)病種的發(fā)生率的前提下［21-22］，應(yīng)該在海南省黎族人群中開(kāi)展大規(guī)模PCD篩查，以提高海南省黎族出生人口素質(zhì)和質(zhì)量。

誠(chéng)然，本研究也存在部分局限性，比如新生兒黎族身份的確定，本研究是借助海南省新生兒篩查網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)通過(guò)新生兒母親的民族來(lái)確定新生兒的黎族身份，因查詢不到新生兒父親的民族情況，且黎族與其他民族通婚的情況是存在的，所以存在患兒種族身份也可能是其他民族的情況。此外，本研究只有22 950例樣本，尚不能算作一個(gè)大樣本的數(shù)據(jù)分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果可能存在偏差。

綜上所述，海南省黎族新生兒PCD發(fā)生率較高，基因突變類(lèi)型較為豐富，因此應(yīng)在黎族人群進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜PCD篩查，做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，對(duì)避免黎族出生人口缺陷具有重要意義。

作者貢獻(xiàn)：溫英梅負(fù)責(zé)文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，撰寫(xiě)論文，進(jìn)行結(jié)果分析與解釋?zhuān)簻赜⒚贰⑼鯘嵾M(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析，文章的質(zhì)量控制及審校，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)并監(jiān)督管理；溫英梅、趙振東負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)收集、整理，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，論文修訂。

本文無(wú)利益沖突。